Voorbereiding van de primaire neuroncultuur

De experimentele protocollen met betrekking tot het verzamelen van dierlijk weefsel werden goedgekeurd door het veterinaire kantoor van het kanton Basel-Stadt volgens de Zwitserse federale wetten inzake dierenwelzijn en werden uitgevoerd in overeenstemming met de goedgekeurde richtlijnen. HD-MEA-chips of glazen dekglaasjes werden 70 minuten gesteriliseerd in 60% ethanol en gewassen met steriel gedeïoniseerd water onder een laminaire luchtstroom. De elektrodereeks of de dekglaasjes werden vervolgens behandeld met 10 µl 0.05% (v/v) poly(ethyleenimine) (Sigma-Aldrich) in boraatbuffer (Thermo Fisher Scientific) gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur en gewassen met gedeïoniseerd water, gevolgd door incubatie met 8 µl van 0.02 mg ml^-1 laminine (Sigma-Aldrich) in neurobasaal (NB) medium (Gibco) gedurende 30 minuten bij 37 °C. E-18 Wistar-rattenembryo's werden ontleed in ijskoude HBSS (Gibco) om hun cortices te oogsten, die vervolgens werden gedissocieerd in 0.25% trypsine-EDTA (Gibco). De gedissocieerde corticale cellen werden voorzichtig fijngewreven en gefilterd door een zeef van 0.45 µm om afzonderlijke cellen te verkrijgen. De celdichtheid werd geschat, en 10 µl van 3,000 cellen µl^-1 oplossing werd uitgeplaat op de elektrode-array. Men liet de cellen zich aan de arrays hechten door de chips gedurende 37 minuten bij 40 ° C te incuberen voordat 2 ml NB-plateermedium werd toegevoegd. NB uitplaatmedium werd bereid door 50 ml paardenserum (HyClone), 1.25 ml glutamax (Invitrogen) en 10 ml B-27 (Invitrogen) toe te voegen aan 450 ml Neurobasal (Gibco). De HD-MEA-chips werden in een celkweekincubator bij 37 ° C en 5% COXNUMX bewaard₂. Na 3 dagen werden de cellen gekweekt in serumvrij NB-uitplaatmedium tot DIV 20 door eenmaal per 50 dagen 3% van het kweekmedium uit te wisselen met vers NB-uitplaatmedium. Alle experimenten, behalve de gegevens getoond in Fig. 1i, werden uitgevoerd tussen DIV 14 en 16 omdat cellen tijdens het groeien verschillende mechanische eigenschappen vertoonden¹¹. De experimenten voor de gegevens getoond in Fig. 1i werden verzameld tussen DIV 22 en 24, toen de neuronale netwerken synchrone bursting-activiteit vertoonden.

Voorbereiding van cerebellumplakjes

Wildtype muizen (postnatale dag 14 C57BL/6Rj, Janvier Labs) werden onthoofd onder anesthesie met isofluraan; hun hersenen werden verwijderd en ondergedompeld in ijskoude carbogen-geborrelde (95% O₂ + 5% CO₂) kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF)-oplossing. Sagittale cerebellaire plakjes van ~350 µm werd verkregen met behulp van een vibratoom (VT1200S, Leica). Alle plakjes werden tot gebruik bij kamertemperatuur in aCSF gehouden. De aCSF bestond uit 125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂25 mM glucose, 1.25 mM NaH₂PO₄ en 25 mM NaHCO₃. De elektrodereeks van de HD-MEA-chips werd vervolgens gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur behandeld met 0.05 µl 40% (v/v) poly(ethyleenimine) (Sigma-Aldrich) in boraatbuffer (Thermo Fisher Scientific) en gewassen met gedeïoniseerd water, gevolgd door een incubatie met 8 µl van 0.02 mg ml^-1 laminine (Sigma-Aldrich) in neurobasaal medium (Gibco) gedurende 30 minuten bij 37 °C. Overtollige laminine werd na incubatie weggepipetteerd en de array werd gedroogd. Het schijfje van het cerebellum werd vervolgens voorzichtig op de elektrodereeks geplaatst met behulp van een afgesneden pipetpunt om schade veroorzaakt door schuifkrachten tijdens het pipetteren te voorkomen (aanvullende figuur XNUMX). 13). Een op maat gemaakte harp van 2 mm werd op de weefselplak geplaatst om de weefselplak te immobiliseren. Weefselcoupes werden vervolgens ondergedompeld in aCSF door voorzichtig druppel voor druppel toe te voegen. Het geïmmobiliseerde weefselplakje, ondergedompeld in aCSF, mocht vervolgens gedurende 30 minuten aan de elektrodereeks hechten. Vlak voor de opname werd de harp verwijderd en werd de AFM-kop op de HD-MEA-chip gemonteerd. Het weefsel werd continu geperfuseerd met carbogen-geborreld aCSF om de levensvatbaarheid en activiteit van de cellen te behouden.

HD-MEA-opstelling

Op complementaire metaaloxide-halfgeleiders (CMOS) gebaseerde HD-MEA-chips met 26,400 elektroden (17.5 µm pitch) binnen een totaal detectiegebied van 3.85 x 2.10 mm² waren gebruikt²⁵. De chips werden vervaardigd in een commerciële gieterij en in eigen huis nabewerkt en verpakt (aanvullende figuur 1). 1b). Op de chips werden transparante polycarbonaatringen (GB Plex) met een diameter van 4 cm gelijmd en de draadverbindingen werden ingekapseld met biocompatibele donkere epoxy (EPO-TEK 353 ND). De platinazwarte coating van de elektroden werd elektrolytisch afgezet om de elektrode-impedantie te verlagen en de signaal-ruiskarakteristieken te verbeteren (aanvullende figuur XNUMX). 1c). Commerciële versies van ons op maat ontwikkelde HD-MEA-systeem kunnen worden gekocht (MaxOne-model) bij MaxWell Biosystems.

Monsterhouder en podiumverwarmer

Een thermo-elektrische, op Peltier gebaseerde monsterverwarmer, met een temperatuursonde voor feedback in een gesloten lus, werd bestuurd door een zelfgebouwde temperatuurregelaar om het monster op 37 ° C te houden. De monsterverwarmer werd uitgelijnd met het thermische geleidingskussen op de HD-MEA-chip. De chips werden vervolgens op een monsterhouder gemonteerd en op hun plaats vergrendeld met de veerbelaste pen van de houder. Prusa I3 MK3S+ werd gebruikt om de zuinige spuithouders voor de perfusieopstelling, die aan de monsterhouder waren bevestigd, in 3D te printen. De gehele opstelling werd op een custom-made gemonteerd x,y piëzotrap via een bodemplaat.

x,y piëzo-stadium

Twee lineaire piëzotrappen (Xeryon XLS-1-serie) met een encoderresolutie van 5 nm werden loodrecht aan elkaar bevestigd (aanvullende figuur XNUMX). 1a). De lineaire trappen werden bestuurd door een Xeryon XD-M meerassige controller aangesloten op een LabVIEW-gebaseerde gebruikersinterface. De elektrode linksboven van de HD-MEA-chip werd geregistreerd als de oorsprong van het coördinatensysteem, en de elektrodecoördinaten met de van belang zijnde neuronen werden geëxtraheerd uit de gebruikersinterface van MaxWell Biosystems. Deze coördinaten werden vervolgens aan de XD-M-controller doorgegeven met behulp van aangepaste scripts voor eenvoudige positionering van neuronen onder de AFM-cantilever.

Fluorescentiemicroscopie op lange werkafstand

Een optische microscoop (Nikon SMZ 25) met 15.75× verstelbare zoomlenzen en 1× objectief (Nikon, MNH55100 P2-SHR PlanApo 1X; numerieke opening, 0.156) werd uitgelijnd met de opstelling zoals vermeld in de hoofdtekst. Een TTL-regelbare LED-verlichting (Light Emitting Diode) (CoolLED PE 300^ultra) werd gebruikt als lichtbron voor excitatie-/emissiefiltervrije beeldvorming. Een drievoudige banddoorlaatbundelsplitser (F66-412, AHF Analysentechnik) werd gebruikt om het gereflecteerde excitatielicht van de HD-MEA-chip te filteren. Een grote CMOS-arraycamera (Nikon DS-QI2) met 4,908 x 3,264 pixels (pixelgrootte, 7.3 x 7.3 µm²) werd op de microscoop gemonteerd met behulp van een 2.5 x f-gemonteerde projectorlens, waardoor bemonstering tot 45 fps mogelijk was met een uiteindelijke vergroting van ~40× en een resolutie van 0.46 µm per pixel.

AFM

Er werd een AFM kop (Catalyst, Bruker) gemonteerd en uitgelijnd met de opstelling zoals vermeld in de hoofdtekst. Een piëzoscanner van 15 µm op het hoofd werd gebruikt om alle kracht-verplaatsing- en kracht-tijd-curven te verzamelen, terwijl een piëzo-scanner van 150 µm werd gebruikt om de cantilever op het neuron te positioneren. De gegevens werden verzameld en geëxporteerd naar .txt-bestanden met behulp van de AFM-software (Nanoscope v.9.2, Bruker). De gegevens werden geanalyseerd en uitgezet met Python-scripts. Silicakorrels met een diameter van 5 μm (Kisker Biotech) werden met behulp van ultraviolette lijm (Dymax) aan het vrije uiteinde van puntloze microcantilevers (CSC-37 of 38, Micromash HQ) gelijmd en werden gedurende 20 minuten met ultraviolet uitgehard. De cantilevers met kralen werden gedurende 5 minuten gereinigd met behulp van een plasmareiniger (Harrick Plasma), vervolgens op de vloeistofsondehouder gemonteerd met een saffiervenster van 2 mm, en gekalibreerd met behulp van de thermische ruismethode.⁴⁸.

Correlatieve AFM, HD-MEA en optische microscopie

De AFM, HD-MEA en optische microscoop werden uitgelijnd zoals weergegeven (Fig. 1a). Fluorescentielicht van neuronen op HD-MEA-chips werd verzameld door een saffiervenster in de AFM-cantileverhouder en doorgegeven aan de optische microscoop. Het fluorescentiebeeld van de neuronen op de HD-MEA-chip werd opeenvolgend verzameld in interessante gebieden, gestikt en geregistreerd op de Maxwell MEA-gebruikersinterface om neuronen op de HD-MEA-chip te lokaliseren (aanvullende figuur 1). 2a-d). De x,y coördinaten van neuronen van belang werden vervolgens aan de x,y podium via LabVIEW-scripts, waardoor de AFM-cantilever op de gewenste posities wordt geplaatst ~5 nm-precisie. De hele opstelling werd op een dempende geïsoleerde tafel geïnstalleerd en in een tegen geluid beschermde, temperatuurgecontroleerde kamer geplaatst om mechanisch geluid en thermische drift te verminderen.

TTL-synchronisatie

TTL-pulsen van DS-Qi2 werden geëxtraheerd met behulp van een zelfgebouwde connector met een 3.5 inch vierpolige pin, een ministekker aan de ene kant en een vrouwelijke 24 AWG jumper (RND 255-00015, Distrelec) aan de andere kant. Pin 1 was de aarde en pin 4 (EXP_TMG) ontving tijdens live-bedrijf 2.4 V op HI (hoog) niveau volgens de ingestelde belichtingstijd. Een negatieve puls van 0-5 V werd geëxtraheerd uit uitgangskanaal 1 op het voorpaneel van de AFM-controller (Bruker Nanoscope V) via een zelfgebouwde connector met een standaard BNC mannelijke pin aan één kant en een vrouwelijke 24 AWG jumper (RND 255 -00015, Distrelec) aan de andere kant. De signalen, afkomstig van zowel de camera als de AFM, werden vervolgens naar pin 2 en 8 van een enkele snelle optocoupler geleid. De signalen werden vervolgens via een in het veld programmeerbare poortarray naar het HD-MEA-data-acquisitiesysteem gestuurd, waardoor nauwkeurige tijdstempels werden verkregen van de gebeurtenissen die werden gedetecteerd door AFM en optische microscopie op onbewerkte bestandsopnamen van HD-MEA-gegevens verzameld op 20 kHz.

Stijfheidsregistratieprotocol en metingen

De schijnbare Young-modulus werd berekend op basis van een gemiddelde van vijf kracht-verplaatsingscurven verzameld op het neuronale soma. Vervolgens wachtten we 30 seconden om er zeker van te zijn dat er geen door metingen veroorzaakte mechanische veranderingen in de neuronen waren en verzamelden we opnieuw vijf kracht-verplaatsingscurven (Fig. 2a), die we hebben bestempeld als één meetcyclus en die wordt weergegeven door één punt (Fig. 2b). We herhaalden deze meetcyclus tot 5 minuten op een neuron en gingen naar het volgende neuron in het netwerk. Zestig minuten na de eerste meting van het eerste neuron keerden we terug naar hetzelfde neuron en werd de meetcyclus herhaald. De metingen omvatten een volgcyclus op lange tijdschaal. Deze volgcyclus op lange tijdschaal werd drie keer herhaald (Fig. 2c). Voor stijfheidsmetingen van neurieten hebben we eerst de elektrofysiologische activiteit van de neuronen gedurende 5 minuten geregistreerd en vervolgens twee goed geïsoleerde neurieten per neuron geïdentificeerd en daarop kracht-verplaatsingscurven verzameld. Kracht-verplaatsingscurven werden verzameld met behulp van CSC-38 microcantilevers (nominale veerconstante, ~0.02 Nm^-1) met kralen met een diameter van 5 μm, zoals hierboven vermeld. Een maximale kracht van 700 pN op soma's en van 400 pN op neurieten werd gebruikt om kracht-afstandscurven te verzamelen (aanvullende figuur XNUMX). 14a, b). Voor alle metingen werd de tipsnelheid constant gehouden op 10 µm s^-1. Het contactpunt werd bepaald op basis van de benaderingskracht-verplaatsingscurve als de x onderscheppen met een krachtwaarde die vijf keer hoger was dan de standaardafwijking van de basislijnruis, gevolgd door een handmatige curatie. De inkepingsdiepte werd berekend als de verplaatsingswaarde op het contactpunt na het aftrekken van de doorbuiging van de cantilever en het instellen van de verplaatsingswaarde bij de maximale kracht op nul in de kracht-verplaatsingscurve (aanvullende figuur 1). 14c). De inkepingsdiepte voor dezelfde gegeven maximale kracht zou van soma tot soma variëren, afhankelijk van de stijfheid ervan. Daarom hebben we een inkepingsdiepte van 750 nm ingesteld. In de kracht-verplaatsingscurven werden alle krachtwaarden waarvoor de overeenkomstige verplaatsingswaarde de inkepingsdiepte-afsnijding overschreed, weggegooid. De schijnbare Young-modulus werd berekend op basis van dergelijke curven waarop het Hertz-model voor een bolvormige indenter met een elastische halve ruimte⁴⁹ werd aangepast met behulp van aangepaste codes in Python.

De waarden van de Young-modulus die in ons onderzoek zijn gemeten voor de soma van neuronen liggen in een vergelijkbaar bereik als eerdere rapporten^10,11. De Young-modulus van de neurieten is echter lager dan de gerapporteerde waarden, terwijl ze zich nog steeds in een vergelijkbare orde van grootte bevinden. Deze bias kan het gevolg zijn van onze keuze om de twee dikste basale neurieten van het neuron te meten, die doorgaans zachter zijn. Voor het meten van de stijfheid van de neuronale soma's tijdens burst- en IBI's hebben we kracht-verplaatsingscurven verzameld met een frequentie van 5 Hz. Dit proces werd voor elke soma verschillende keren herhaald en de gemiddelde stijfheid van de soma tijdens barstperiodes en tijdens IBI's werd berekend. Hoewel de uitbarstingen meestal in een ritmisch patroon verschijnen (Fig. 2h), is het voor gekweekte neuronen moeilijk te voorspellen wanneer een enkel neuron barst. Om ten minste twee kracht-verplaatsingscurven te verzamelen tijdens bursting-perioden of IBI's, terwijl het aantal keren dat de sonde in contact komt met het neuron tot een minimum wordt beperkt, hebben we het neuron vijf keer ingesprongen.^-1.

Statisch compressieprotocol

Een kraal met een diameter van 5 µm, vastgelijmd aan een puntloze AFM-microcantilever (CSC-37; nominale veerconstante, ~0.8 Nm^-1), bevond zich boven de soma. De kraal werd op de soma neergelaten totdat een instelkracht die nodig was om 0.1 kPa of 5 kPa toe te passen werd bereikt en gedurende 60 seconden in contact werd gehouden met behulp van feedback van constante hoogte voordat de kraal werd teruggetrokken (Fig. 5b). De kracht-tijdcurve opgenomen met een bemonsteringssnelheid van 500 kHz toont zowel de verticale verplaatsing van de AFM-kop als de krachtrespons van de soma. De gemiddelde hoogte van de soma van corticale neuronen van ratten was ~8 µm (aanvullende afb. 11).

Functionele calciumbeeldvorming

Genetisch gecodeerde calciumsensoren werden tot expressie gebracht in neuronen met behulp van adeno-geassocieerde virussen (AAV's). AAV1-EF1a-GCaMP6s (1.8 x 10¹³ virale genomen ml^-1) werden gebruikt bij een veelvoud aan infecties van 5.0 x 10⁴ om GCaMP6's uit te drukken. Neuronen werden geïnfecteerd op DIV 3; expressie werd meestal gezien bij DIV 5–9.

Functionele calciumbeeldvormingsanalyse van mechanisch gestimuleerde neuronen

Een gemiddelde fluorescentie-intensiteitscurve ΔI/I van de GCaMP6s-curve werd berekend als het gemiddelde signaal over het gehele beeld ten opzichte van de basislijn van het beeld. Piekdetectie in het signaal werd uitgevoerd door lokale maxima binnen een tijdsbestek van 3 seconden te vinden. Een gebeurtenis werd gemarkeerd als het begin van een neuronale respons wanneer de amplitude van het calciumsignaal 10% van de piekwaarde bereikte. Gegevens van 2.5 s vóór en 10 s na het begin van de responspiek (t = 0) werd uitgezet.

HD-MEA-opnamen

De gebruikersinterface van MaxWell Biosystem (MaxLab Live v.22.13) werd gebruikt om de gegevens vast te leggen. Het fluorescentiebeeld van de hele chip werd geregistreerd op de gebruikersinterface (aanvullende figuur XNUMX). 2c). Van belang zijnde neuronen werden geïdentificeerd aan de hand van calciumpieken, en piekactiviteit (actiepotentialen) werd verkregen uit de live rastergrafieken op de gebruikersinterface. Zodra een neuron van belang was geïdentificeerd, werden 512 elektroden rond dit neuron in een rechthoekige configuratie naar de uitlezing geleid. Na het positioneren van de AFM-cantilever op het neuron, werden de kanalen vijf keer verschoven om de ruis te compenseren van de infraroodlaser die door de AFM werd gebruikt om de cantilever-afbuiging te detecteren voordat de opname werd gestart. Voor alle opnames werd een versterking van 512 en een hoogdoorlaatfilter met een grenswaarde bij 300 Hz gebruikt. Om de prestaties van de pieksorteringsalgoritmen in Fig. 5werden neuronale actiepotentialen 2.5 minuten vóór en na mechanische stimulatie geregistreerd.

HD-MEA-gegevensanalyse

Alle verzamelde HD-MEA-gegevens werden verwerkt via aangepaste scripts op basis van Spikeinterface⁵⁰. In het kort werden extracellulaire opnames gefilterd en piekgesorteerd met behulp van Kilosort2, gevolgd door handmatige curatie van alle opnames. Voor de curatie werden een conservatieve inter-spike intervalschendingsdrempel van 0.5 en een signaal-ruisverhoudingsdrempel van 5.0 gebruikt. Sjabloonovereenkomst, autocorrelogrammen en kruiscorrelogrammen werden gebruikt voor de beoordeling van de eenheidskwaliteit. Golfvormkenmerken zoals halve breedte en repolarisatiehelling werden geëxtraheerd voor piekgesorteerde eenheden voor de respectieve tijdperken met Python-scripts met behulp van functies van Spikeinterface (aanvullende figuur XNUMX). 12a – ik). De relatieve veranderingen in de golfvormkenmerken op alle elektroden binnen de extracellulaire voetafdruk van een neuron werden verkregen door de waarde van het gemiddelde golfvormkenmerk van alle pieken tijdens mechanische compressie te delen door het gemiddelde golfvormkenmerk van alle pieken vóór compressie. De gemiddelde vuursnelheid en het interval tussen de pieken werden berekend op basis van de geëxtraheerde piektreinen met behulp van de Elephant elektrofysiologische analysetoolkit 0.11.2⁵¹. De gemiddelde vuursnelheden voor stijfheidscorrelatiegegevens werden berekend door de pieken in bakken van 30 seconden te plaatsen, zodat ze overeenkwamen met de tijdstippen van de stijfheidswaarden. De gemiddelde vuursnelheden voor het compressieprotocol werden berekend door het plaatsen van pieken in drie bakken van vóór, tijdens en na de compressie.

Gecombineerde AFM en confocale microscopie

Time-lapse confocale beeldvorming werd uitgevoerd op een omgekeerde laserscannende confocale microscoop (Observer Z1, LSM 700; Zeiss) uitgerust met een 25x/0.8 LCI PlanApo waterimmersieobjectief (Zeiss). Een AFM (CellHesion 200; JPK Instruments) werd op de confocale microscoop gemonteerd. Mechanische compressieprotocollen werden uitgevoerd met behulp van JPK CellHesion-software. Voor mechanische stimulatie werd AFM gebruikt om de cantilever met de kraal op de cel te naderen met snelheden van 0.1, 1, 10 of 100 μm s^-1 tot het bereiken van de ingestelde kracht, en daarna onmiddellijk teruggetrokken met dezelfde snelheid als gebruikt voor de nadering. Voor experimenten die de drempelkracht bepalen om neuronen mechanisch te stimuleren, werd de toegepaste instelpuntkracht stapsgewijs verhoogd van 50 naar 400 nN in stappen van 50 nN en intervallen van 20 s (aanvullende figuur XNUMX). 6). De instelpuntkracht van de naderende kraal werd stapsgewijs verhoogd totdat een neuronale respons werd geregistreerd. Na succesvolle stimulatie van het neuron werd de cantilever teruggetrokken en werd een nieuw neuron geselecteerd voor stimulatie.

statistische analyse

Alle gegevens die golfvormeigenschappen vertoonden, werden op normaliteit getest met de Shapiro-Wilk-test en Q-Q percelen. Alle gegevensgroepen waren niet normaal verdeeld en waren afhankelijke gegevensgroepen. Daarom hebben we de Wilcoxon Signed Rank-test gebruikt. De nulhypothese was dat er geen verschil is in medianen tussen de paarsgewijs vergeleken verdelingen. P waarden >0.05 werden als niet-significant beschouwd. De golfvormkenmerken werden geëxtraheerd uit de gemiddelde golfvorm van elk verkregen neuron n > 5,000 pieken. Alle gegevens die de gemiddelde vuurpercentages aantoonden, werden vergeleken met de Wilcoxon-test met handtekening van n > 10,000 pieken. AFM-gegevensgroepen werden vergeleken met behulp van de tweezijdige Mann-Whitney U-test. P waarden voor elke vergelijking worden vermeld in de figuurlegenda's. Pearson-correlatie werd gebruikt om de lineaire correlaties in stijfheid en gemiddelde vuursnelheidswaarden te bepalen. Er zijn geen statistische methoden gebruikt om de steekproefomvang vooraf te bepalen. Het verzamelen en analyseren van gegevens gebeurde niet blind voor de omstandigheden van de experimenten.

Rapportage samenvatting

Nadere informatie over onderzoeksontwerp is beschikbaar in de Samenvatting van de rapportage over de natuurportfolio gekoppeld aan dit artikel.

• Door SEO aangedreven content en PR-distributie. Word vandaag nog versterkt.
• PlatoData.Network Verticale generatieve AI. Versterk jezelf. Toegang hier.
• PlatoAiStream. Web3-intelligentie. Kennis versterkt. Toegang hier.
• PlatoESG. carbon, CleanTech, Energie, Milieu, Zonne, Afvalbeheer. Toegang hier.
• Plato Gezondheid. Intelligentie op het gebied van biotech en klinische proeven. Toegang hier.
• Bron: https://www.nature.com/articles/s41565-024-01609-1