Alle reagentia werden gebruikt zoals ontvangen, tenzij anders vermeld. Alle chemicaliën werden gekocht bij Sigma Aldrich, behalve de telkralen (CountBright Absolute Counting Beads, Invitrogen). ζ-Potentieel werd gemeten met behulp van een Zetasizer NanoZS90 (Malvern Instruments). Grootte en morfologie van de deeltjes werd bestudeerd door SEM in een JEOL JSM 7800F Prime-microscoop met geïntegreerde EDS om de elementanalyse te verschaffen. De deeltjesgrootte werd bepaald door het meten van 50 onafhankelijke deeltjes. Radio-instant dunnelaagchromatografie (ITLC) werd ontwikkeld op glasmicrovezelchromatografiepapier van Agilent Technologies geïmpregneerd met kiezelzuur en geanalyseerd met behulp van een Lablogic Flow-count TLC-scanner en een BioScan B-FC-3200 fotomultiplierbuis (PMT) -detector met behulp van Laura-software. De mobiele fase van ITLC bestond uit 0.175 M citroenzuur en 0.325 M trinatriumcitraat in water, tenzij anders vermeld. Radioactieve monsters werden gemeten met behulp van een Capintec CRC-25R (Capintec) of een LKB Wallac 1282 Compugamma CS (PerkinElmer) waarvoor gegevens werden verzameld met behulp van EdenTerm-software. Flowcytometrie-experimenten werden uitgevoerd in een BD FACS Melody-celsorteerder met behulp van BD FACSChorus Software. PET/CT-beelden werden verkregen met behulp van een NanoPET/CT-scanner (Mediso), gereconstrueerd met behulp van Nucline v.0.21-software, en beelden werden geanalyseerd met behulp van VivoQuant-software (versie 3.5, InviCRO). Listmode-gegevens werden verkregen door een specifieke MATLAB-softwaretool ontwikkeld door Mediso. Autoradiografie werd uitgevoerd in een GE Amersham Typhoon-instrument.

Synthese van silicadeeltjes van submicrometergrootte

De deeltjes werden gesynthetiseerd met behulp van de Stöber-methode. Deze methode is gebaseerd op de hydrolyse en daaropvolgende condensatie van siliciumalkoxiden om monodisperse, bolvormige silicadeeltjes te produceren²⁷. Als siliciumbron werd tetraethylorthosilicaat (TEOS), ammoniak als basiskatalysator en kaliumchloride als elektrolyt gebruikt. Een oplossing van TEOS in ethanol werd continu toegevoegd aan een oplossing die de katalysator en de elektrolyt bevatte. Wijziging van de starthoeveelheid van het reagens of de toevoegingssnelheid levert verschillen in de deeltjesgrootte op, zoals eerder gerapporteerd²⁸. Hier werden vóór de synthese van de deeltjes twee oplossingen bereid: oplossing 1 die 19.0 mmol TEOS in 33.3 ml EtOH bevat en oplossing 2 die 0.23 mmol KCl in 9 ml ammoniak, 65 ml EtOH en 6.75 ml H bevat.₂O. Voor de synthese werd oplossing 2 in een rondbodemkolf van 250 ml geplaatst, verwarmd tot 50 °C, onder roeren bij 300 rpm gedurende 15 minuten. Vervolgens werd oplossing 1 druppelsgewijs toegevoegd aan oplossing 2 (toevoersnelheid 0.2 ml min.^-1). Na toevoeging van Oplossing 1 werden de verkregen deeltjes gezuiverd door centrifugatie bij 18,300g gedurende 3 minuten en vijf keer gewassen met EtOH. Tenslotte de SiO₂ microdeeltjes werden onder vacuüm gedroogd.

Enten van de deeltjes van submicrometergrootte met silaan-PEG_5k

Een 20 mg ml^-1 oplossing van silaan-PEG_5k (Sigma Aldrich) in EtOH 98% werd toegevoegd aan een oplossing van smSiP van 5 mg ml^-1 in EtOH 98% en 2.8% ammoniak. Het mengsel werd een nacht bij kamertemperatuur geroerd en de deeltjes werden teruggewonnen door centrifugatie bij 18,300°C.g gedurende 3 minuten. Tenslotte werden de deeltjes driemaal gewassen met gedestilleerd water en een nacht onder vacuüm gedroogd. De wasoplossingen werden een nacht gevriesdroogd en de hoeveelheid niet-gebonden silaan-PEG_5k gewogen voor de berekening van de reactieopbrengst. Een 0.05 mg ml^-1 oplossing van smSiP-PEG_5k in gedestilleerd water werd gebruikt voor verdere radiolabelingsreacties.

[⁶⁸Ga]GaCl₃

Gallium-68 werd geëlueerd als [⁶⁸Ga]GaCl₃ van een Eckert en Ziegler ⁶⁸Ge /⁶⁸Ga-generator in ultrazuivere HCl (4 ml, 0.1 M), vervaardigd volgens de eisen van goede productiepraktijken (ABX).

Concentratie van de [⁶⁸Ga]GaCl₃ elutie door kationenuitwisseling

De concentratie van de elutie werd uitgevoerd met behulp van de opstelling beschreven in aanvullende figuur 2. 1. Eerst wordt de 4 ml van de [⁶⁸Ga]GaCl₃ elutie werd op een Strata-X-C 33u-cartridge (Phenomenex) geladen en het eluaat werd weggegooid. Vervolgens werd de patroon gewassen met 5 ml van een aceton/0.1 M HCl-oplossing (80:20) en het eluaat werd weggegooid. Tenslotte is de geconcentreerde [⁶⁸Ga]GaCl₃ werd verzameld door het toevoegen van 700 µl van een oplossing van aceton/0.05 M HCl (98:2), gedroogd onder een N₂ stroom en opnieuw gesuspendeerd in 50 µl 0.5 M HEPES-buffer (pH 4.9). Radio-TLC werd uitgevoerd in de verschillende stadia voor kwaliteitscontrole. Het protocol duurt ongeveer 20 minuten en levert een herstelrendement op van 86.2 ± 8.5%.

Radiolabeling van silicadeeltjes in verschillende concentraties met ⁶⁸Ga

Silicadeeltjes werden opnieuw gesuspendeerd in verschillende concentraties (van 1 tot 0.002 mg ml^-1) in 0.5 M HEPES-buffer (pH 4.9). Vervolgens werd 50 µl van de oplossing aan een reactiebuis toegevoegd voordat de geconcentreerde [⁶⁸Ga]GaCl₃ elutie in 50 µl 0.5 M HEPES-buffer (pH 4.9). De reacties werden gedurende 90 minuten bij 30 ° C uitgevoerd en radio-TLC werd uitgevoerd om de radiochemische opbrengst te berekenen.

Meting van deeltjesconcentratie door flowcytometrie

Deeltjesconcentraties werden berekend door middel van flowcytometrie met behulp van telkorrels (CountBright Absolute Counting Beads, Invitrogen) volgens de instructies van de fabrikant. Silicadeeltjes werden opnieuw gesuspendeerd in een concentratie van 0.05 mg-ml^-1, gedurende 10 minuten gesoniceerd en door een filter met een cut-off-grootte van 10 µm gevoerd (KX-spuitfilter, nylon, 25 mm, 10 µm). De CountBright Absolute Counting Beads werden opgewarmd tot kamertemperatuur en gedurende 30 seconden gewerveld. Vervolgens werd 50 µl kralen toegevoegd aan 300 µl silicadeeltjes en werd het mengsel 30 minuten gewerveld om een ​​homogene oplossing te verkrijgen. Het monster werd op de flowcytometer gelopen en de drempelwaarde voor voorwaartse verstrooiing (FSC) werd zo ingesteld dat de korrels en de deeltjes op de lineaire FSC versus lineaire zijwaartse verstrooiingsplot werden opgenomen. Daarna werd de fluorescentiedetectorspanning aangepast voor de telkorrels en werd een poortstrategie uitgevoerd om de silicadeeltjes en de telkorrelpopulaties te isoleren. Ten slotte werden poorten op de deeltjes en de absolute telkorrels getrokken en werden voor elk monster 1,000 korrelgebeurtenissen geregistreerd. Met behulp van deze strategie werd het aantal deeltjes in oplossing berekend met behulp van de volgende vergelijking:

Radiolabeling van 500 smSiP

Vijfhonderd smSiP werd toegevoegd aan 50 µl van de geconcentreerde [⁶⁸Ga]GaCl₃ elutie in 0.5 M HEPES-buffer pH 4.9. Vervolgens werd 5.6 µl polysorbaat 80 toegevoegd en werd het mengsel gedurende 90 minuten bij 30 °C en 900 rpm in een thermische menger verwarmd. Daarna werd een laatste meerstapszuiveringsprotocol ontworpen om niet-gereageerd/colloïdaal materiaal te verwijderen ⁶⁸Ga. Vijftig microliter 10 mM EDTA werd toegevoegd en het mengsel werd 5 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Vervolgens werden de deeltjes gedurende 3 minuten bij 18,300 gecentrifugeerdg, opnieuw gesuspendeerd in 500 µl PBS met 1 mM EDTA + 0.1% polysorbaat 80 en voorzichtig gedurende 10 seconden gewerveld. De deeltjes werden opnieuw gecentrifugeerd, gewassen met een oplossing van 0.1 mM EDTA + 0.1% polysorbaat 80 in PBS en voorzichtig gedurende 10 seconden gewerveld. Tenslotte werden de deeltjes gecentrifugeerd en nog vijf keer gewassen met PBS + 0.1% polysorbaat 80 en opnieuw gesuspendeerd in 500 µl PBS. De radiolabelingsreactie werd gevolgd door radio-TLC tijdens de opeenvolgende reactiestappen om de aanwezigheid van colloïden (die kunnen worden verward met deeltjes als ze niet op de juiste manier worden verwijderd), de radiolabeling van de deeltjes en de zuiverheid van het eindproduct te evalueren. RLY werd berekend door vergelijking tussen de hoeveelheid radioactiviteit in de deeltjes en de bovenstaande vloeistoffen na de wasstappen.

fractionering

Voor de fractioneringsstrategie zijn volumes van 0.5 µl tot 20 µl van de ⁶⁸Ga-smSiP bij een theoretische concentratie van 1 deeltje  µl^-1 werden toegevoegd aan verschillende monsterbuisjes in stappen van 1 µl (0.5, 1, 2, 3…) en PBS werd toegevoegd om het eindvolume op 50 µl te brengen. Vervolgens werd 37.5 µl uit het eerste buisje in een tweede monsterbuisje gepipetteerd, 25 µl van het tweede buisje in een derde buisje en tenslotte 12.5 µl van het derde buisje in een vierde buisje. Deze strategie levert vier buisjes per monster op met een eindvolume van 12.5 µl per buisje. De radioactiviteit in elke buis werd gemeten in een gammateller en de waarden werden berekend in kBq met behulp van een ijkcurve, voor verdere vergelijking en analyse. De monsters die het grootste deel van de radioactiviteit in slechts één buis bevatten, werden gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur gesoniceerd en onderworpen aan een tweede fractioneringsstap. Vervolgens werden de monsters waarin alle radioactiviteit in één buisje werd aangetroffen (met een verwaarloosbare activiteit in de andere drie buizen) gebruikt voor verdere in vivo/ex vivo experimenten.

PET/CT-fantoombeeldvorming

Met één exemplaar werd een fantoombeeldvormingsexperiment uitgevoerd ⁶⁸Ga-smSiP. Er werd een canule gebruikt om het deeltje in een monsterbuisje te brengen om te evalueren of een enkel deeltje tijdens toediening in het canulebuisje gevangen kon blijven. In het kort werd de fantoombuis in de nanoPET/CT-scanner geplaatst met het uiteinde van de canulepunt aan de buis bevestigd. Na het starten van de PET-acquisitie werd het deeltje, geresuspendeerd in 100 µl PBS, afgeleverd met een insulinespuit bevestigd aan het begin van de canule. Vervolgens werd de canule gewassen met 50 µl PBS om ervoor te zorgen dat het deeltje in de fantoombuis terechtkwam. De PET-acquisitie werd gedurende 2 uur uitgevoerd, gevolgd door een standaard CT-scan.

In vivo PET/CT-beeldvorming

Beeldvormingsstudies bij dieren werden ethisch beoordeeld en uitgevoerd in overeenstemming met de Animals (Scientific Procedures) Act 1986 (ASPA) UK Home Office-voorschriften voor dierproeven. In vivo beeldvorming werd uitgevoerd bij gezonde BALB/c-muizen van 8 weken oud. Dieren werden verdoofd met isofluraan (2-3% in zuurstof), van een canule voorzien en onder verdoving op het scannerbed geplaatst. Het bed werd door een interne luchtstroom tot 37°C verwarmd om het dier op een normale lichaamstemperatuur te houden, en de ademhalingssnelheid werd gecontroleerd en op 60-80 ademhalingen per minuut gehouden.^-1 gedurende de hele scan. Het is belangrijk om controle te houden over de temperatuur van het dier, omdat een onverwachte temperatuurdaling kan leiden tot een verlaging van de snelheid van het deeltje in het bloed. Een ⁶⁸Ga-smSiP (n = 4) of ⁶⁸Ga-smSiP-PEG_5k deeltje (n = 2) werd toegediend via de canule in 100 µl PBS, gevolgd door wassen met 50 µl PBS na het starten van de PET-acquisitie (1:5 coïncidentiemodus; 5 ns coïncidentietijdvenster). PET werd gedurende 2 uur geregistreerd en vervolgens werd een halfronde CT-scan uitgevoerd. De lichaamstemperatuur en ademhalingsfrequentie van het dier werden gedurende het hele proces gevolgd. Dynamische PET/CT-beelden werden gereconstrueerd met behulp van Tera-Tomo 3D-reconstructie (400–600 keV energievenster, 1:5 coïncidentiemodus, 20 iteraties en 1 subset) bij een voxelgrootte van 0.4 × 0.4 × 0.4 mm³ en gecorrigeerd voor verzwakking, verstrooiing en verval. Er kunnen lijstmodusgegevens voor alle PET/PEPT-acquisities worden gevonden ⁶⁸Ga-smSiP bij ref. ²⁹ en voor ⁶⁸Ga-smSiP-PEG_5k bij ref. ³⁰.

Real-time tracking

Eerst werden gegevens uit de scanner geëxporteerd in lijstmodusformaat (dat wil zeggen een formaat met een tijdstempel en kristalindex voor gedetecteerde toevallige fotonen). Er werd een geometrische transformatie toegepast om kristalindexen om te zetten naar positie in mm-eenheden. De Birmingham-methode berekent iteratief de MDP uit een subset van alle LoR's. Dit wordt gedaan door LoR's die zich verder dan een bepaalde afstand van de MDP bevinden, weg te gooien, aangezien deze waarschijnlijk voortkomen uit valse LoR's, bijvoorbeeld LoR's die afkomstig kunnen zijn van verstrooiing. Het MDP wordt bij elke iteratie verfijnd; het aantal iteraties wordt effectief bepaald door de f-factor en heeft betrekking op het totale aantal LoR's dat wordt gebruikt om de uiteindelijke deeltjespositie binnen die subset te schatten (bijvoorbeeld een f-factor van 0.5 betekent dat de iteratielus eindigt wanneer 50% van de LoR's in de subset overblijft). Het aantal LoR's dat in een subset wordt gebruikt, kan worden verminderd om de temporele bemonstering te verbeteren (de subsets zijn in de tijd opeenvolgend zonder overlap) ten koste van het vergroten van de onzekerheid in de positie (verdere details van het algoritme zijn te vinden in Parker et al.⁵) De Birmingham-methode werd gebruikt om lijstmodusgegevens van de PET-scanner te analyseren. Er werd een adaptieve monstergrootte gebruikt om het deeltje in de muizen te volgen. De steekproefomvang werd zo ingesteld dat een evenwicht werd bereikt tussen voldoende tijdelijke bemonstering en tegelijkertijd positioneringsfouten tot een minimum werden beperkt. In de vroege stadia van de scans (<100 seconden vanaf het begin van de scan) werd een steekproefomvang tussen 200 en 60 LoR’s gebruikt, waarbij f = 0.1, wat intervallen van ongeveer 1–5 s oplevert. Bij scantijden > 60 seconden werden de monstergroottes gevarieerd tussen 1,000 en 2,000, wat tijdsintervallen opleverde tussen 30 seconden en 60 seconden, afhankelijk van het in vivo experiment. Het aantal tellingen dat is gebruikt om de MDP te berekenen (in de laatste iteratie) kan worden gevonden door de steekproefomvang te vermenigvuldigen met de f-factorwaarde. Deze parameters waren gebaseerd op eerdere ervaringen en gebaseerd op eerdere publicaties¹.

Snelheid werd verkregen als (sqrt{{v}_{x}^{2}+{v}_{y}^{2}+{v}_{z}^{2}}) WAAR ({v}_{m}^{2}) is de snelheid in de x, y en z routebeschrijving.

Ex vivo opname van organen

De opname in verschillende organen werd geëvalueerd door gammatelling. Na de in vivo PET/CT-beeldvorming werden de dieren gedood door cervicale dislocatie en werden de organen uitgesneden en gewogen voor het tellen van de radioactiviteit in een gammateller (LKB Wallac 1282 Compugamma CS). Gegevens werden uitgedrukt als percentage geïnjecteerde dosis (dosis in het orgaan/totale geïnjecteerde dosis) per gram weefsel (%ID g^-1).

autoradiografie

De radioactiviteit in de longen werd gevolgd met een stralingsdetector (EP15-sonde, Morgan) en de longen werden met een scalpel in kleine secties gesneden totdat een klein deel van het weefsel met het radioactieve signaal werd verkregen. Het weefsel werd snel ingevroren in isopropanol van -80 °C. Onmiddellijk na het invriezen werd het weefsel ingebed in medium met optimale snijtemperatuur en in een cryostaat in plakjes van 20 µm gesneden. Elke plak werd met de detector onderzocht totdat de radioactieve plak werd gevonden. Het vorige (onder de achtergrond), radioactieve en volgende (onder de achtergrond) plak werden op een Superfrost-microscoopglaasje (Epredia) geplaatst. De rest van het resterende weefsel bevond zich ook onder de achtergrond. Het microscoopglaasje met de drie secties werd bedekt met huishoudfolie en een nacht tegen een GE-autoradiografieplaat geplaatst. De plaat werd geanalyseerd met behulp van GE Amersham Typhoon met een resolutie van 25 µm en een PMT-instelling van 4,000. Het autoradiografiebeeld werd over de afbeelding van het weefsel heen gelegd, waarbij één vlekje radioactiviteit in het radioactieve schijfje zichtbaar was. Voor de kwantificering werden standaarden bereid met verschillende bekende activiteiten, en elke standaard werd als kwintet van 1 µl op papier opgemerkt. De vlekken werden geïncubeerd in hetzelfde opslagfosforscherm, BAS-IP MS (Multipurpose Standard) van GE, terwijl de afzonderlijke deeltjes werden gekwantificeerd. Het beeld is verkregen met de Amersham Typhoon 5 met de Control Software versie 2.0 in de fosformodus met een pixelgrootte van 100 µm en een gevoeligheid van 4,000. De beelden werden gekwantificeerd met de software ImageQantTL v10.0-261 met behulp van de gelkwantificeringstoolbox. De vlekken werden gecorrigeerd door een gebied direct voor of na de vlek als constante achtergrond te kiezen. Het resulterende volume van de vlek werd gebruikt om op basis van de ijkcurve de Bq in het deeltje te berekenen.

Statistieken en reproduceerbaarheid

Voor kwantitatieve analyse werden minimaal drie biologische replicaten geanalyseerd, met uitzondering van de in vivo gegevens van ⁶⁸Ga-smSiP-PEG_5k (n = 2). Gegevens werden geanalyseerd door middel van gewone eenwegsvariantieanalyse (ANOVA) met de meervoudige vergelijkingstest van Dunnett en Student's t-testen. EEN P waarde <0.05 werd als statistisch significant beschouwd.

• Door SEO aangedreven content en PR-distributie. Word vandaag nog versterkt.
• PlatoData.Network Verticale generatieve AI. Versterk jezelf. Toegang hier.
• PlatoAiStream. Web3-intelligentie. Kennis versterkt. Toegang hier.
• PlatoESG. carbon, CleanTech, Energie, Milieu, Zonne, Afvalbeheer. Toegang hier.
• Plato Gezondheid. Intelligentie op het gebied van biotech en klinische proeven. Toegang hier.
• Bron: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01589-8