Bepaling en isolatie van nieuw gegenereerd product

Ioniserende straling werd toegepast zoals eerder beschreven. Een monsteroplossing die pure minaprine (400 mg) in methanol (400 ml) bevatte, werd direct bestraald met gammastralen en het transformatiepatroon werd geanalyseerd met behulp van een HPLC-apparaat met omgekeerde fasen. Na bestraling met een dosis van 30 kGy, minaprine (1) was bijna verminderd en de nieuw gegenereerde piek bij a t_R 6.2 min kwam overeen met een conversieratio van 95% (Fig. 1A,B). De reactanten bestraald met een dosis van 30 kGy vertoonden verbeterde remmende effecten op NO-productie in door lipopolysaccharide (LPS) gestimuleerde RAW 264.7- en DH82-macrofagen in vergelijking met pure minaprine (Fig. 1CD). Herhaalde kolomchromatografische scheiding van de met 30 kGy bestraalde reactanten leidde tot de isolatie en zuivering van het nieuwe hydropyridzinederivaat 2. Het nieuwe gehydroxyalkyleerde product 2 bleek zeldzame functionele groepen te bevatten met een stikstofgroep aan het aminopyridazine van minaprine (Fig. 2EEN).

Effecten van radiolytische transformatie van minaprine. (A, B) HPLC-chromatogrammen van (A) pure minaprine en (B) bestraalde reactant bij 30 kGy. (C, D): GEEN productie van minaprine en bestraalde minaprine (IR-minaprine) in (C) RUW 264.7 en (D) DH82-macrofaagcellen werden geanalyseerd met een Griess-reagensassay. De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD (n = 3). *p <0.05; **p <0.01; vs. LPS-behandelde groep. 1: minaprine, 2: minaprinol.

Afbeelding op volledige grootte

Structuren van nieuw afgebroken product 2 van minaprine (A) en de belangrijkste HMBC- en COSY-correlaties van 2 (B).

Afbeelding op volledige grootte

Samenstelling 2 werd gezuiverd als een geelachtige olie en de absorptiemaxima bij 219 en 284 nm in het UV-spectrum suggereerden de aanwezigheid van een hydropyridazine-skelet¹⁷. De HRESIMS onthulden een pseudomoelculaire ionenpiek bij m / z 331.2126 [M+H]⁺ overeenkomend met de molecuulformule C₁₈H₂₇N₄O₂. De ¹H NMR-spectrum (600 MHz) van 2 op CD₃OD vertoonde één benzeenringresonantiesignalen bij δ_H 7.90 (2H, dd, J = 8.4, 1.8 Hz, H-2', 6'), 7.51 (1H, dd, J = 8.4, 1.8 Hz, H-4′), en 7.49 (2H, t, J = 8.4 Hz, H-3', 5'), 6 methyleenprotonsignalen op δ_H 3.73 (4H, t, J = 4.2 Hz, H-6″, 7″), 3.61 (2H, t, J = 5.4 Hz, H-2″), 2.77 (2H, t, J = 5.4 Hz, H-3″) en 2.60 (4H, br s, H-5″, 8″), wat de aanwezigheid suggereerde van de ene benzeen- en alkylmorfolinegroepen¹⁸. Eén singlet-methylgroep op δ_H 1.36 (3H, s, H-8) en methyleenprotonen op δ_H 2.94 (1H, dag, J = 17.4 Hz, H-4a) en 2.88 (1H, d, J = 17.4 Hz, H-4b) waargenomen. Bovendien onthulden de 1D NMR- en HSQC-spectra de aanwezigheid van een hydroxymethylsubstituent op δ_H 3.80 (1H, dag, J = 11.4 Hz, H-7a) en 3.71 (1H, d, J = 11.4 Hz, H-7b) (Tabel 1).

Achttien koolstofsignalen waargenomen in de ¹³C NMR- en HSQC-spectra kunnen worden geclassificeerd als 9 sp² koolstofatomen (toegewezen aan één aromatische ring en drie olefinen), 8 methyleenkoolstofatomen at δ_C 67.9 (C-6″, 7″), 67.1 (C-7), 56.6 (C-3″), 54.1 (C-5″, 8″), 41.6 (C-2″) en 30.8 (C- 4), en één methylsignaal op δ_C 19.9 (C-8) (Tabel 1). De bovenstaande gegevens zijn indicatief voor een ongebruikelijk hydropyridazine met hydroxymethylgroepen (Fig. 2A). De structuur van 2 werd verder bevestigd door HMBC. De HMBC-relaties van H-4 tot C-3, -5 en -6, van H-8 tot C-4 en -6, van H-1 ′ tot C-3 en van H-2 ″ tot C- 6 bevestigde dat 2 heeft een aminopyridazine-ruggengraat. De kruispieken bij H-4, -8 en -2″ tot C-6 bevestigden dat 2 is een 3-benznyl-8-methyl-6-aminopyridazine met morfoline op C-6. De hydroxymethylfunctionaliteiten bevonden zich op de stikstofpositie van de gehydrateerde aminopyridazine-eenheid, zoals ondersteund door de belangrijkste HMBC-correlatie tussen H-7 en C-6 (Fig. 2B). Aldus de structuur van het ongebruikelijke hydroaminopyridazine 2 werd volledig toegewezen als minaprinol, wat een nieuw transformatieproduct is, zoals getoond in Fig. 2A.

Radiolyse van methanolische omstandigheden in aanwezigheid van een atmosfeer produceert verschillende vrije radicalen, zoals hydroxymethyl (^·CH₂OH), hydroxyl (^•OH), methoxy (CH₃O^·), en peroxyl (HOO^·), die vervolgens groene synthese zijn van nieuwe kandidaat-geneesmiddelen^19,20. Onze resultaten suggereren dat de hydroxymethyl (^·CH₂OH) radicaal kan ook betrokken zijn bij de modificatie van verbindingen 2 wanneer minaprine wordt blootgesteld aan ioniserende straling in methanoloplossing. Dit is het eerste voorbeeld van de nieuwe radiolytische hydroxymethylering van de amionpyridazinegeneesmiddelen.

Remmende effecten van ontstekingsremmers in LPS-gestimuleerde macrofaagcellen

De plannerstructuur gekenmerkt voor samengesteld 2 werd geëvalueerd om de ontstekingsremmende activiteit in zowel RAW 264.7- als DH82-macrofaagcellen te bepalen. Behandeling met verbindingen 1 en 2 had geen invloed op de levensvatbaarheid van RAW 264.7- en DH82-cellen bij 5% of minder (tot 200 μM) (Fig. 3A en 4A). We evalueerden de ontstekingsremmende effecten van het nieuwe hydropyridazinederivaat minaprinol (2) door de productie van pro-inflammatoire mediatoren te detecteren, waaronder NO en PGE₂ in LPS-gestimuleerde RAW 264.7 en DH82 macrofagen (Fig. 3 en 4).

Effecten van het aminopyridazine-product op ontstekingsremmende activiteiten in LPS-gestimuleerde RAW 264.7 macrofaagcellen. (A) Detectie van de levensvatbaarheid van cellen door MTT-assay in RAW 264.7-cellen na behandeling met monsters gedurende 24 uur. De cellen werden gedurende 2 uur behandeld met monsters, gevolgd door behandeling met de LPS (0.1 μg/ml) gedurende 24 uur. (B) Het nitrietgehalte van kweekmedia werd geanalyseerd met een Griess-reagensassay. (C) De PGE₂ productie-inhoud van kweekmedia werd geanalyseerd door ELISA. (D, E, F) Expressie van COX-2 (E) en iNOS (F) geïnduceerd door monsterbehandeling van beide RAW 264.7 macrofaagcellen gedurende 24 uur. (G, H, I) Cytokineproducties (G: TNF-α, H:IL-6, I: IL-10) van kweekmedia werd gemeten met ELISA. (J, K) De iNOS (J) en Arg-1 (K) mRNA-expressie werd bepaald door qPCR-analyse. De relatieve expressie van elk gen werd gekwantificeerd met behulp van het expressieniveau van GAPDH-mRNA. De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD (n = 3). *p <0.05; **p <0.01; vs. LPS-behandelde groep. 1: minaprine, 2: minaprinol.

Afbeelding op volledige grootte

Effecten van het aminopyridazine-product op ontstekingsremmende activiteiten in door LPS gestimuleerde DH82-macrofaagcellen. (A) Detectie van de levensvatbaarheid van cellen door MTT-assay in DH82-cellen na behandeling met monsters gedurende 24 uur. De cellen werden gedurende 2 uur met monsters behandeld, gevolgd door behandeling met de LPS (1 μg/ml) gedurende 24 uur. (B) Het nitrietgehalte van kweekmedia werd geanalyseerd met een Griess-reagensassay. (C) De PGE₂ productie-inhoud van kweekmedia werd geanalyseerd door ELISA. (D, E, F) Expressie van COX-2 (E) en iNOS (F) geïnduceerd door monsterbehandeling van beide DH82-macrofaagcellen gedurende 24 uur. (G, H, I) Cytokineproducties (G: TNF-α, H:IL-6, I: IL-10) van kweekmedia werd gemeten met ELISA. De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD (n = 3). *p <0.05; **p <0.01; vs. LPS-behandelde groep. 1: minaprine, 2: minaprinol.

Afbeelding op volledige grootte

Minaprinol (2) bezit hydroxymethylfunctionaliteit en vertoonde bij concentraties van 200 μM krachtige versterkte remmende activiteiten tegen NO en PGE₂ productie in LPS-gestimuleerde RAW 264.7-cellen, met reducties van respectievelijk ongeveer 10.6 μM en 490.4 pg/mL ten opzichte van de oorspronkelijke minaprine (Fig. 3B, C). In DH82-cellen, significante onderdrukking van NO en PGE₂ werd waargenomen (afb. 4B, C). Tijdens ontsteking bevorderen de enzymen COX-2 en iNOS de secretie van pro-inflammatoire mediatoren²¹. Dus, 2 werd onderzocht door western blot-analyse om te bepalen of het COX-2 en iNOS remde in door LPS geïnduceerde macrofaagcellen. Zoals getoond in Fig. 3D en 4D, samengesteld 2 onderdrukte LPS-geïnduceerde COX-2- en iNOS-eiwitexpressie op een dosisafhankelijke manier, resulterend in de remming van pro-inflammatoire mediatorproductie, zoals NO en PGE₂.

Veranderingen in de secretie van pro-inflammatoire cytokines, waaronder TNF-α en IL-6, en ontstekingsremmende cytokines, zoals IL-10, door LPS-gestimuleerde macrofagen werden bepaald. Figuur 3G-I geeft de remmende effecten van het nieuw gegenereerde product weer 2 van bestraalde minaprine op de secretie van inflammatoire cytokines TNF-α, IL-6 en IL-10 door LPS-gestimuleerde RAW 264.7-cellen (Fig. 3). Minaprinol (2) vertoonde ook een verhoogde remming van pro- en anti-inflammatoire cytokineproductie in vergelijking met minaprine (1) in DH82-cellen van honden (Fig. 4G–I). De nieuw gegenereerde kandidaat 2 had geen invloed op de mRNA-expressieniveaus van iNOS en Arg-1 in RAW 264.7 macrofaag, wat suggereerde dat het niet betrokken was bij macrofaagpolarisatie (Fig. 3J, K). Interessant is dat de hydroxymethylering van aminopyridazine geïnduceerd door ioniserende straling de ontstekingsremmende eigenschappen van door LPS gestimuleerde macrofagen verbeterde. In een recent onderzoek vertoonden chrysine en luteoline verbeterde ontstekingsremmende activiteiten in vitro en in vivo geïnduceerd door γ-bestraling, en de chemische structuur van hydroxyalkyl-gesubstitueerde verbindingen werd geïdentificeerd^12,21. Bovendien vertoonde radiolytische transformatie van alkaloïden en steroïden krachtige verbeterde antikankereffecten bij melanoom-, borst-, lever- en longkanker^{11,22,23,24,25}.

Kleurverandering en modificatie van ontstekingsremmende middelen uit minaprine door radiolyse

De effecten van ioniserende bestraling op de kleurveranderingen en modificatie van een nieuwe verbinding veroorzaakt door hydroxymethylering van minaprine, het meest voorkomende type hydroaminopyridazine, werden onderzocht. De witte kleur van minaprine werd geleidelijk op een dosisafhankelijke manier verminderd en werd effectief getransformeerd bij een dosis van 30 kGy gammastraling (fig. 5EEN).

Verandering van fysisch-chemische eigenschappen van minaprine door gammastraling. (A) De kleurveranderingen in methanolische omstandigheden van minaprine na gammabestraling werden visueel gecontroleerd. (B) Nieuw gegenereerd minaprinol (2) van minaprine (1) getransformeerd door gammastraling werden geanalyseerd met HPLC bij 280 nm. (C) Verandering van UV-absorptie (λ_max) van minaprine getransformeerd door dosis gammastraling.

Afbeelding op volledige grootte

De inhoud van de geïsoleerde verbinding uit het bestraalde mianprine van 5, 10, 20, 30 en 40 kGy werd gekwantificeerd met behulp van de externe standaardmethode en de resultaten worden getoond in Fig. 5B. Vijf concentratiepunten (n = 5) werden gebruikt voor de voorbereiding van de ijkkromme en de ijkkromme van zuivere oplossingen van de standaardverbindingen was volledig lineair (R² > 0.999). De retentietijden van nieuw gevormd minaprinol (2, t_R 6.3 min) en minaprine (1, t_R 8.2 min) werden gedetecteerd voor vijf bestraalde reactanten. Kwantitatieve analyse onthulde dat de absolute inhoud van de krachtigste minaprinol (2) in de bestraalde monsters bij 5, 10, 20, 30 en 40 kGy waren respectievelijk 98.6 ± 0.6, 202.7 ± 1.5, 554.6 ± 1.6, 912.0 ± 2.0 en 886.0 ± 2.0 mg/g, hetgeen in overeenstemming is met verbetering van het ontstekingsremmende vermogen in macrofaagcellen van elk monster. Vermindering van minaprine daarentegen (1) inhoud werd waargenomen door ioniserende bestraling.

De chemische eigenschappen van het gemodificeerde minaprine werden gecontroleerd door UV-spectrometrie (Fig. 5C). De absorptie bij 280 nm werd toegeschreven aan de pyridazinebindingen van minaprine (1). Daarentegen 30 kGy-bestraalde monsters en verminderde absorptie bij 280 nm in vergelijking met die van controle (0 kGy), wat een grotere transformatie naar dihydropyridazine-ruggengraat suggereerde. Deze resultaten suggereren dat het gehalte aan minaprinol (2) verhoogde de dosis ioniserende straling tot 30 kGy als het belangrijkste product van minaprine. Onze resultaten geven aan dat hydroxymethylering geïnduceerd door de toepassing van ioniserende straling op minaprine gunstig kan zijn bij het onderdrukken van het ontstaan ​​van overmatige ontsteking in macrofaagcellen van gezelschapsdieren.

• Door SEO aangedreven content en PR-distributie. Word vandaag nog versterkt.
• PlatoData.Network Verticale generatieve AI. Versterk jezelf. Toegang hier.
• PlatoAiStream. Web3-intelligentie. Kennis versterkt. Toegang hier.
• PlatoESG. Automotive / EV's, carbon, CleanTech, Energie, Milieu, Zonne, Afvalbeheer. Toegang hier.
• BlockOffsets. Eigendom voor milieucompensatie moderniseren. Toegang hier.
• Bron: https://www.nature.com/articles/s41598-023-37812-8