Muismodellen

Wildtype en transgene dieren die werden gebruikt om X-MET te genereren, werden gehuisvest in een kamer met temperatuurregeling (22 ° C) met een licht / donker-cyclus van 12 uur. Alle dierexperimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutional Review Board van de dierfaciliteiten van DIEM en het National Institute of Health-Italy (n° 609/2015-PR; n° 864/2020-PR) en gerapporteerd in overeenstemming met met de ARRIVE richtlijnen.

Primaire culturen en generatie van X-MET

Primaire spierkweek en generatie van X-MET werden uitgevoerd volgens het protocol beschreven in Carosio et al.¹⁸. Een heterogene celpopulatie werd verkregen door mechanische en enzymatische dissociatie van achterpoten die waren geoogst van wildtype muizen (WT) of transgene muizen met behulp van de Skeletal Muscle Dissociation Kit van Miltenyi Biotech. Gedissocieerde cellen werden gefilterd door een celzeef van 70 μm en 1200 minuten gecentrifugeerd bij 15 rpm. Cellen werden opnieuw gesuspendeerd in groeimedium (GM) (DMEM, 20% paardenserum, 3% kippenembryo-extract, 25 mM HEPES, 4 mM l-glutamine, 0.1% gentamicine, penicilline/streptomycine) en twee keer achter elkaar gedurende 30 minuten geplateerd om een ​​verrijking van myoblasten in de cultuur te krijgen. Cellen werden opnieuw gesuspendeerd en uitgeplaat in een concentratie van 40,000 cellen / ml op een weefselkweekschaal met een diameter van 35 mm bekleed met type I collageen (Sigma) en geïncubeerd bij 5% CO₂ bij 37°C. Na 5-6 dagen kweken werden myoblasten geïnduceerd om te differentiëren met behulp van een differentiatiemedium (DM: DMEM, 5% paardenserum, 25 mM HEPES, 4 mM l-glutamine, 0.1% gentamicine, penicilline/streptomycine). Na 2-3 dagen incubatie met DM wordt een monolaag van een primaire cel van de skeletspier gedelamineerd door een steriele tip voorzichtig rond het perifere gebied van de plaat te bewegen. De gedelamineerde monolaag werd vervolgens vastgepind op een met siliconen beklede schaal (Sylgard, Dow Corning, Midland, Michigan) met behulp van roestvrij stalen Minutiens-pennen met een diameter van 0.20 mm (Austerlitz INSECT PINS®). De X-MET werd op twee verschillende lengtes gespannen: + 0%, wat overeenkomt met de initiële delaminatielengte (niet-uitgerekte X-MET), en 66 ± 1.5% (+ 66%) van de initiële delaminatielengte (uitgerekte X-MET). Onder deze mechanische omstandigheden werd X-MET na 15 dagen kweken geanalyseerd op morfologisch, functioneel en moleculair niveau. Over het algemeen vertoont X-MET een zelfgeorganiseerde cilindrische structuur die kloppende myotubes bevat en vertoont gemiddeld een diameter van 200 ± 12 mm en een lengte (na uitrekken) van 2 ± 0.5 cm.

X-MET metingen van mechanische eigenschappen

Eerst werd de passieve kracht die door het weefsel tijdens het strekken werd gegenereerd, gemeten met behulp van een actuator/transducer (Aurora Scientific Inc. 300B) voor lengteregeling en een microkrachttransducer (Kronex AE801). Een software ontwikkeld in LabVIEW 2019 maakte de synchronisatie tussen het reksignaal en de krachtmeting mogelijk, evenals de instellingen van de testparameters. Uitgaande van de initiële delaminatielengte van het weefsel, werd de X-MET uitgerekt met 66 ± 1.5% met een constante snelheid van 1 cm/min en tegelijkertijd werd de door het weefsel gegenereerde passieve kracht gemeten. Vervolgens werd de X-MET spontane samentrekkingskracht gemeten 15 dagen na de delaminatie van het construct voor zowel de niet-uitgerekte als de uitgerekte X-MET-condities. In detail werd het ene uiteinde van het weefsel gefixeerd gehouden door de pinnen en het andere uiteinde was verbonden met een microkrachttransducer (Kronex AE801). Spiercontractiele activiteit werd gedurende 15 seconden verkregen via een data-acquisitiebord van National Instruments (DAQ NI-PCI 6251) en een software die ad hoc werd ontwikkeld in Labview 2019. De frequentie van spontane contractie werd vervolgens berekend via de Fast Fourier Transform (FFT). Gedurende de gehele duur van de krachtmetingstest werd de X-MET in een kweekschaal met differentiatiemedium geplaatst en op een temperatuur van 37 °C gehouden met behulp van een temperatuurcontroleplaat (Okolab srl, H401).

RNA-extractie en real-time PCR

Totale RNA-extractie werd uitgevoerd met behulp van TriReagentTM (SIGMA) en één microgram van elk RNA-monster werd opnieuw getranscribeerd met behulp van de QuantiTec Reverse Transcription Kit (QIAGEN) om dubbelstrengs cDNA te verkrijgen. Relatieve kwantitatieve PCR werd uitgevoerd op ABI PRISM 7500 SDS (Applied Biosystem, VS), met behulp van vooraf gemaakte 6-carboxyfluoresceïne (FAM)-gelabelde TaqMan-assay voor Hprt, Cx-43, TNNT2, β-MHC, PDE1C, IL-6, IL- 2, IL-4, IL-10, CCL2, COL3A1, CACNA 1C, RyR 2, α-MHC, ANP en BNP (Applied Biosystem, VS). De relatieve kwantitatieve RT-PCR-monsterwaarde werd genormaliseerd voor de expressie van Hprt-mRNA. Om miR-1 en miR-29b te analyseren, werd geëxtraheerd RNA teruggeschreven met behulp van micro-RNA Reverse Transcription KIT (Applied Biosystem). Relatieve kwantitatieve PCR werd uitgevoerd op ABI PRISM 7500 SDS (Applied Biosystem, VS), met behulp van vooraf gemaakte 6-carboxyfluoresceïne (FAM)-gelabelde TaqMan-assay voor miR1 (Applied Biosystem, VS). De relatieve kwantitatieve RT-PCR-monsterwaarde werd genormaliseerd voor de expressie van U6 snRNA.

RNA-seq-analyse

RNA werd geïsoleerd met Trizol uit uitgerekte X-MET's na 15 dagen in DM, niet-uitgerekte X-MET's en 2-dimensionale primaire cellen. Eén microgram RNA werd naar het Institute of Applied Genomics (Udine, Italië) gestuurd voor diepe sequencing. cDNA-bibliotheken werden dienovereenkomstig verwerkt met het standaard Illumina-protocol en gesequenced met de HiSeq2500 (4-plex run, 1 x 50 bp aflezingen, ongeveer 30 M aflezingen/monster). Lezingen werden uitgelijnd met de UCSC mm10-versie van het muizengenoom met behulp van Tophat2 (⁴⁰;v2.1.1), gekwantificeerd met HTSeq-count (⁴¹; v0.5.4p5). Differentiële expressie-analyse werd uitgevoerd in R (v3.5.1) met behulp van DESeq2 (⁴¹; v1.20.0). Telgegevens van alle condities werden gefilterd op basis van hun onbewerkte telling, waarbij alleen die werden behouden waarvan de som van de tellingen voor alle monsters hoger was dan 1. Principal Component Analysis (PCA) was gebaseerd op de 42% meest variante genen tussen de verschillende monsters. Genen werden beschouwd als differentieel tot expressie gebracht met Benjamini-Hochberg aangepaste p-waarde (FDR) <0.01.

Immunofluorescentie-analyse

Immunofluorescentieanalyse werd uitgevoerd op X-MET's dwars- en lengtedoorsneden. X-MET's werden ingebed in weefselbevriezingsmedium en snel ingevroren in stikstofgekoeld isopentaan. Monsters werden op een cryostaat gemonteerd en in secties van 10 μm dik gesneden. De sectie werd gefixeerd met 4% PFA, gewassen in PBS met 1% BSA en 0.2% Triton X-100, gedurende 1 uur voorgeïncubeerd in 10% geitenserum bij kamertemperatuur en overnacht geïncubeerd bij 4 °C met de volgende primaire antilichamen: Myosin Heavy Chain (MyHC) (Sigma-Aldrich), Connexin-43 (Cx-43) (Sigma-Aldrich) en cardiaal troponine (Troponin I) (RV-C2 Hybridoma Bank). Secties werden vervolgens gewassen in PBS met 0.2% Triton X-100 en 45 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd met secundair antilichaam (Alexa Fluor, Life Technologies). Kernen werden gekleurd met behulp van Pibenzimol bisbenzimide H33342 (HOECHST). Alle analyses werden uitgevoerd met Zeiss Confocal-software (Zen 3.0 Blue-editie).

Kleurstof overdracht techniek

De X-MET werd 2 keer gewassen met calcium- en magnesiumvrije PBS. Een mengsel van Lucifer geel CH (0.2 mg/ml) (Molecular Probes) en rhodamine dextran (0.5 mg/ml) (Molecular Probes) verdund in differentiatiemedium werd bereid. Om de kleurstoffen de cellen te laten binnendringen, werd het construct op een objectglaasje geplaatst dat eerder was geprepareerd om de X-MET levensvatbaar te houden en een 'dubbele incubatiekamer' te creëren: in de kamer met een uiteinde van het X-MET-construct 50 µl van het hierboven gedetailleerde mengsel werd toegevoegd, terwijl in de kamer met het andere uiteinde differentiatiemedium werd toegevoegd om het weefsel nat te houden. De X-MET werd zo gedurende 10 minuten geïncubeerd bij 37 ° C, 5% COXNUMX₂, driemaal gewassen met PBS en vervolgens geanalyseerd met confocale microscopie. Om de levensvatbaarheid van X-MET te verifiëren en de overdracht van de kleurstof te volgen, werd een time-lapse-analyse uitgevoerd. Afbeeldingen werden verkregen met een Leica confocale microscoop (laserscanning TCS SP2) uitgerust met Ar / ArKr- en HeNe-lasers, met behulp van een 10X-objectief. De laserlijn was 488 nm voor de excitatie van Lucifer geel en 633 nm voor de excitatie van rhodamine dextran. Fluorescentie werd verzameld bij 500/540 nm voor Lucifer geel en bij 640/680 nm voor rhodamine dextran. De fluorescentie-intensiteit werd berekend met behulp van Leica-software.

Bepaling van intracellulaire calciumspiegels

FURA-2AM indicator_ Voor het bepalen van het intracellulaire calcium [Ca²⁺]i Voorbijgaand, X-MET niet uitgerekt (X-MET 0%) en X-MET uitgerekt op 66% van de initiële delaminatielengte (X-MET 66%) werden gekweekt op schalen van 35 mm en geïncubeerd in kweekmedium dat 3.5 μmol/ L 2-[6-[bis[2-[(Acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl]amino]-5-[2-[2-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl]amino ]-5-methylfenoxy]ethoxy]-2-benzofuranyl]-5-oxazoolcarbonzuur (acetyloxy)methylester (FURA-2-AM, Invitrogen, Carlsbad, Californië, VS) gedurende 30 minuten bij 37 °C. Vervolgens werd het medium gespoeld met Hank's gebalanceerde zoutoplossing (Sigma-Aldrich, St.Louis, Missouri, VS). Gerechten werden in een kweekkamer geplaatst op de steun van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop (Nikon TE2000E, Nikon Instruments, Italië), bij 37 ° C verbonden met een gekoelde camera met ladingsgekoppelde apparaten (12B cascade, Roper Scientific, Ottobrunn, Duitsland). Monochromator met willekeurige toegang werd gebruikt om monsters afwisselend te verlichten bij 340 en 380 nm (Photon Technology International, New Jersey, VS) en de emissie werd gedetecteerd met behulp van een emissiefilter van 510 nm. Metafluor®-software (Universal Imaging Corporation, Downington PA, VS) werd gebruikt om afbeeldingen te verkrijgen. Aan het einde van elk experiment werd kalibratie verkregen door de intracellulaire Ca maximaal te verhogen²⁺-afhankelijke FURA-2-AM fluorescentie met 5 μmol / L ionomycine (ionomycine calciumzout van Streptomyces conglobatus, Sigma) gevolgd door registratie van minimale fluorescentie in een Ca²⁺-vrij medium⁴².

INDO-1AM indicator_INDO-1 AM (Invitrogen I1226) werd gereconstitueerd in vers geopende DMSO van hoge kwaliteit in een concentratie van 1 mM en gebruikt in een eindconcentratie van 100 μM in Ca²⁺/Mg²⁺ gratis PBS. Eenmaal gereconstitueerd, werd het beschermd tegen licht en bewaard bij -20 ° C om vries-dooi te voorkomen. De monsters (X-MET's 0% 15 DM en X-MET's 66% 15 DM) werden driemaal gewassen in PBS. Vervolgens werd INDO-1 AM langzaam langs de spierconstructies toegevoegd en werden de monsters gedurende 30 minuten bij 37 °C geïncubeerd. Aan het einde werden de X-MET's driemaal gewassen met PBS en werden ze geanalyseerd met confocale microscopie. De detectie werd uitgevoerd rekening houdend met de dubbele emissie van INDO-1 die verschuift van 475 nm in Ca²⁺-vrije media tot 400 nm wanneer de kleurstof verzadigd is met Ca²⁺⁴³. Alle analyses zijn uitgevoerd met Zeiss Confocal-software (Zen 3.0 Blue-editie)⁴³.

Eiwitextractie en Western Blot

Monsters werden gehomogeniseerd in lysisbuffer (Tris-HCL, pH 7.5/20 mM, EDTA/2 mM, EGTA/2 mM, Sucrose/250 mM, DTT/5 mM, Triton-X/0.1%, PMSF/1 mM, NaF /10 mM, SOV4/0.2 mM, Cocktail Protease Inhibitors/1x (Sigma-Aldrich). Gelijke hoeveelheden eiwit (70 μg) van elk lysaat (eerder gekwantificeerd via Bradford-assay) werden gescheiden in SDS-polyacrylamidegel (4-15% CriterionTM TGX Stain-FreeTM Protein Gel, Bio-Rad) en overgebracht naar een nitrocellulosemembraan (Trans-Blot Turbo transfer pack, Bio-Rad) met behulp van Trans-Blot® TurboTM Transfer System (programma: 2.5 A, 25 V, 20 min). Het membraan werd vervolgens gekleurd met Ponceau (0.005% in 1% azijnzuur) als een tussentijdse beladingscontrole, vervolgens geblokkeerd met 5% magere melkpoeder in TBS-1% Tween gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en vervolgens overnacht geïncubeerd bij 4 uur per dag. °C met een primair antilichaam voor Cx-43 (Sigma-Aldrich).Het membraan werd daarna vier keer gewassen gedurende 5, 15, 15 en 5 min in TBS-1% Tween, daarna geïncubeerd met een specifiek peroxidase-geconjugeerd secundair antilichaam voor 45 min bij kamertemperatuur. Na drie wasbeurten van 10 minuten met TBS-1% Tween werd het membraan geanalyseerd door het verbeterde chemiluminescentiesysteem (ChemiDoc Imaging System, Bio-Rad) volgens de aanwijzingen van de fabrikant. Het verkregen signaal werd gekwantificeerd door densitometrie te scannen met behulp van een bio-beeldanalysesysteem (Image LabTM Software). De resultaten worden uitgedrukt als relatieve geïntegreerde intensiteit in vergelijking met controles (GAPDH), na aftrek van hun respectieve achtergronden.

AFM experimentele opzet en data-analyse

De elasticiteitsmetingen werden uitgevoerd met behulp van de Bruker Dimension Icon Atomic Force Microscope (Bruker, Santa Barbara, CA) uitgerust met de sondehouder om in een vloeistofomgeving te werken. De monsters werden vastgepind in een petrischaaltje bedekt met een laag PDMS om de pinnen op hun plaats te houden, tijdens de gehele metingen werden de monsters niet aan het PDMS-oppervlak gehecht. De metingen werden uitgevoerd in fysiologische buffer met behulp van MLCT-BIO-tips van Bruker, met elastische constanten (gekalibreerd in lucht, met de thermal tune-methode⁴⁴, voordat elk experiment begint) dat volgt in het bereik van 0.0065 ± 0.0005 N/m. Elk monster is gemeten door middel van Force Volume-kaarten van 16 × 16 krachtcurven, met een snelheid van 3 krachtcurven per seconde, in verschillende gebieden van elk 100 micron in het kwadraat. Een voorafgaande handmatige selectie (door zichtbare inspectie) van de krachtkrommen is gedaan met behulp van de Bruker NanoScope Analysis-software (Bruker, Santa Barbara, CA), om de krommen uit te sluiten van de analyse die een signaal vertonen dat wordt verstoord door de samentrekking van het monster. De kalibratiewaarde voor stijfheid (ook wel detectorgevoeligheid genoemd) is verkregen uit het verkrijgen van krachtcurven op een ongerepte petrischaal. Na deze voorbereidende stappen werden de krachtcurven geanalyseerd met behulp van de FC_analysis-software, waarvan de volledige werking wordt beschreven in Dinarelli et al.⁴⁵. De Young's moduluswaarde is verkregen door de curven te passen met een Hertiaans model door de Poisson-verhouding van de monsters te beschouwen als 0.5 en een conische punt met een halve openingshoek van 35°. Het totale aantal krachtcurven dat in de analyse is opgenomen, is respectievelijk 700 en 1200 voor de niet-uitgerekte X-MET en uitgerekte 66% X-MET. De statistische en grafische uitwerkingen zijn uitgevoerd met behulp van de software Origin (OriginLab, Northampton, MA).

X-MET implantatie op myocardinfarct

Drie maanden oude C57BL/6J-muizen werden verdoofd met isofluraan (IsoFlo®) 1.35% + 2% O₂. Onder microscopisch beeld voerden we een middellijn cervicale incisie uit die de huid, spieren en weefsels die de luchtpijp bedekten scheidde. We hebben de endotracheale tube ingebracht die het craniale deel van de luchtpijp vasthoudt met behulp van een microchirurgische pincet. De ademhalingsfrequentie was ongeveer 110 per minuut, met een inspiratiedruk van 17 tot 18 cm H₂O. Daarna werd de occlusie van de linker anterieure dalende (LAD) slagader uitgevoerd met behulp van een permanente 8-0 prolene hechtdraad (Ethicon, Norderstedt, Duitsland), met siliconenslang (1 mm OD) bovenop de LAD geplaatst, 2 mm onder de grens tussen het linker atrium en LV⁴⁶. Tijdens de operatie werden muizen gecontroleerd met een rectale sonde om de lichaamstemperatuur tussen 36.8 en 37.2 °C te houden met behulp van een warmtekussen. De borstkas werd horizontaal doorgesneden ter hoogte van de vierde intercostale ruimte. Uiteindelijk werd het ene uiteinde van de X-MET gefixeerd door een tweede ligatieknoop op de plaats van de beschadiging op hetzelfde moment van de LAD-ligatieoperatie. De implantatie werd uitgevoerd waarbij ervoor werd gezorgd dat de plaats van de beschadiging volledig werd bedekt door de X-MET-constructie en de procedure werd voltooid door het pericardium voorzichtig boven de hartwand te verplaatsen. Vervolgens werd de borstkas gesloten met behulp van 5-0 polypropyleen hechtdraad. X-MET's werden verkregen van C57BL/6J bloedverwante muizen en UBC/GFP-muizen, exclusief het gebruik van immunosuppressiva. Veertig en honderd dagen na LAD werden echocardiografische en histologische analyses uitgevoerd om ischemie en myocardiale remodellering te beoordelen.

Histologische analyse

Hele harten werden gefixeerd met 10% formaline en doorgesneden met intervallen van 1 mm. Elk objectglaasje had 10 secties, die begonnen bij de top en eindigden bij de hechtingsplaats (ongeveer 6 objectglaasjes). Elk objectglaasje werd gekleurd met Masson's trichroom om gebieden met fibrose te identificeren of gekleurd met hematoxyline en eosine (H&E). Om de integriteit van het spiervezelmembraan te evalueren, kregen muizen de intraveneuze (iv) injectie van Evans blauwe kleurstof (EBD, 10 mg/ml, Sigma) in PBS in een dosis van 0.1 mg/g lichaamsgewicht. Elke experimentele muis onderging 20 minuten continu zwemmen na kleurstofinjectie. Spiermonsters werden 24 uur na injectie verzameld. EBD bindt aan albumine en werd waargenomen onder de fluorescentiemicroscoop.

Echocardiografische analyse

Een hoogfrequent digitaal beeldvormingsplatform met hoge resolutie met lineaire array-technologie en Doppler-kleurenmodus voor in vivo microbeeldvorming met hoge resolutie werd gebruikt voor echocardiografie (Vevo® 3100 Imaging System, FUJIFILM VisualSonics Inc., Toronto, Canada). Om de cardiovasculaire functie van muizen te beoordelen, werd een hoogfrequente transducersonde (VisualSonics MS400, FUJIFILM VisualSonics, Inc., Toronto, Canada met een frequentiebereik van 18-38 MHz) gebruikt door een bekwame cardioloog onder toezicht van een dierenarts. 4-5 weken na de operatie werden muizen verdoofd met (IsoFlo®) 1.35% + 2% O₂ geschoren en geplaatst op een elektrisch verwarmd oppervlak. Ventriculaire wanddiktes en diameters werden bestudeerd door middel van M-mode echocardiografie en fractionele verkorting werd berekend. De lichaamstemperatuur van muizen werd gecontroleerd met behulp van een rectale sonde en de hartslag werd gebruikt als een validatieparameter, waarbij bradycardiemuizen (dwz < 400 bpm) uit de studie werden uitgesloten. Nadat de functionele karakterisering was voltooid, werd de verdoofde muis geëuthanaseerd door cervicale dislocatie en werd weefsel geoogst voor histologische en biochemische analyse.

statistische analyse

Statistische analyse werd uitgevoerd met GraphPad Prism Software. Alle gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM Volgens de verschillende geanalyseerde gegevens werden de volgende statistische analyses uitgevoerd: niet-parametrische tests (Mann Whitney Rank Sum-test) en 1-weg ANOVA-test (Bonferroni post-hoc-test, Tukey's meervoudige vergelijkingstest en Fisher's LSD-test). De verschillen werden als significant beschouwd voor p-waarde ≤ 0.05 (*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001).

• Door SEO aangedreven content en PR-distributie. Word vandaag nog versterkt.
• PlatoData.Network Verticale generatieve AI. Versterk jezelf. Toegang hier.
• PlatoAiStream. Web3-intelligentie. Kennis versterkt. Toegang hier.
• PlatoESG. Automotive / EV's, carbon, CleanTech, Energie, Milieu, Zonne, Afvalbeheer. Toegang hier.
• BlockOffsets. Eigendom voor milieucompensatie moderniseren. Toegang hier.
• Bron: https://www.nature.com/articles/s41598-023-37553-8