Constructie van plasmiden

De volledige aminozuursequentie van elke geconstrueerde receptor wordt getoond in aanvullende informatie (aanvullende figuur XNUMX). 1). Een ruggengraatplasmide pMK-stuffer-IPTG²⁵ werd gebruikt voor retrovirale infectie, waarbij de interne ribosomale ingangsplaats (IRES; I) wordt gebruikt voor co-expressie van de genen die coderen voor een puromycine (P) -resistentie, een zelfsplitsend T2A-peptide (T) en een verbeterd groen fluorescentie-eiwit (EGFP; G). Het open leesraam dat codeert voor elke receptorsequentie werd geamplificeerd met PCR en ingevoegd in pMK-stuffer-IPTG met behulp van In-fusion HD Cloning Kit (TakaraBio). Subklonering, amplificatie en sequentiëring van elk plasmide werden uitgevoerd volgens een standaardprotocol.

Voor de constructie van een motiefbibliotheek kozen we voor digestie/ligatieprocedures als een betrouwbare methode. NNS-codons werden toegewezen in een PCR-primer om 3 aminozuurresiduen stroomafwaarts van het tyrosine van het STAT1-bindende motief te randomiseren. De gerandomiseerde DNA-fragmenten werden gegenereerd door PCR met behulp van pMK-F1-IPTG, dat codeert voor de gemanipuleerde receptor met het STAT1-bindende motief, als matrijs, gesplitst met EcoRI en ClaI, en geligeerd aan pMK-F1-IPTG gedigereerd met dezelfde enzymen om pMK-F1lib-IPTG op te leveren. MegaX DH10B T1R Electrocomp-cellen (ThermoFisher Scientific) werden geëlektroporeerd met pMK-F1lib-IPTG (100 ng) met behulp van Gene PulserII (Bio-Rad) ingesteld op 2.0 kV, 200 Ω en 25 µF. Alle E. coli cellen werden uitgeplaat op een LB-plaat van groot formaat om ervoor te zorgen dat een voldoende aantal antibioticaresistente kolonies werden verkregen die de theoretische grootte van de DNA-bibliotheek overschreden (3.3 x 10).⁴) van de 3 gerandomiseerde aminozuurmutaties gecreëerd door gedegenereerde NNS-codons. De kolonies werden geoogst om plasmiden te extraheren met behulp van QIAGEN Plasmid Midi Kit (Qiagen).

Klonale vectortransductie

Voor transductie van Ba/F3-cellen (RIKEN Cell Bank #RCB0805, Ibaraki, Japan) werden Plat-E-cellen met retrovirale verpakking (welwillend verstrekt door Dr. T. Kitamura, de Universiteit van Tokio) een dag eerder op platen met 6 putjes gezaaid. transfectie. De volgende dag werden 3 µg van een transgeen plasmide, 3 µl PLUS-reagens (ThermoFisher Scientific) en 150 µl Opti-MEM (ThermoFisher Scientific) in een buis gemengd, terwijl in een andere buis 7.5 µl Lipofectamine LTX-reagens ( ThermoFisher Scientific) en 150 µl Opti-MEM werden gemengd. Vervolgens werden de mengsels afgeleid van de twee buizen met elkaar gemengd en toegevoegd aan de voorgekweekte Plat-E-cellen (dag 0). Het kweekmedium werd op dag 1 vervangen. Op dag 2 werd het retrovirale supernatant geoogst, gefiltreerd met een PVDF-membraan van 0.45 µm, toegevoegd aan met Retronectine (TakaraBio) gecoate platen met 24 putjes en 6 uur bij kamertemperatuur bewaard. Retronectine kan cellen en retrovirale deeltjes co-lokaliseren, wat leidt tot een hoge transductie-efficiëntie en daarmee de tijd verkort die nodig is voor het verkrijgen van een voldoende aantal cellen van transductanten voor verdere analyses. Na één keer wassen met PBS werden Ba/F3-cellen (1.0 x 10⁵ cellen/putje) werden op de platen gezaaid, gevolgd door toevoeging van 1 µg/ml puromycine op dag 3 of 4 om stabiel getransduceerde cellen te selecteren.

Ba/F3-cellen kunnen worden getransduceerd met retrovirale deeltjes met de ecotropische envelop, terwijl 32Dcl3-cellen (RIKEN Cell Bank #RCB1377) dat niet kunnen. Daarom werden 32Dcl3-cellen getransduceerd met retrovirale deeltjes die waren gepseudotypeerd met de VSV-G-envelop. Voor de transductie van 32Dcl3-cellen werden 293GP-cellen (welwillend verstrekt door Dr. M. Otsu, Kitasato University) gebruikt voor pseudotype retrovirale verpakking⁹. Het transfectieprotocol was hetzelfde als in het geval van Ba/F3-cellen, behalve dat 2.25 µg van een transgeenplasmide en 0.75 µg pCMV-VSV-G werden gebruikt. Op dag 2 werd het retrovirale supernatant 6000 uur bij 16 ° C bij 4 g gecentrifugeerd en 100-voudig geconcentreerd met RPMI-medium als oplosmiddel. Het geconcentreerde virus werd toegevoegd aan 32Dcl3-cellen (1.0 x 10).⁵ cellen) met 10 µg/ml protaminesulfaat, gevolgd door toevoeging van 3 µg/ml puromycine op dag 3 of 4 om stabiel getransduceerde cellen te selecteren.

Bibliotheek vectortransductie

Bij de bibliotheekvectortransductie resulteert het volgende retrovirale transductieprotocol met behulp van een kationisch reagens protaminesulfaat empirisch in een transductie-efficiëntie van <10%, wat wenselijk is voor monoklonale bibliotheektransductie in ontvangende cellen. De algemene procedures waren ongeveer hetzelfde als in het geval van klonale vectortransductie, behalve dat de gebruikte celculturen en reagentia werden opgeschaald. De opgeschaalde waarden in bibliotheekvectortransductie worden als volgt weergegeven.

Voor transductie van Ba/F3-cellen werden Plat-E-cellen gezaaid op een schaal van 10 cm; plasmide-oplossing was 16 µg van een transgeen plasmide, 32 µl P3000-reagens (ThermoFisher Scientific) en 500 µl Opti-MEM; de lipofectamine-oplossing bestond uit 21.7 µl Lipofectamine 3000 Reagens (ThermoFisher Scientific) en 500 µl Opti-MEM; 1.0 × 10⁷ van Ba/F3-cellen werd getransduceerd in aanwezigheid van 10 µg/ml protaminesulfaat.

Voor transductie van 32Dcl3-cellen werden 293GP-cellen gezaaid op een schaal van 10 cm; plasmide-oplossing was 10 µg van een transgeen plasmide, 2.5 µg pCMV-VSV-G, 12.5 µg PLUS Reagens en 1 ml Opti-MEM; de lipofectamine-oplossing bestond uit 31 µl Lipofectamine LTX-reagens en 2.4 ml Opti-MEM; 1.0 × 10⁷ van 32Dcl3-cellen werd getransduceerd in aanwezigheid van 10 µg/ml protaminesulfaat.

Flowcytometrie

Positieve EGFP-percentages werden gemeten met FACSCalibur (BD Biosciences).

Bibliotheek screening

Voor screening van Ba/F3-transductanten werden getransduceerde cellen (1.1 x 10⁵) werden gezaaid op platen met 96 putjes bij 1.0 x 10³ cellen/ml met 10 nM AP20187 (TakaraBio) op dag 0. Om de groei van klonale cellen in de beperkt-verdunde toestand te bevorderen, werden niet-getransduceerde ouderlijke cellen (3.0 x 10⁵ cellen/ml) werden gemengd als voedingscellen. De groeiende kolonies werden opgeschaald in platen met 24 putjes en vervolgens in schalen van 6 cm. Tenslotte werden de snelste 18 cellulaire klonen onderworpen aan verdere testen. Genomisch DNA werd geëxtraheerd met DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN). Genomische PCR werd uitgevoerd om het gerandomiseerde gebied te amplificeren. De geamplificeerde fragmenten werden onderworpen aan sequencing. Dezelfde procedures werden uitgevoerd voor het screenen van 32Dcl3-transductanten.

Celproliferatietest

Cellen werden tweemaal gewassen met PBS en uitgezaaid in platen met 24 putjes in het kweekmedium dat verschillende concentraties AP20187 (TakaraBio), 1 ng/ml IL-3 (ThermoFisher Scientific) of 10 ng/ml G-CSF (R&D) bevatte. Systemen). Levensvatbare celdichtheden werden geschat door Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories) door de absorptie bij 450 nm te meten met behulp van GloMax Discover Microplate Reader (Promega).

Western blotting

De gedetailleerde experimentele procedures voor Western-blotting zijn eerder beschreven³². In signaalanalyses werden de cellen gedurende 3-10 uur gekweekt in een medium zonder IL-16, en vervolgens gestimuleerd met 10 nM AP20187, 1 ng/ml IL-3 of 10 ng/ml G-CSF bij 37˚C gedurende 15 minuten. In de MPO-expressietest werden cellen gedurende 10 dagen gekweekt in het medium dat 20187 nM AP1, 3 ng/ml IL-10 of 5 ng/ml G-CSF bevatte. Eiwitten van de cellysaten werden gescheiden door SDS-PAGE, overgebracht op nitrocellulosemembranen en onderzocht met primaire en secundaire antilichamen. De gebruikte antilichamen worden vermeld in aanvullende informatie (aanvullende figuur XNUMX). 2).

• Door SEO aangedreven content en PR-distributie. Word vandaag nog versterkt.
• PlatoData.Network Verticale generatieve AI. Versterk jezelf. Toegang hier.
• PlatoAiStream. Web3-intelligentie. Kennis versterkt. Toegang hier.
• PlatoESG. carbon, CleanTech, Energie, Milieu, Zonne, Afvalbeheer. Toegang hier.
• Plato Gezondheid. Intelligentie op het gebied van biotech en klinische proeven. Toegang hier.
• Bron: https://www.nature.com/articles/s41598-023-42378-6