Cel cultuur

E14 mESC's werden gekocht bij de Stem Cell Bank van de Chinese Academie van Wetenschappen. Ze werden gekweekt bij 37 ° C in 5% COXNUMX₂ in een incubator. Het kweekmedium was Knockout DMEM (Gibco, 10829-018), waaraan 15% foetaal runderserum (FBS, Gibco, 10099-141), 1× MEM niet-essentiële aminozuren (Gibco, 11140-050), 1× GlutaMAX (Gibco, 35050-061), 50× GlutaMAX (Gibco) werd toegevoegd. , 2-3148), 1000 μM 1107-Mercaptoethanol (Sigma, M1), 0325901 IE/ml LIF (Millipore, ESG1036), 3 μM PD99021 (Selleck, S2924) en XNUMX μM CHIRXNUMX (Selleck, SXNUMX) [25]. mESC's werden bewaard op met mitomycine C behandelde embryonale fibroblasten van muizen (MEF's) voor passage of in met 0.1% gelatine gecoate schalen voor tests. Het medium werd elke dag ververst en de cellen werden elke drie dagen gepasseerd.

Haspin knock-out in mESC's

Om Haspin uit te schakelen, hebben we twee gids-RNA's (gRNA's) ontworpen die zich richten op voor Haspin coderende sequenties. De gRNA's werden versmolten en vervolgens gekloneerd in de met BbsI gedigereerde vector pX459. Deze twee Haspin-gRNA-plasmiden werden gecotransfecteerd in WT E14-cellen met behulp van Lipofectamine 2000 (Lip2000, Invitrogen, 11668019). 24 uur na transfectie werd het medium veranderd in ES-medium aangevuld met 1.5 μg/ml puromycine gedurende 3 dagen, en de overlevende afzonderlijke klonen werden opgepikt en overgebracht naar platen met 96 putjes. Om Haspin-KO-cellen te verkrijgen, gebruikten we immunokleuring van H3T3ph om H3T3ph-negatieve enkele klonen te selecteren. Vervolgens werden de genomische DNA-fragmenten van de Haspin-KO-cellen geamplificeerd door PCR en gesequenced om te bevestigen dat het Haspin-gen was verstoord.

Inductie van asymmetrische stamceldeling

Bij het testen van het vermogen tot asymmetrische stamceldeling werden E14 mESC's na passage overgeschakeld naar N2B27-medium en gedurende 16 uur geïncubeerd op met gelatine beklede celkweekschalen met glazen bodem (Nest, 801001). N2B27-medium omvat DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), Neurobasal (Gibco, 21103-049) (1:1), 50 μM 2-mercaptoethanol, 0.5% N2 (Gibco, 17502-048), 1% B27 (Gibco , 17504-044), 0.033% BSA 7.5% oplossing (Thermo Fisher, 15260037) en 1× GlutaMAX (Gibco, 35050-061) [24]. Na 16 uur werden onmiddellijk immunofluorescentiekleuringsexperimenten op de cellen uitgevoerd en vervolgens werden de cellen voorbereid voor confocale beeldvorming. Nanog, een van de belangrijkste pluripotentiemarkers, is altijd gebruikt om de ACD-ratio te bepalen [24,25,26]. Wanneer de signaalverhouding van Nanog tussen de twee dochtercellen groter is dan 1.2, wordt dit beschouwd als ACD [53].

Plasmideconstructie en overexpressie

De Chek2-eGFP- en Chek2-RFP-vectoren werden verkregen van Dr. Zhiyong Mao. We amplificeerden de coderende sequenties van Haspin en Wnt5a uit cDNA van mESC's en subkloneerden ze vervolgens in de Chek2-eGFP-vector om de coderende sequentie van Chek2 te vervangen. Voor overexpressie werd de Haspin-eGFP- of Wnt5a-RFP-vector getransfecteerd in E14 mESC's met behulp van Lip2000. Na 3 dagen transfectie werden GFP-positieve cellen gezuiverd met flowcytometrie met behulp van groene fluorescentie. De efficiëntie van overexpressie werd gemeten met qRT-PCR en Western-blotting.

siRNA's

E14-cellen werden getransfecteerd met siRNA-targeting Haspin or Wnt5a gedurende 48 uur met Lip2000 volgens de instructies van de fabrikant. De Haspin en Wnt5a siRNA's werden gesynthetiseerd door Ribobio (Guangzhou, China), en hun doel-DNA-sequenties worden weergegeven in de aanvullende tabel 1.

Haspinkinaseremmer CHR-6494

De Haspin-kinaseremmer CHR-6494 (MCE, HY-15217) werd opgelost in DMSO om een ​​voorraadoplossing van 10 mM te genereren en vervolgens bewaard bij -20 ° C [27]. Na celpassage en hechting werd het medium veranderd in 0.5 μM of 1 μM CHR-6494 toegevoegd ES-medium of N2B27-medium, en 1 μM DMSO werd als controle gebruikt. Het medium werd elke dag verwisseld.

Celsynchronisatie

Om het niveau van H3T3ph te meten, hebben we de mESC's gesynchroniseerd. Cellen werden gesynchroniseerd met metafase door behandeling met 1 μg / ml colchicine (Sigma, C3915) gedurende 8 uur, en vervolgens werden de cellen verzameld voor Western-blotting of immunofluorescentiekleuring.

Kleuring met alkalische fosfatase

mESC-kleuring met alkalische fosfatase (AP) werd uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant met behulp van de Alkaline Phosphatase Detection Kit (Millipore, SCR004). Eerst werden de cellen gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur gefixeerd met 4% paraformaldehyde in PBS en vervolgens gedurende 5 minuten gewassen met 1 x PBST. Vervolgens werden Fast Red Violet-oplossing en Napthol AS-BI-fosfaatoplossing gedurende 10 minuten in het donker op de mESC's aangebracht. Gekleurde cellen werden gewassen met 1 x PBS en onderzocht onder een omgekeerde microscoop.

Groeicurven

Ongeveer 20,000 cellen werden in elk putje van platen met 24 putjes gezaaid (Thermo, 142475). Vervolgens werden groeicurven gegenereerd na 24, 48, 72, 96 en 120 uur, en werden drie putjes van elke lijn geteld om het aantal cellen te bepalen. Het celaantal werd gemeten via Countess II (Thermo) volgens het protocol van de fabrikant. De resterende cellen werden gewassen met 1 x PBS en het medium werd dagelijks vervangen door vers medium.

Analyse van de celcyclus

E14 mESC's werden uitgeplaat in een celkweekplaat met zes putjes (Thermo, 140675). Drie dagen later werden de cellen getrypsiniseerd en overnacht bij 70 ° C in koude 4% ethanol gefixeerd. De cellen werden opnieuw gesuspendeerd en gedurende 37 minuten bij 30 ° C geïncubeerd met RNaseA-oplossing, gevolgd door incubatie met 50 μg / ml propylidinejodide (PI) -oplossing gedurende nog eens 30 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens werd BD FACS Aria II gebruikt om de frequentie van cellen in de G1-fase, S-fase en G2/M-fase te beoordelen.

Embryoïde lichaamsgeneratie

De hangende druppelmethode werd gebruikt om embryoïde lichamen (EB's) te genereren. E14-cellen werden gedissocieerd en opnieuw gesuspendeerd in EB-medium in een concentratie van 1–1.5 x 10⁵ cellen/ml. EB-media met knock-out DMEM, 15% FBS, 1× MEM niet-essentiële aminozuren, 1× natriumpyruvaat en 0.1 mM 2-Mercaptoethanol [54]. Vervolgens werden 20 μl hangende druppels gedurende drie dagen gekweekt in het deksel van een schaal van 10 cm. Om te voorkomen dat de hangende druppel uitdroogt, is er 1× PBS onderin het deksel geplaatst. Na drie dagen werden EB's verzameld, overgebracht naar platen met ultralage adhesie (Corning, 3474) en nog eens 3 dagen in EB-media gekweekt. EB-monsters werden verzameld en vervolgens onderworpen aan qRT-PCR om de genexpressieniveaus te analyseren.

Teratoomvorming

Muizen werden gehuisvest en behandeld volgens de richtlijnen van het Animal Research Institute Committee van Tongji University, Shanghai, China. Voor teratoomvorming werden E14-cellen getrypsiniseerd om afzonderlijke cellen te produceren. Voor elk celtype een totaal van 1 × 10⁶ cellen werden geresuspendeerd in 100 μl EB-medium en subcutaan geïnjecteerd in de twee flanken van immunodeficiënte NOD-SCID 8 weken oude mannelijke muizen (n = 4 tumoren/groep). Vier weken na de inenting werden de teratomen geoogst en gewogen. Vervolgens werden deze teratomen verzameld in 4% PFA, ingebed in paraffine en in een microtoom in secties verdeeld. Secties van elk teratoom werden gekleurd met hematoxyline/eosine (H&E) en verder geanalyseerd.

Kwantitatieve real-time PCR (qRT‒PCR)

Totaal RNA werd geëxtraheerd uit WT- en Haspin-KO-mESC's, EB's en teratomen met behulp van TRIzol (Invitrogen, 10296010) volgens het protocol. Totaal RNA werd gekwantificeerd met behulp van een NanoDrop 2000 spectrofotometer (Thermo). Vervolgens werd reverse transcriptie naar cDNA uitgevoerd door de PrimeScript RT Reagent Kit met gDNA Eraser (Takara, RR047). qRT-PCR werd uitgevoerd met behulp van TB Green Fast qPCR Mix (Takara, RR430) met een reactievolume van 20 μl en het Bio-Rad CFX Connect-systeem (Bio-Rad). De relatieve mRNA-expressieniveaus werden genormaliseerd naar GAPDH en geanalyseerd met behulp van de 2-delta-delta-Ct-methode om de relatieve vouwverandering te berekenen. Primersequenties worden vermeld in de aanvullende tabel 1.

Immunofluorescentiekleuring

Voor immunofluorescentiekleuring werden cellen gekweekt op celkweekschalen met glazen bodem gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur gefixeerd met 30% paraformaldehyde. De monsters werden gedurende 0.2 minuten bij kamertemperatuur gepermeabiliseerd met PBST (100% Triton X-30). Vervolgens werden de cellen gedurende 5 uur bij kamertemperatuur geblokkeerd met 1% BSA. Vervolgens werden de monsters een nacht bij 4 ° C met primaire antilichamen geïncubeerd. Bovendien werden de monsters driemaal gewassen met PBST en gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met secundaire antilichamen en Hoechst 33342 (Invitrogen, H3570). Vervolgens werden de monsters driemaal bij kamertemperatuur in PBST gewassen en in het donker bewaard. De beelden zijn gemaakt met behulp van een Zeiss-LSM880 omgekeerde microscoop. Gegevens werden verwerkt met behulp van Zeiss-software en ImageJ-software.

Western blotting

Voor eiwitextractie werden mESC's gelyseerd met behulp van RIPA-buffer (Beyotime, P0013B) aangevuld met proteaseremmers (Beyotime, P1005) en fosfataseremmers (Beyotime, P1081), en vervolgens werden de lysaten 12,000 minuten gecentrifugeerd bij 4 rcf en 20 ° C. . De eiwitconcentratie van het supernatant werd bepaald met behulp van de BCA Protein Assay (Thermo, 23227) en vervolgens genormaliseerd. Gelijke hoeveelheden eiwitmonsters werden gescheiden met behulp van 15% SDS-PAGE-gels en vervolgens overgebracht naar 0.2 μm PVDF-membranen (Millipore, ISEQ00010). Membranen werden gedurende 5 uur bij kamertemperatuur geblokkeerd met TBST aangevuld met 1% BSA en vervolgens een nacht bij 4 ° C geïncubeerd met primaire antilichamen. Vervolgens werden de membranen driemaal gewassen met behulp van TBST, gevolgd door HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. De membranen werden zichtbaar gemaakt met het chemiluminescentiereagens ECL (Thermo, 34577).

RNA-seq en data-analyse

RNA werd geëxtraheerd uit Haspin-KO en controle-mESC's met behulp van TRIzol. Vervolgens werd 1 μg RNA bereid om een ​​sequentiebepalingsbibliotheek te genereren. Van bibliotheken werd de sequentie bepaald op de IIIumina NovaSeq 6000 (Berry genomics) volgens het protocol. Voor gegevensanalyse werden de getrimde waarden (met behulp van Cutadapt, v1.9.1) toegewezen aan het muisgenoom (mm10) met behulp van Hisat2 (v2.0.1). Differentieel tot expressie gebrachte genanalyse (DEG) werd uitgevoerd met behulp van DESeq2. De significante DEG's werden geïdentificeerd met P waarden <0.05 en vouwverandering >2, en vervolgens werd GOSeq (v1.34.1) gebruikt om termen van Gene Ontology (GO) te identificeren.

Dual-luciferase-reportertest

We amplificeerden fragmenten van de Wnt5a-promoter (~ 2 kb stroomopwaarts van de TSS) en Pax2 CDS, en vervolgens kloneerden we Wnt5a in de pGL3-luciferase-reportervector en Pax2 CDS in de CAG-eGFP-overexpressievector. mESC's werden gezaaid in platen met 24 putjes met een dichtheid van 2 x 10⁵ cellen/ml. De volgende dag werden Pax2-eGFP-, pRL-SV40-, pGL3-Basic- of pGL3-Wnt5a-promotor gecotransfecteerd in cellen met behulp van Lip2000 en 36 uur gekweekt. Aan de andere kant werden pRL-SV40 en pGL3-Wnt5a-promoter gecotransfecteerd in WT-cellen. Na 8 uur kregen de getransfecteerde cellen medium toegediend dat WT, DMSO, 0.5 μM CHR-6494 en 1 μM CHR-6494 bevatte, en 36 uur geïncubeerd. Vervolgens werden de cellen geoogst en gelyseerd om de luciferase-activiteit te meten volgens het protocol van de fabrikant (Promega, E1910).

chromatine immunoprecipitatie

Chromatine-immunoprecipitatie (ChIP)-testen werden uitgevoerd door de Magna ChIP A/G-kit (Millipore) volgens het protocol. In het kort werden mESC's verknoopt en vervolgens gesoniceerd in fragmenten van 200-500 bp, die vervolgens werden onderworpen aan immunoprecipitatie met antilichamen tegen Pax2 (Cell Signaling Technology, 9666) of IgG. Vervolgens werd het geprecipiteerde chromatine-DNA teruggewonnen en geanalyseerd met behulp van qRT-PCR-testen.

Antilichamen

De volgende primaire antilichamen werden gebruikt voor Western-blotting of immunofluorescentiekleuring: anti-H3T3ph (Abcam, ab130940), anti-H3S10ph (Abcam, ab14955), anti-GAPDH (Proteintech, HRP-60004), anti-caspase-3 (Cell Signaling Technologie, 9662S), anti-gesplitst caspase-3 (Cell Signaling Technology, 9664S), anti-α-tubuline (actief motief, 39527), anti-Nanog (Abcam, ab80892), anti-Sox2 (Abcam, ab79351), anti -Oct4 (Abcam, ab27985), anti-Klf4 (Abcam, ab129473), anti-Wnt5a (Abcam, ab235966) en anti-Pax2 (Cell Signaling Technology, 9666).

statistische analyse

Alle statistische gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± SEM. Elke test werd minstens drie keer herhaald en de resultaten werden geanalyseerd met SPSS 20.0. De statistische significantie tussen groepen werd bepaald met behulp van ongepaarde tweezijdige Student's t-toetsen. *P < 0.05, **P < 0.01 en ***P < 0.001 werden als statistisch significante verschillen beschouwd, en P > 0.05 werd als niet significant beschouwd.

• Door SEO aangedreven content en PR-distributie. Word vandaag nog versterkt.
• PlatoData.Network Verticale generatieve AI. Versterk jezelf. Toegang hier.
• PlatoAiStream. Web3-intelligentie. Kennis versterkt. Toegang hier.
• PlatoESG. Automotive / EV's, carbon, CleanTech, Energie, Milieu, Zonne, Afvalbeheer. Toegang hier.
• Plato Gezondheid. Intelligentie op het gebied van biotech en klinische proeven. Toegang hier.
• ChartPrime. Verhoog uw handelsspel met ChartPrime. Toegang hier.
• BlockOffsets. Eigendom voor milieucompensatie moderniseren. Toegang hier.
• Bron: https://www.nature.com/articles/s41420-023-01604-w