Cel lijnen

Menselijke en muizenblaaskankercellen SV-HUC-1, RT4, UM-UC-3, T24, 5637, MB49 werden verkregen en gekweekt zoals eerder beschreven [44]. Voor het induceren van de cisplatine-resistente T24-, UMUC-3- en MB49-cellen werden de cellen gekweekt in cisplatine-bevattend medium waarbij de cisplatineconcentratie toenam van 1 μM tot 25 μM gedurende 10 maanden.

Weefselmicroarray en patiëntmonsters

De Huashan-cohortweefselmicroarray bestaat uit 90 paren normale en kwaadaardige weefsels die tussen 2007-01 en 2013-01 een radicale cystectomie met blaaskanker hebben ondergaan, met een follow-up van vijf jaar.44].

De weefselmicroarray die in dit onderzoek werd gebruikt, was afkomstig van 90 gevallen van blaaskanker die van januari 2007 tot januari 2013 in ons centrum een ​​radicale cystectomie ondergingen. De inclusie- en exclusiecriteria zijn als volgt:

1. 1.

   Inclusiecriteria:

1. a.

   In ons centrum werd radicale cystectomie uitgevoerd en er zijn volledige pathologische monsters beschikbaar. Het pathologische monster werd door twee pathologen bevestigd als blaaskanker. Het monster bevat tumoren en normale weefsels.

2. b.

   Leeftijd: 18-80 jaar oud

1. 2.

   Uitsluitingscriteria:

1. a.

   De klinische informatie van de patiënt is onvolledig.

2. b.

   De kwaliteit van pathologische monsters is ongekwalificeerd.

3. c.

   Een voorgeschiedenis heeft van blaasperfusietherapie binnen 3 maanden vóór de operatie of adjuvante chemotherapie/bestralingstherapie heeft binnen 6 maanden vóór de operatie.

Er werd schriftelijke toestemming verkregen van patiënten en goedgekeurd door de ethische commissie van het Huashan-ziekenhuis (goedkeuringsnummer KY2011-009, 2022-100). Patiëntmonsters voor circRNA-sequencing en expressieanalyse werden ook volgens dezelfde procedure verzameld.

Metabolomics-analyse

T24/T24-CR-cellen en T24-CR-LV-NC/T24-CR-LV-circARHGAP10OE-cellen werden gebruikt voor metabolomics-analyse. Medium werd weggegooid nadat confluentie was bereikt, en de cellen werden driemaal met PBS gewassen. Cellen werden geschraapt in 3 ml gekoelde methanol en gelyseerd om metabolieten te extraheren zoals eerder beschreven [44].

Proteomics-analyse

20 µg geëxtraheerd eiwit werd gescheiden via SDS-PAGE. Eiwit werd gedigereerd met trypsine en LC-MS/MS werd uitgevoerd met een timsTOF-Pro-spectrometrie gekoppeld aan Nanoelute (Bruker). Ruwe eiwitgegevens werden doorzocht met MaxQuant 1.6.14-software voor kwantificeringsanalyse. Na annotatiestappen werden de eiwitten gestraald om hun KEGG-identificaties op te halen. Metabolomics- en proteomics-analyse en de geïntegreerde multi-omics-analyse van dit werk werden voltooid in Applied Protein Technology, Shanghai, China.

RNA-seq

RNA werd geëxtraheerd uit vijf paar goedaardige en kwaadaardige blaasweefsels met TRIzol (Invitrogen, VS). Er werd 3 mg totaal RNA geëxtraheerd en voor verdere sequencing zoals eerder beschreven [41].

RNA FISH en immunofluorescentie

Sondes gericht op de verbindingsplaats van circARHGAP10 werden gesynthetiseerd (GenePharma Biotech, Guangzhou, China). IF- en gefotografeerde procedure werden uitgevoerd zoals eerder beschreven [41]. Alle cellen werden gefixeerd en gelabeld met DAPI en de cellen werden gefotografeerd met de LSM700 confocale microscoop (Carl Zeiss, Oberkochen).

RNase R-behandeling

Totaal RNA werd geëxtraheerd en behandeld met RNase R (Epicenter Technologies, VS). De stabiliteit van circRNA en lineair mRNA werd geanalyseerd via qRT-PCR [44].

Actinomycine D-testen

2 mg/ml actinomycine D (Sigma) werd aan de cellen toegevoegd en de BCa-cellen werden op de aangegeven tijdstippen verzameld voor verdere analyse zoals eerder beschreven [41, 44].

qRT-PCR

RNA werd geëxtraheerd en cDNA werd verkregen door gebruik te maken van de PrimeScriptTMRT Reagent Kit (TaKaRa, Japan) om qRT-PCR uit te voeren op een ABI 7900HT-machine (Thermo Fisher Scientific, VS). 2-ΔΔCT werd gebruikt om RNA-expressies te analyseren [44].

Vectorconstructie en celtransfectie

shRNAs-sequenties werden ontworpen om circRNAs te richten, MAT2A, TRIM25 of SLC7A6 werden gekloneerd en ingevoegd in pGPU6/GFP/puromycine-vector. circRNA-sequentie werd gekloneerd en ingevoegd in een plenti-ciR-GFP-T2A-vector van IGEbio (Guangzhou, China) om circRNA-overexpressieplasmide te construeren. Om MAT2A of SLC7A6 tot overexpressie te brengen, werd de vector pENTER met identiek gen of controle verkregen van Vigene (Shanghai, China). Flag-TRIM25, Flag-Trim25ΔRBD, Myc-MAT2A, HA-Ub en het K6-, K11-, K27-, K48- en K63-mutante plasmide werden gekocht bij Vigene (Shanghai, China). De siRNA's werden gekocht bij GenePharma (Shanghai, China). De celtransfectie werd beschreven als ons vorige werk [43].

Bolvormingstest

BCa-cellen werden gedigereerd en gesuspendeerd als afzonderlijke cellen in de ultra-lage bevestigingsplaten met 6 putjes, aangevuld met 5 ng / ml recombinant EGF (Sangon, China). De bolvorming werd 12 dagen later waargenomen.

Celproliferatietest

In de CCK-8-test werden de cellen gedigereerd en met 1,500 cellen per putje in een plaat met 96 putjes uitgezaaid. We hebben de OD450-waarde op verschillende tijdstippen na het zaaien in de putten gedetecteerd. Voor de IC50-test werden de cellen geïncubeerd met cisplatine en werd de relatieve levensvatbaarheid berekend in Graphpad Prism 8 om de IC50-waarde te berekenen. Voor de kolonievormingstest werden de cellen gedigereerd en in een plaat met 6 putjes gezaaid en gedurende 14 dagen geïncubeerd. Van de kolonies werd een beeld gemaakt nadat ze waren gekleurd met 0.2% kristalviolet.

Apoptose en EdU-test

Apoptosetest werd uitgevoerd met de apoptosekit (MultiSciences, China) zoals ons vorige werk [41]. EdU-test werd uitgevoerd met EdU-kit (RiboBio, China) om DNA-synthese te detecteren [44].

Transwell-testen

Cellen werden gekleurd met 0.2% kristalviolet in een Transwell-kamer (CoStar, VS). Vijf willekeurig geselecteerde celsecties werden geanalyseerd voor het genereren van statistische analyses.

Moleculaire koppeling

We gebruikten Autodock Vina 1.2.2 om de bindingsaffiniteiten tussen eiwitten te analyseren. De 3D-coördinaten van de eiwitten zijn gedownload van het VOB (http://rcsb.org/PDB). Moleculair koppelen werd gevisualiseerd en uitgevoerd met AutodockVina 1.2.2 (http://autodock.scripps. onderwijs).

Co-immunoprecipitatie

Voor co-IP-experimenten werden relatieve cellen gelyseerd en gekoeld aangevuld met een combinatie van proteïnase- en fosfataseremmers, met of zonder RNase-remmer. Het supernatant werd geïncubeerd met conjunctieve antilichaamkorrels of met vooraf geïncubeerde antilichaamkorrels. De kralen werden gewassen en gecentrifugeerd met co-IP-buffer voor verdere Western-blot-analyse.53].

RNA pull-down-test en RIP-test

Streptavidine-kralen (Life Technologies, VS) werden behandeld met biotine-gelabelde circARHGAP10-sondes met oligo-sondes om RNA-pull-down-assay uit te voeren. De magnetische RIP-kit (Millipore) werd gebruikt om de RIP-test uit te voeren volgens de instructies van de fabrikant, beschreven als ons vorige werk [43].

Western blot-analyse

Eiwit werd uit cellen gelyseerd met RIPA-buffer en gescheiden met SDS-PAGE. De blots werden geblokkeerd en overnacht met antilichamen geïncubeerd. Antilichaam: GLDC (Abcam, ab232989), SHMT2 (Abcam, ab180786), MAT2A (Proteintech, 55309-1-AP), MTHFR (Abcam, ab203786), SAHH (Abcam, ab151734), CD44 (Abcam, ab243894), Nanog ( Abcam, ab109250), H3 (Abcam, ab1791), H3K4me3 (Abcam, ab213224), H3K9me3 (Abcam, ab8898), H3K27me3 (abcam, ab6002), H3K36me2 (Abcam, ab176921) en H3K36me3 (Abcam, ab9050 ), H3K79me2 ( Abcam, ab3594) en H3K79me3 (Abcam, ab2621), Flag/DDDDK-tag (Abcam, ab205606), Myc-tag (Abcam, ab32), HA-tag (Abcam, ab9110), TRIM25 (Abcam, ab167154), USP5 (Abcam, ab154170), USP14 (Abcam, ab192618), p-STAT5 (Abcam, ab32364), STAT5 (Abcam, ab230670), SLC7A6 (Abcam, ab235054), GAPDH (Proteintech, 60004-1-lg) werd gebruikt als laadcontrole. De signalen werden gevisualiseerd met behulp van een ECL-beeldvormingssysteem (CLiNX, Shanghai) zoals eerder beschreven [44].

Verbindingen en reagentia

De verbindingen of enzymen die in dit werk worden gebruikt zijn als volgt: cisplatine (Selleck, VS), FIDAS (Selleck, VS), MeAIB (Selleck, VS), BCH (Selleck, VS), RNase A (Yeason, China), SAM ( Sigma, VS), SAH (Sigma, VS) en HCY (Sigma, VS). Medium zonder bepaalde aminozuren werd gekocht bij US Biological, VS. Aminozuren werden gekocht bij Sangon, China.

In vitro bereiding en activering van CD8+ T-cellen

Kort nadat de dieren waren opgeofferd, werden verse tumormonsters verkregen. Tumoren werden fijngehakt en verteerd met een combinatie van collagenase I (Sangon, China) en DNase I (Sangon, China). PBMC's waren afkomstig van patiënten met Ficoll (GE Healthcare, VS). De cellen werden gestimuleerd, gekleurd met membraanmarkers en voor verdere analyse op een MACS-kolom aangebracht.

Flowcytometrie

Er werden CD8+ T-cellen verzameld uit perifeer bloed of kankerweefsel. De eencellige suspensies van CD8+ T-cellen werden gekleurd met oppervlaktemarkers met CD45 (BD Biosciences, 557833), CD3 (BD ​​Biosciences, 552852), CD8 (BD Biosciences, 564526) en PD-1 (BD Biosciences, 561272) [44]. BD Cytofifix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD Biosciences) werd gebruikt om intracellulaire markers te kleuren, waaronder IFN-g (BD Biosciences, 557643), GZMB (BD Biosciences, 560212) en IL-2 (BD Biosciences, 554566). CD8+ T-cellen werden geanalyseerd op de BD FACS Verse Flow Cytometer zoals we eerder beschreven [44].

Dierstudie

Voor het subcutane T24-CR-celxenotransplantaatmodel werden 4 weken oude naakte mannelijke athymische BALB / c-muizen (SLARC, Shanghai, China) in een specifieke pathogeenvrije kweekomgeving gehouden. De controle- en methioninebeperkingsdiëten werden gekocht bij Xietong (Jiangsu, China), waarbij het controledieet 0.86% methioninevoeding bevatte en het MR-dieet 0.12% methioninevoeding bevatte in onze studie [30]. De muizen werden willekeurig in vier groepen geselecteerd. In totaal 1×10⁷ T24-CR-luc-LV-NC- of T24-CR-luc-LV-circ-cellen werden subcutaan geïnjecteerd in naakte muizen die werden gevoed met controle- of MR-diëten. Cisplatine (6 mg/kg) werd één week na de celimplantatie intraperitoneaal geïnjecteerd (één injectie voor elke 5 dagen). Het tumorvolume werd elke 3 dagen gevolgd met de berekening van tumorvolume = breedte² × lengte/2. Alle muizen werden na 6 weken geneesmiddelbehandeling opgeofferd. De extreem beperkende verdunningsanalyse werd uitgevoerd met 5 x 10⁶, 5 × 10⁵ en 5 × 10⁴ T24-CR-cellen worden subcutaan geïnjecteerd in de naakte muizen om de succesvolle snelheid van de tumorimplantatie te berekenen.

Voor de van de patiënt afkomstige xenograft (PDX) -modellen werden twee verse weefselfragmenten van BCa-patiënten subcutaan getransplanteerd in 4 weken oude NOD / SCID-muizen (SLARC, Shanghai, China). Wanneer de 1^st De generatie van de xenotransplantaten bereikte ongeveer 100 mm³werd het PDX-weefselblok geïsoleerd en mechanisch opgelost in 1 mm³ weefselblokken voor subcutane implantatie in NOD/SCID-muizen voor de tweede PDX-generatie. De tweede PDX-generatie werd willekeurig in vier groepen verdeeld. De PDX-xenotransplantaten werden geïnjecteerd met 2 nmol in vivo-kwaliteit cholesterol-geconjugeerd si-NC of si-circARHGAP2 (RiboBio, Guangzhou, China) gevoed met controle- of MR-diëten. Cisplatine (5 mg/kg) werd één week na de celimplantatie intraperitoneaal geïnjecteerd (één injectie voor elke 5 dagen). Het tumorvolume werd elke 6 dagen gevolgd met de berekening van tumorvolume = (breedte² × lengte/2). Alle muizen werden na 6 weken tweede PDX-implantatie opgeofferd.

Voor het longmetastasemodel van de T24-CR-cel, 1 × 10⁵ T24-CR-luc-LV-NC- of T24-CR-luc-LV-circ-cellen werden intraveneus geïnjecteerd in de staarten van 4 weken oude naakte mannelijke athymische BALB / c-muizen (SLARC, Shanghai, China) gevoed met controle of MR-diëten. Cisplatine (6 mg/kg) werd één week na de celinjectie intraperitoneaal geïnjecteerd (één injectie voor elke 5 dagen). Na 30 dagen werd de metastase van de tumorontwikkeling gevolgd via IVIS na intraperitoneale injectie van 200 mg/kg luciferine.

Voor het subcutane MB49-CR-celxenotransplantaat, 4 weken oude mannelijke C57BL / 6-muizen (SLARC, Shanghai, China). In totaal 1×10⁷ MB49-CR-LV-NC- of MB49-CR-LV-circ-cellen werden subcutaan geïnjecteerd in muizen die werden gevoed met controle- of MR-diëten. Anti-PD-L1 en IgG1 (Bioxcell) (100 μg/muis) werden één week na celimplantatie intraperitoneaal geïnjecteerd (één injectie voor elke 3 dagen). BCH (180 mg/kg) werd één week na celimplantatie intraveneus geïnjecteerd (één injectie voor elke 3 dagen). Cisplatine (6 mg/kg) werd één week na de celimplantatie intraperitoneaal geïnjecteerd (één injectie voor elke 5 dagen). Het tumorvolume werd elke 3 dagen gevolgd met de berekening van tumorvolume = (breedte² × lengte/2). Alle muizen werden na 6 weken geneesmiddelbehandeling opgeofferd. Alle dierproeven, inclusief in deze studie, zijn goedgekeurd met het goedkeuringsnummer 202212002 S.

IHC

Tumorweefselmonsters en leverweefsel van muizen werden ingebed in paraffine terwijl IHC- en H&E-kleuring werd uitgevoerd [44, 54]. De primaire antilichamen waren Ki-67 (Abcam, ab270650), MAT2A (Proteintech, 55309-1-AP), SLC7A6 (Abcam, ab235054), CD44 (Abcam, ab243894) en CD8A (Abcam, ab217344).

statistische analyse

De statistische analyse werd geanalyseerd met Student's t-test of de Chi-kwadraattest in Graphpad Prism 8 [55]. Voor de algehele overlevingsanalyse werd de KM-curve toegepast [56, 57]. Dat hebben wij bepaald p < 0.05 was statistisch significant.

Rapportage samenvatting

Nadere informatie over onderzoeksontwerp is beschikbaar in de Nature Research Reporting Summary gekoppeld aan dit artikel.

• Door SEO aangedreven content en PR-distributie. Word vandaag nog versterkt.
• PlatoData.Network Verticale generatieve AI. Versterk jezelf. Toegang hier.
• PlatoAiStream. Web3-intelligentie. Kennis versterkt. Toegang hier.
• PlatoESG. Automotive / EV's, carbon, CleanTech, Energie, Milieu, Zonne, Afvalbeheer. Toegang hier.
• Plato Gezondheid. Intelligentie op het gebied van biotech en klinische proeven. Toegang hier.
• ChartPrime. Verhoog uw handelsspel met ChartPrime. Toegang hier.
• BlockOffsets. Eigendom voor milieucompensatie moderniseren. Toegang hier.
• Bron: https://www.nature.com/articles/s41419-023-06050-1