Verzameling van patiëntenmonsters

Patiëntmonsters werden verzameld door de achterkant van de keel (orofaryngeaal uitstrijkje) van patiënten af ​​te nemen, zoals eerder beschreven²⁶. De monsters werden verzameld van patiënten met het COVID-19-achtige klinische beeld en werden na nucleïnezuurextractie getest met qRT-PCR. In het kort werden de uitstrijkjes na afname in een gelabeld monsterbuisje geplaatst dat een lysisbuffer bevatte (4 M guanidinethiocyanaat, 25 mM Tris-HCl, 0.5% β-mercaptoethanol en MS2 RNA (200 ng µl^-1; Roche)). De buis werd voorzichtig geschud om een ​​gelijkmatige verdeling van de lysisbuffer te verzekeren. De veiligheidsstappen zijn eerder beschreven en uitgevoerd in een gecertificeerd CL2-laboratorium²⁶.

Nucleïnezuurextractie

Het totale nucleïnezuur werd geëxtraheerd met behulp van op spinkolom gebaseerde systemen en zoals gebruikt door gestandaardiseerde qRT-PCR-testen²⁶. De interne versterkingsregeling (MS2 (~6 × 10⁴ PFU ml^-1) per 10 ml lysisbuffer) toegevoegd aan de aanvullende lysisbuffer (25 µl per 10 ml lysisbuffer). Het monster werd geëlueerd in 100 µl nucleasevrij water (nfH₂O; Invitrogen) en 1 minuut laten staan ​​alvorens 1 minuut te centrifugeren bij 21,130×g (15,000 tpm) in een tafelmodel microfuge. De geëlueerde monsters werden direct onderworpen aan qRT-PCR. De resterende nucleïnezuurextracten werden bewaard bij -80 ° C en verder gebruikt voor detectie van nanobait-nanoporiën.

qRT-PCR voor SARS-CoV-2

SARS-CoV-2-detectie werd uitgevoerd zoals eerder beschreven²⁶. Per reactie bevatte het mastermengsel 12.5 µl 2× Luna Universal Probe One-Step reactiemengsel, 0.5 µl 20 µM Wu forward primer (5′-ATGGGTTGGGATTATCCTAAATGTGA-3′), 0.5 µl 20 µM Wu reverse primer (5′ -GCAGTTGTGGCATCTCCTGATGAG-3′), 0.3 µl 10 µM MGB Probe 3 fluoresceïne (5′-ATGCTTAGATTATGGCCTCAC-3′), 0.5 µl 10 µM interne controle forward primer voor MS2 RNA, 0.5 µl 10 µM interne controle reverse primer voor MS2 RNA, 0.3 µl 10 µM interne sonde (MS2 ROX), 1 µl Luna WarmStart RT Enzyme Mix en 3.9 µl nfH₂O. Vervolgens werd 20 µl van het mastermengsel verdeeld in elk putje van een plaat met 96 putjes en vervolgens gecombineerd met 5 µl van elk extract. De MS2 interne extractie- en amplificatiecontrole die het volledige extractieprotocol onderging, werd opgenomen als de negatieve extractiecontrole in minimaal twee wells op de qRT-PCR-plaat. Om mogelijke verontreiniging in het qRT-PCR-proces te bepalen, 5 µl nfH₂O werd opgenomen als de qRT-PCR negatieve controle. Vervolgens werd 5 µl verrijkt SARS-CoV-2-template-plasmide in een enkel putje opgenomen als de positieve qRT-PCR-controle. Na toevoeging van 5 µl van elk monster aan het daarvoor bestemde putje, werd de plaat verzegeld met een optisch heldere plastic verzegeling. De plaat werd gedurende 1 minuut bij 2,000 x gecentrifugeerdg (1,000 rpm) bij 4 °C en vervolgens in de qRT-PCR-machine (QuantStudio, Thermo Fisher Scientific) geplaatst en de run werd geparametriseerd. Signalen voor fluoresceïne (FAM) en carboxyrhodamine (ROX) werden verkregen. ROX werd gebruikt om de interne MS2-controle te detecteren en fluoresceïne werd gebruikt om SARS-CoV-2-RNA te detecteren. De assay werd uitgevoerd gedurende 2 minuten bij 25 °C, 15 minuten bij 50 °C (voor de reverse transcriptase), 2 minuten bij 90 °C, vóór 45 cycli van 95 °C gedurende 3 seconden gevolgd door 60 °C gedurende 30 seconden . De resultaten werden bepaald door de bevestiging van correcte positieve controles (amplificatie van het plasmide), extractie- en amplificatiecontroles van alle monsters (ROX-kanaal), geen amplificatie in de negatieve controles en consistente gemiddelde waarden van controles. SARS-CoV-2-positiviteit werd bevestigd door amplificatie in het fluoresceïnekanaal met een geschikte sigmoïdale curve met een CT-waarde van ≤36. De CT-waarden van MS2 en MGB-sonde 3 werden gehandhaafd om de kwaliteit en reproduceerbaarheid van de assay te volgen⁴⁴.

Programmeerbare RNase H-cutting voor nanobait

Voor detectie van nanoporiën werden SARS-CoV-2 RNA-controles, nucleïnezuurextracten (patiëntmonsters) of MS2 viraal RNA verder gebruikt voor detectie met nanobait. Eerst mengden we geleide-oligo's met het monster en verwarmden het gedurende 70 minuten tot 5 ° C. RNase H (5,000 eenheden per ml; NEB) werd toegevoegd, gemengd en gedurende 20 minuten bij 37 ° C verwarmd om het enzym in staat te stellen RNA in de DNA: RNA-hybride te knippen die het doel-RNA effectief vrijgeeft. RNase H werd thermisch geïnactiveerd door incubatie bij 65 ° C gedurende 10 minuten. Gidsoligo's werden gevalideerd om geen intramoleculaire structuren, homo- of heterodimeren te vormen met behulp van de NUPACK-software⁴⁵. Voor de meting met het afwezige doel werd hetzelfde protocol gebruikt inclusief gidsoligo's. De controlemetingen laten geen verplaatsing zien en daarom kunnen we elke substantiële kruisbinding van geleide-oligo's uitsluiten.

Virale doelsequentie-eigenschappen voor nanobait

De lengte van het doelwit, de lengte van de steun en het GC-gehalte werden geselecteerd om een ​​optimale hybridisatie te garanderen²¹. Voor de DNA-nanobait-ontwerpen werden de doelsequenties geselecteerd om zich in de geconserveerde gebieden van een viraal genoom te bevinden en hadden ze een GC-gehalte van 40-60% om een ​​stabiele duplex van 20 bp te vormen. De lengte van de teensteun werd gekozen om 6 nt lang te zijn en een GC-gehalte van 40-60% te hebben. We hebben alle sequenties getest op mogelijk ongewenste zeer stabiele intramoleculaire interacties of homodimeren met behulp van de NUPACK-software (webapplicatie 2020)⁴⁵. Vervolgens hebben we een kruisreactiviteitscontrole uitgevoerd tussen meerdere sites die in elk experiment werden gebruikt⁴⁵.

Bereiding van DNA-bloem voor nanobait

We hebben een DNA-bloem ontworpen als een ander label voor SARS-CoV-2 RNA-detectie van de patiëntmonsters. Drie DNA-bloemen specifiek voor elk SARS-CoV-2-doelwit (zevenwegverbindingen, 7WJa, 7WJb en 7WJc) werden afzonderlijk bereid. Met 7WJc als voorbeeld, 4 μM DNA-streng J1, J2, J3 en J4c (aanvullende tabel 1) werden met elkaar gemengd in TM-buffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, pH 8.0) en verwarmd tot 90 °C gedurende 5 min, daarna afgekoeld tot 65 °C gedurende 15 min, 45 °C gedurende 15 min, 37 °C gedurende 20 min, 25 °C gedurende 20 min en ten slotte tot 4 °C C gedurende 20 minuten. Strand J4c werd vervangen door J4b om 7WJb te bereiden. Voor 7WJa, om zelfvouwen op locatie 43 op de nanobait te voorkomen, werden J1, J2, J3 J4a en C43 vóór het uitgloeien met elkaar gemengd.

Zelfassemblage van DNA-nanobait

De DNA-nanobait werd samengesteld door gelineariseerd enkelstrengs M13-DNA (M13mp18, 7,249 nt, Guild Biosciences, 100 nM) te mengen met korte complementaire oligonucleotiden¹² (waarvan sommige referentiestructuren en vangstrengen herbergden) en door gedeeltelijk complementaire strengen toe te voegen die 3'-gebiotinyleerd waren voor door teen vastgehouden strengverplaatsingsreactie. Het gelineariseerde M13-DNA (7,228 nt lang) werd aangevuld met oligonucleotiden, waardoor een geknikte dubbelstrengige nanobait ontstond met twee-terminale vier deoxythymidine-overhangen die multimerisatie voorkomen¹². Het mengsel bevatte 20 nM gelineariseerd M13-DNA, 60 nM oligonucleotiden (drie keer meer dan M13-DNA), 3′-gebiotinyleerde strengen in een concentratie van 180 nM, 10 mM MgCl₂ en 1 × TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0). Het werd gemengd door middel van pipetteren en gecentrifugeerd voordat het gedurende 70 seconden werd verwarmd tot 30 ° C en gedurende 45 minuten werd afgekoeld tot omgevingstemperatuur. Overtollige oligonucleotiden werden verwijderd met behulp van Amicon Ultra 0.5 ml centrifugaalfilters met een grenswaarde van 100 kDa met een wasbuffer (10.0 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM MgCl₂). Als DNA-bloemen als label werden gebruikt, werden de gedeeltelijk complementaire strengen die het dragen, geïncubeerd in 10 mM MgCl₂ gedurende 2 uur bij omgevingstemperatuur en vervolgens werd Amicon-filtratie uitgevoerd zoals hierboven beschreven. De asymmetrie van het nanobait-ontwerp maakt de ondubbelzinnige identificatie van de bindingsplaatsen mogelijk. Het nanobait werd bewaard totdat het werd gebruikt voor verdere experimenten onder 4-10 ° C in 0.5 mM MgCl₂, 10.0 mM Tris-HCl, pH 8.0. Het nanobait-ontwerp werd vóór elke meting gecontroleerd door nanopore-uitlezing.

Nanopore-uitlezing van DNA-nanobait

Het nanobait werd gemengd met een monster (nucleïnezuurextract of gezuiverde virale doelwitten met een overmaat van tien keer) in 10 mM MgCl₂ en 100 mM NaCl. Het mengsel (5 μl) werd bij kamertemperatuur (~ 10 min) geïncubeerd totdat het was voorbereid voor nanopore-meting. Het verschil in de samenstelling van de doelwitsequentie en de fysieke kenmerken ervan kunnen leiden tot variabiliteit in hybridisatie en dus tot de verplaatsingsefficiëntie van detectieplaatsen²¹. We hebben htRNA (100 ng μl^-1; Invitrogen) als achtergrond waar aangegeven, om aan te tonen dat er geen niet-specifieke signalen worden geïnduceerd door menselijke natieve RNA's. Voor nanopore-meting werd het monster verdund tot <0.5 nM nanobait (voor gezuiverde virale doelen) of 4.7 μl RNase-H-gesneden patiëntmonster werd gemengd met 0.3 μl monovalent streptavidine (SAe1D3)¹⁸ (1 μM), 5 μl LiCl (4.0 M) en 5.0 μl LiCl (8.0 M). We hebben 14 ± 3 nm (gemiddelde ± standaarddeviatie) nanoporiën vervaardigd¹² met behulp van kwartsglazen capillairen met een buitendiameter van 0.5 mm en een binnendiameter van 0.2 mm (Sutter Instrument) door laserondersteunde trekker P-2000 (Sutter Instrument). Het mengsel werd gepipetteerd in een polydimethylsiloxaanchip met nanoporiën en alle metingen werden uitgevoerd bij een constante spanning van 600 mV. Nanopore-meetdetails worden weergegeven in de aanvullende tabel 30.

Realtime data-analyse van nanoporiën

Nanopore-gegevensanalyse wordt in detail uitgelegd in de aanvullende sectie 14. In het kort werden nanobait-gebeurtenissen gefilterd uit ruwe ionische stroomsporen en vervolgens werd het detectiegebied bepaald en werd informatie over de aanwezigheid van de spike op elke specifieke locatie geëxtraheerd. De uitgezette verplaatsingsefficiëntie werd berekend als een verplaatsingsefficiëntie voor een meting afgetrokken van een controle zonder doel voor elke locatie (50 nanobait-gebeurtenissen voor elk van de drie nanopore-opnamen), tenzij anders vermeld:

We hebben geverifieerd dat het convolutionele neurale netwerk QuipuNet²⁷ was in staat tot real-time analyse van nanopore-gegevens volgens de beschreven procedure. Eerder hebben we aangetoond dat we met ongeveer tien gebeurtenissen 99% vertrouwen bereiken in een positieve detectie van onze ontworpen DNA-structuren⁴⁶.

AFM-beeldvorming

AFM (Nanosurf Mobile S) beeldvorming van nanobaits werd uitgevoerd in de lucht in de contactloze modus. De nanobait-structuren werden verdund tot 1 ng μl^-1 in 1 mM MgCl₂ en 10 μl werd toegevoegd aan vers gekliefd mica, gedurende 1 minuut geïncubeerd, gespoeld met gefilterd Milli-Q-water en vervolgens geföhnd met stikstof. Voorafgaand aan het scannen werd de micaplaat met dubbelzijdig plakband op de AFM-monstertafel bevestigd. Beeldvisualisatie en -analyse werden uitgevoerd met behulp van Gwyddion (versie 2.60).

statistische analyse

Voor alle metingen werden 99.9% betrouwbaarheidsintervallen voor verplaatsingsefficiënties berekend. Statistische significantie tussen twee sites zonder en met het doelwit werd getest met behulp van een tweezijdige Student's t-test.

Rapportage samenvatting

Nadere informatie over onderzoeksontwerp is beschikbaar in de Samenvatting van de rapportage over de natuurportfolio gekoppeld aan dit artikel.

• Door SEO aangedreven content en PR-distributie. Word vandaag nog versterkt.
• Platoblockchain. Web3 Metaverse Intelligentie. Kennis versterkt. Toegang hier.
• Bron: https://www.nature.com/articles/s41565-022-01287-x