Bedrijven die apparatuur, reagentia en/of benodigdheden leveren: Abcam, Cambridge, MA; ACD Labs, Toronto, CA; Acris Antilichamen, Inc), San Diego, CA; Advanced Bioscience Resources, Inc (ABR), Rockville, MD; Agilent Technologies, Santa Clara, CA; Alpco Diagnostiek, Salem, NH; Toegepaste biosystemen, Foster City, CA; BD Pharmingen, San Jose, CA; Becton Dickinson, Franklin Meren, NJ; Bethyl-laboratoria, Montgomery, TX; BioAssay-systemen, Hayward, CA; Cambridge Isotopen Laboratories, Tewksbury, MA; Biotime, Inc., Alameda, CA; Carl Zeiss-microscopie, Thornwood, NY; Carolina Liquid Chemistries, Corp., Winston-Salem, NC; Charles River Laboratories International, Inc., Wilmington, MA; Chenomx, Inc., Alberta, Canada; Cole-Parmer, Court Vernon Hills, IL; DiaPharma, West Chester Township, OH; Fisher Scientific, Pittsburgh, Pennsylvania; Gatan, Inc., Pleasanton, CA; Illumina, San Diego, CA; Vindingrijkheid, Redwood City, CA; Life Technologies Corp., Grand Island, NY; Leica, Washington, gelijkstroom; LifeSpan Biosciences, Inc., Seattle, A; Moleculaire apparaten, Sunnyvale, CA; Olympus Scientific Solutions Americas Corp., Waltham, MA; PhoenixSongs Biologicals (PSB), Branford, CT; Polysciences, Inc., Warrington, PA; Qiagen, Germantown, MD; R&D-systemen, Minneapolis, MN; RayBiotech, Norcross, GA; Roche Diagnostics, Mannheim, Duitsland; Santa Cruz Biotechnology, Inc), Dallas, TX; Sigma-Aldrich, St.Louis, MO; Sofregen, Medford, MA; Takara, Otsu, Japan; Tousimis Research Corp., Rockville, MD; Triangle Research Labs (TRL), Onderzoeksdriehoek Park, NC; Umetrics, Umeå, Zweden; Varian Medical Systems, Inc), Palo Alto, CA; Vector Laboratoria, Burlingame, CA; VWR Scientific, Radnor, PA.

Ethische verklaringen vatten samen hoe de dieren werden gehouden. Alle dierexperimenten werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de goedgekeurde Institutional Animal Care and Use Committees van North Carolina State University (NCSU) in Raleigh en aan de University of North Carolina (UNC) in Chapel Hill en volgden dus de principes uiteengezet in de Verklaring van Helsinki voor alle experimenten op mens of dier. Alle procedures die worden gebruikt in dierstudies en die waarbij menselijke weefsels worden gebruikt, zijn goedgekeurd door de commissies van de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en de Institutional Review Board (IRB) van beide instellingen: de UNC en het College of Veterinary Medicine bij NCSU . De IACUC-goedkeuringsnummers zijn 16-316.0 en 17-225.0. Studies voor menselijke cellen in dit project werden geëvalueerd door de IRB-commissie en kregen een IRB-goedkeuringsnummer van 97-1063.

Menselijke monsters bevatten informatie over elk monster plus algemene informatie voor alle monsters en in detail verstrekt in eerdere onderzoeken:^39,41,42

Foetaal leverweefsel werd geleverd door een geaccrediteerde instantie (Advanced Biological Resources, San Francisco, CA) van foetussen tussen 18 en 22 weken zwangerschap verkregen door electieve zwangerschapsonderbrekingen. Het onderzoeksprotocol is beoordeeld en goedgekeurd door de IRB for Human Research Studies bij UNC. Alle monsters werden gescreend op verschillende ziekteverwekkers en alleen die welke vrij waren van deze werden geaccepteerd voor de onderzoeksstudies.

Postnatale levers werden verkregen van dode neonatale, pediatrische en volwassen donoren en werden verkregen via orgaandonatieprogramma's via UNOS. Degenen die voor deze onderzoeken werden gebruikt, werden als normaal beschouwd zonder bewijs van ziekteprocessen, inclusief na screening op pathogenen. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van nabestaanden voor het gebruik van de levers voor onderzoeksdoeleinden, protocollen kregen IRB-goedkeuring en verwerking was in overeenstemming met Good Manufacturing Practice.

Varkensmonsters waren afkomstig van dieren die werden gehouden in de faciliteiten van het College of Veterinary Medicine aan de North Carolina State University (NCSU, Raleigh, NC). Sommigen van hen werden gebruikt als gastheer of als donor voor cellen. In deze faciliteiten werden operaties, necropsieën en het verzamelen van alle biologische vloeistoffen en weefsels uitgevoerd.

Varkensgastheren die voor de enten werden gebruikt, waren een mengsel van zes verschillende rassen: een zesvoudige kruising bestaande uit Yorkshires, Large Whites, Landraces (van de zeugen), Durocs, Spots en Pietrans (van de beren). Deze zeer heterogene genetische achtergrond is wenselijk omdat het parallel loopt met de heterogene genetische constituties van menselijke populaties⁶⁵. De gastdieren waren allemaal vrouwtjes, ongeveer 6 weken oud en ongeveer 15 kg.

Groen fluorescerend eiwit (GFP)⁺ er werden transgene varkensdonoren opgericht die een H2B histon-eGFP-transgen droegen. De GFP⁺ donordieren werden verkregen door een transgene H2B-GFP-beer te fokken met een wildtype gelt door middel van standaard kunstmatige inseminatie⁶⁶. Het model is ontwikkeld via CRISPR-Cas9-gemedieerde homologie-gerichte reparatie (HDR) van IRES-pH2B-eGFP in de endogene β-actine (ACTB) locus. De transgene dieren vertonen alomtegenwoordige expressie van pH2B-eGFP in alle weefsels. Fusie van de GFP naar H2B resulteert in de lokalisatie van de GFP-marker naar het nucleosoom en maakt een duidelijke nucleaire visualisatie mogelijk, evenals de studie van chromosoomdynamica. De oprichterslijn is uitgebreid en alomtegenwoordig geanalyseerd en nucleair gelokaliseerde expressie is bevestigd. Bovendien heeft de fokkerij de overdracht van de H2B-GFP naar de volgende generatie aangetoond. Alle dieren waren gezond en er zijn meerlingzwangerschappen vastgesteld met nakomelingen die de verwachte Mendeliaanse verhouding voor de overdracht van de pH2B-eGFP vertoonden. De mannelijke nakomelingen werden bij de geboorte gegenotypeerd en degenen die positief waren voor het transgen werden op humane wijze geëuthanaseerd voor weefselverzameling en isolatie van donorcellen.

Genotypering van varkens werd gedaan. Voor elk donor- en ontvangend dier zijn de varkensleukocytenantigeen klasse I (SLA-I) en klasse II (SLA-II) loci door polymerasekettingreactie (PCR) geamplificeerd met behulp van primers die zijn ontworpen om bekende allelen in deze regio's te amplificeren op basis van de PCR -sequentie-specifieke-primer-strategie¹⁸. Het systeem bestaat uit 47 discriminerende SLA-I-primersets die de SLA-1-, SLA-2- en SLA-3-loci versterken, en 47 discriminerende SLA-II-primersets die de DRB1-, DQB1- en DQA-loci versterken.⁶⁷. Deze primersets zijn ontwikkeld om allelen te differentiëren door groepen die vergelijkbare sequentiemotieven delen en er is aangetoond dat ze gemakkelijk en ondubbelzinnig bekende SLA-I- en SLA-II-allelen kunnen detecteren. Wanneer ze samen werden gebruikt, leverden deze primersets effectief een haplotype op voor elk dier dat werd getest, waardoor ze een assay verschaften om gemakkelijk een overeenkomend of niet-overeenkomend haplotype bij donor- en ontvangende dieren te bevestigen.

Operaties aan de varkens werden uitgevoerd met behulp van anesthesie die werd geïnduceerd door toediening van een combinatie van ketamine / xylazine (elk 2-3 mg / kg gewicht) intraveneus geïnjecteerd of 20 mg / kg ketamine plus 2 g / kg xylazine IM, en werden onderhouden door isofluraan in zuurstof toegediend via een gasanesthesiesysteem met gesloten circuit. Bij de transplantaten op de lever en bij algemene chirurgische ingrepen werden de varkens in dorsale decubitus geplaatst en werd de ventrale buik van xyphoid tot pubis geknipt. De huid werd aseptisch geprepareerd met afwisselend gejodeerde scrub- en alcoholoplossingen. Na binnenkomst in de operatiekamer werd de voorbereiding van de huid herhaald met behulp van een steriele techniek en werd het gebied bedekt met een plaatselijke jodiumoplossing voordat steriele operatiedoeken werden aangebracht. De chirurgen gebruikten een geschikte aseptische techniek. Er werd een middenventrale incisie gemaakt door de huid, door onderhuids weefsel en lijn alba, beginnend bij de processus xiphoid en zich caudaal uitstrekkend over 8-12 cm. De linker leverafdeling werd blootgelegd en een patch-transplantaat van 3 × 4.5 cm werd aangebracht op het ventrale oppervlak van de lever en bevatte een 1X hyaluronan-hydrogel (~ 60 Pa) met ingebedde BTSC-organoïden en werd op de rug geplaatst die 10X hyaluronan-hydrogel bevatte (~ 760 Pa); de pleister werd in direct contact met het oppervlak van de levercapsule geplaatst. Het patch-transplantaat werd aan de lever gehecht met 4-6 eenvoudige, onderbroken hechtingen van 4-0 polypropyleen. Het blootgestelde oppervlak van het transplantaat werd vervolgens behandeld met 2 ml 2X hyaluronan-hydrogel (~ 200-300 Pa), een mate van stijfheid die voldoende vloeibaar was om het op de buitenkant van het transplantaat te kunnen schilderen of coaten; het diende verder om verklevingen van naburige weefsels te minimaliseren. Na plaatsing van de chirurgische graft, de lijn alba werd gesloten met een eenvoudige doorlopende hechting met behulp van 0-PDS. De linea werd geblokkeerd met 2 mg/kg 0.5% bupivacaïne, IM. De onderhuidse weefsels en huid werden gesloten met respectievelijk continue 2-0 PDS- en 3-0 Monocryl-hechtingen. Weefselkleefstof werd op het huidoppervlak aangebracht.

Voor transplantaten op de pancreas maakten chirurgische procedures voor varkens gebruik van een transplantaat dat elke maat kan hebben die geschikt is voor de afmetingen van de pancreas. Voor het blootleggen van de alvleesklier werden hechtingen geplaatst in de dalende twaalfvingerige darm. Het transplantaat werd op de kop van de alvleesklier en grenzend aan de twaalfvingerige darm geplaatst met de zachte hyaluronan (~ 60 Pa) hydrogel die de organoïden bevat in direct contact met de pancreas, en met de stijvere hyaluronan hydrogel (~ 760 Pa) in de zijde steun. We gebruikten hechtingen op de vier hoeken (4–0 Prolene); de eerste twee hoekhechtingen werden geplaatst in de dalende twaalfvingerige darm; de andere 2 werden in het mesenterium geplaatst en het parenchym van de pancreas vermeden (om de neiging tot autolyse door de pancreas tot een minimum te beperken). Het serosale oppervlak van het transplantaat werd vervolgens bedekt met 2X hyaluronan (~ 200-300 Pa) hydrogel om verklevingen te minimaliseren. De buik werd gesloten met continu absorbeerbare (PDS) hechtingen in de linea, subcutane en subcutane lagen. Weefsellijm werd op de huid gebruikt om huidhechtingen te voorkomen.

Immunosuppressie was nodig omdat de transplantaten van de transgene varkens naar de wild-type ontvangers allogeen waren. De gebruikte immuunonderdrukkingsprotocollen waren door anderen opgesteld^68,69. Alle varkens kregen orale doseringen van de immunosuppressiva, Tacrolimus (0.5 mg/kg) en Mycofenolaat (500 mg) tweemaal daags, beginnend 24 uur voorafgaand aan de operatie. De medicijnen werden continu gegeven gedurende de gehele experimentele periode. Deze kunnen gemakkelijk aan de dieren worden gegeven als ze worden gemengd met hun favoriete voedsel.

Isolatie van normaal weefsel werd gedaan van pasgeboren biggen en van oudere, 12 weken oude varkens. Pasgeboren biggen wogen ~ 10 lbs; de oudere varkens, 12 weken oud, waren ~ 50-60 lbs. Varkens werden opgeofferd door euthanasie met penetrerende bout, gevolgd door leegbloeden van de hals. De methode voldoet aan de aanbevolen richtlijnen van de American Veterinary Medical Association voor euthanasie bij varkens⁶⁵. Een lijst van donoren die worden gebruikt voor galweefsels van biggen of volwassen varkens wordt gegeven in de aanvullende tabel 4.

Alle media werden steriel gefilterd (0.22 µm filter) en vóór gebruik in het donker bewaard bij 4 °C. Basaal medium en foetaal runderserum (FBS) werden gekocht bij GIBCO/Invitrogen. Alle groeifactoren werden aangekocht bij R&D Systems. Alle andere reagentia, behalve die vermeld, werden verkregen van Sigma.

Celwasbuffers bestonden uit 500 ml basaal medium (bijv. RPMI 1640; Gibco # 11875-093) werden aangevuld met 0.5 g serumalbumine (Sigma, # A8896-5G, vetzuurvrij), 10^-9 M selenium en 5 ml antibiotica (Gibco #35240-062, AAS). Het werd gebruikt voor het wassen van weefsels en cellen tijdens de verwerking.

Collagenasebuffer bestond uit 100 ml celspoeling aangevuld met collagenase (Sigma # C5138) met een eindconcentratie van 600 U/ml (R1451 25 mg) voor weefsel van de galwegen en 300 U/ml (12.5 mg) voor organen ( bv lever).

Kubota's Medium, een volledig gedefinieerd, serumvrij medium dat oorspronkelijk is ontworpen voor hepatoblasten⁷⁰, en vervolgens succesvol bevonden voor het onderhoud van galboomstamcellen, leverstamcellen en alvleesklierstamcellen en voorlopercellen (en later in het algemeen succesvol bevonden voor alle beoordeelde endodermale stamcellen/voorlopercellen), werd gebruikt om celsuspensies, organoïden en hyaluronan hydrogels. Dit medium bestaat uit elk basaal medium (hier is RPMI 1640) zonder koper, laag calciumgehalte (0.3 mM), 1 nM selenium, 0.1% serumalbumine (gezuiverd, vetzuurvrij; fractie V), 4.5 mM nicotinamide, 0.1 nM zinksulfaatheptahydraat, 5 µg/ml transferrine/Fe, 5 µg/ml insuline, 10 µg/ml high-density lipoproteïne en een mengsel van gezuiverde vrije vetzuren die worden gepresenteerd in complexvorm met vetzuurvrij, sterk gezuiverd albumine . Het mengsel van vrije vetzuren bestond uit palmitinezuur, palmitoleïnezuur, stearinezuur, oliezuur, linolzuur en linoleenzuur. Het medium van Kubota is in de handel verkrijgbaar bij PhoenixSongs Biologische (Branford, CT).

De gebruikte hyaluronanen (HA's) omvatten de oplosbare vormen van HA met lange ketens (Sigma-catalogus #52747) en werden gebruikt bij de stabilisatie van organoïde culturen en bij cryopreservatie van celsuspensies^71,72. Die gebruikt om de hydrogels te maken, thiol-gemodificeerde HA's, werden verkregen van Glycosan Biosciences, voorheen een dochteronderneming van Lineage Cell Therapeutics (Alameda, CA), en worden nu aangeboden in niet-klinische vorm van Advanced Biomatrix (Carlsbad, CA) en in de vorm van klinische kwaliteit van Sentrex Animal Care (Salt Lake City, UT) (G. Prestwich, persoonlijke mededelingen). De componenten voor deze met thiol gemodificeerde HA's zijn gemaakt door middel van een eigen bacterieel fermentatieproces met behulp van Bacillus subtilis als host in een ISO 9001:2000-proces (www.biopolymer.novozymes.com/). De componenten zijn geproduceerd door Novozymes onder de handelsnaam HyaCare® en zijn 100% vrij van dierlijke materialen en resterende organische oplosmiddelen. Bij de productie worden geen dierlijke ingrediënten gebruikt; er zijn zeer lage eiwitgehalten en geen endotoxinen. De productie volgt de normen van de Europese Farmacopee. De HA-hydrogels werden bereid met behulp van Glycosil (HyStem® HA's, ESI BIO-CG313), de thiol-gemodificeerde HA's die kunnen worden geactiveerd om disulfidebruggen te vormen in aanwezigheid van zuurstof, of door thio-etherbindingen te vormen met behulp van polyethyleenglycoldiacrylaat (PEGDA ). Glycosil® wordt gereconstitueerd als een 1% oplossing van gethioleerd HA in 1% fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met behulp van ontgast water, of, in ons geval, in serumvrij Kubota's medium. Na reconstitutie blijft het enkele uren vloeibaar, maar het kan enige gelering ondergaan als het wordt blootgesteld aan zuurstof. Nauwkeurigere gelering vindt plaats zonder temperatuur- of pH-veranderingen als Glycosil wordt behandeld met een crosslinker zoals PEGDA, waardoor gelering binnen enkele minuten optreedt^73,74,75,76.

Het niveau van verknoping levert de belangrijkste bijdrage aan het niveau van stijfheid (visco-elasticiteit) of stijfheid en kan worden gecontroleerd door de verhouding van de met thiol gemodificeerde hyaluronen tot PEGDA aan te passen⁷⁶. In eerdere studies werden leverstamcelpopulaties getest in HA-hydrogels van verschillende niveaus van rigiditeit en bleken stamcellen te blijven, zowel antigeen als functioneel (bijvoorbeeld met betrekking tot het vermogen om te migreren en de expressie van stamcel-geassocieerde genen). zoals pluripotentiegenen en matrixmetalloproteïnasen), alleen als het niveau van rigiditeit minder was dan ~ 100 Pa⁷⁶. We hebben deze bevinding gebruikt om transplantaten te ontwerpen met een zachte laag (~100 Pa of minder) waarin organoïden van BTSC's kunnen worden ingebed en met stijvere lagen (~700 Pa) hyaluronan-hydrogels in de rug om een ​​barrière te vormen voor migratie in andere richtingen. dan het doelweefsel, evenals weefsels met een gemiddelde stijfheid (~ 200-300 Pa) om verklevingen te minimaliseren.

Reologische eigenschappen op macroschaal van hyaluronan-hydrogels werden bepaald met behulp van een spanningsgecontroleerde kegel-en-plaatreometer (TA Instruments, AR-G2, kegeldiameter van 40 mm, hoek van 1 °). Gels polymeriseerden actief op de reometer terwijl ze oscilleerden met een frequentie van 1 rad/s en een spanningsamplitude van 0.6 Pa, waarbij de modulus continu werd gecontroleerd om te vragen of de verknopingsreacties voldoende waren voltooid. Eenmaal in evenwicht gebracht, werden de hydrogels onderworpen aan een oscillerende frequentiezwaai (spanningsamplitude: 0.6 Pa, frequentiebereik: 0.01-100 Hz).

Bereiding van cellen werd gedaan uit extrahepatisch galboomweefsel (galblaas, gemeenschappelijke ductus, leverkanalen) verkregen van varkens [of van menselijk weefsel]. Voor de weefsels die werden gebruikt om organoïden van normale cellen te genereren, werden weefsels gestampt met een gesteriliseerde roestvrijstalen hamer om de parenchymcellen te verwijderen, waarbij de koppeling van de intra-hepatische en extrahepatische galkanalen zorgvuldig werd behouden. De galboom werd vervolgens gewassen met de "celwas" -buffer bestaande uit een steriel, serumvrij basaal medium aangevuld met antibiotica, 0.1% serumalbumine en 1 nM selenium (10^-9 M). Het werd vervolgens mechanisch gedissocieerd met gekruiste scalpels en de aggregaten werden enzymatisch gedispergeerd in een celsuspensie in RPMI-1640 aangevuld met 0.1% runderserumalbumine (BSA) [of voor menselijke weefsels, humaan serumalbumine, HAS], 1 nM selenium, 300 E/ml collagenase type IV, 0.3 mg/ml deoxyribonuclease (DNAse) en antibiotica. De digestie vond plaats bij 32 ° C met frequente agitatie gedurende 30-60 minuten. De meeste weefsels vereisten twee digestieronden gevolgd door centrifugatie bij 1100 rpm bij 4 °C. Celpellets werden gecombineerd en opnieuw gesuspendeerd in celwas. De celsuspensie werd gecentrifugeerd bij 30xg gedurende 5 min bij 4 °C om rode bloedcellen te verwijderen. De celpellets werden opnieuw gesuspendeerd in celwas en gefiltreerd door een 40 urn nylon celzeef (Becton Dickenson Falcon #352340) met verse celwas. De celaantallen werden bepaald en de levensvatbaarheid werd beoordeeld met behulp van Trypan Blue. Cellevensvatbaarheid boven 90-95% werd routinematig waargenomen.

Vorming van organoïden werd gedaan uit celsuspensies toegevoegd aan celkweekplaten met meerdere putjes en vlakke bodem (Corning #353043) in serumvrij Kubota's medium en ongeveer een uur bij 37 °C geïncubeerd om hechting van volwassen mesenchymcellen (bijv. , volwassen stellaatcellen). Rijpe mesenchymale cellen hechtten zich binnen ~ 15 minuten aan de schalen, ook al was het medium serumvrij. De onrijpe cellen bleven in suspensie en werden overgebracht naar een andere schaal en opnieuw tot een uur geïncubeerd. Dit werd verschillende keren herhaald om de uitputting van een aanzienlijk deel van de volwassen mesenchymale cellen te verzekeren. Na uitputting van volwassen mesenchymale cellen werden de resterende drijvende cellen gezaaid op ~ 2 x 10⁵ cellen per putje in serumvrij Kubota's medium in Corning's ultralage hechtschalen (Corning # 3471) en werden overnacht bij 37 ° C geïncubeerd in een CO₂ incubator. Organoïden bestaande uit de stamcellen van de galboom (BTSC's) die samenwerkten met mesenchymcellen in de vroege afstammingsfase (ELMSC's) die van de ene op de andere dag werden gevormd. De ELMSC's bleken door hun expressie van specifieke oppervlakte-antigenen angioblasten te zijn (CD117⁺, CD31^-, VEGFr⁺) en voorlopers van endothelia (CD31⁺, VEGFr⁺) en naar stellaatcellen (ICAM-1⁺, CD146⁺). Er zijn uitgebreidere karakteriseringen van deze ELSMC's gedaan en de bevindingen zijn eerder gepubliceerd^77,78. De organoïde culturen overleefden wekenlang in het medium van Kubota, vooral als het medium was aangevuld (0.1%) met oplosbare vormen van hyaluronanen (Sigma).

De cellen zouden ook gecryoconserveerd kunnen worden zoals hieronder beschreven. Van elke gram varkensgalboomweefsel verkregen we ~ 1.5 × 10⁷ cellen. We gebruikten ~3–6 × 10⁵ cellen per putje van een 6-puts, ultra-lage bevestigingsplaat en geïncubeerd in het serumvrije Kubota's medium. De cellen produceerden gemiddeld 6000-20,000 kleine organoïden (~ 50-100 cellen/organoïde/putje). Voor de grafts gebruikten we minstens 100,000 organoïden (>10⁷ cellen). Afhankelijk van de grootte van de backing konden we het aantal organoïden in de grafts verhogen tot >10⁸ organoïden (dwz ~ 10⁹ cellen totaal) of meer ingebed in ~ 1 ml van de zachte hyaluronan-hydrogel op een rug van 3 cm × 4.5 cm.

Cryopreservatie van stam/voorlopers werd het meest succesvol gedaan door cryopreservatie van geïsoleerde cellen of kleine celaggregaten die waren onderworpen aan de panning-procedures om het aantal volwassen mesenchymale cellen te minimaliseren. Men kan de mix van stam/voorlopercellen en mesenchymale cellen in de vroege afstammingsfase invriezen in Cryostor10, een isotone cryopreservatiebuffer die antivriesfactoren, dextran en DMSO bevat (Bioliife, Seattle, WA). De levensvatbaarheid van de cellen werd verder verbeterd door suppletie met 0.1% HA's (Sigma #52747)^71,72. De hoogste levensvatbaarheid van de organoïden was wanneer ze werden bereid uit vers ontdooide, gecryopreserveerde celsuspensies; lagere levensvatbaarheid werd waargenomen met ingevroren, volledig gevormde organoïden. Cryopreservatie werd gedaan met behulp van CryoMed™ Controlled-Rate Freezers. De levensvatbaarheid bij ontdooien was meer dan 90% voor die gecryopreserveerd als een celsuspensie en vervolgens, na ontdooien, gebruikt om organoïden te vormen^71,72.

Patch-transplantaten zijn nieuwe methoden die snel zijn ontwikkeld om grote aantallen (bijv. >10⁸th) van organoïden in vaste organen en om de organoïden binnen een week volledig te integreren in de organen en binnen nog een week uit te groeien tot volwassen cellen. Verdere details van de logica, strategieën en methoden voor het patchen van organoïden in vaste organen worden gegeven in onze eerdere publicaties^54,55. Transplantaten werden gevormd met behulp van een rug, Contour Seri-silk (Sofregen, Medford, MA), waarop de stam / voorloper-organoïden werden geplaatst ingebed in zachte hyaluronan-hydrogels (~ 50-100 Pa). Deze werden gemakkelijk van tevoren bereid en gedurende de nacht in een kweekschaal in een incubator gehouden. Het gebrek aan succes bij pogingen om organoïden in zachte hydrogels te cryopreserveren, betekende dat het inbedden van de organoïden in de zachte hydrogel vlak voor de operatie moest gebeuren om de transplantaten te bevestigen.

bijwerken: We hebben vernomen dat Contour Seri-silk niet meer verkrijgbaar is bij de fabrikant. Op amnion gebaseerde matrixmaterialen, zoals die van Vivex Biologics (Miami, FL), zouden een geschikt alternatief moeten zijn en zijn een door de FDA goedgekeurd implantaatmateriaal voor klinische of niet-klinische doeleinden. Deze zouden voldoende mechanische ondersteuning moeten bieden voor de transplantaten en er wordt verondersteld dat ze redelijk neutraal zijn wat betreft effecten op donororganoïden; dit is belangrijk om ervoor te zorgen dat de organoïden hun stamceleigenschappen behouden, waardoor ze matrixmetalloproteïnasen (MMP's) tot expressie kunnen brengen die nodig zijn voor enting en migratie⁵⁴. Klinische toepassingen van dergelijke van amnion afgeleide matrices zijn door anderen besproken in een recent overzicht⁷⁹. Aangenomen wordt dat de stijvere hyaluronan-hydrogel (~ 700 Pa) niet nodig zal zijn gezien de complexe matrixchemie in het amnion die als barrière zou moeten dienen. Er wordt echter verondersteld dat een amnionmatrixbarrière na bevestiging aan de doellocatie nog steeds aan beide zijden moet worden gecoat met hyaluronan en met het hyaluronan dat is bereid met serumvrij Kubota's Medium en op een gemiddeld niveau van stijfheid (~ 200-300 Pa ). De coating aan de sereuze zijde op het moment van de operatie zou verklevingen aan de naburige weefsels tot een minimum moeten beperken.

Voor autopsieprocedures werden alle dieren op het aangegeven tijdstip op humane wijze geëuthanaseerd door sedatie met ketamine / xylazine en isofluorane-anesthesie, gevolgd door een intraveneuze injectie van een dodelijke dosis natriumpentobarbital. Na bevestiging van overlijden werd het karkas zorgvuldig ontleed en werden de doelorganen verwijderd en in gekoeld Kubota's medium geplaatst voor transport naar het laboratorium. Naast de lever werden de longen, het hart, de nieren en de milt verzameld en gefixeerd in 10% neutrale formaline.

Histologie werd uitgevoerd op delen van de vers ontlede weefsels van de varkens of de transplantaten op de lever of alvleesklier werden gefixeerd met 4% paraformaldehyde (PFA) en vervolgens in paraffine ingebed. Secties van vijf micron werden gesneden en gekleurd met hematoxyline-eosine voor routinematige histologische analyses. De weefsels verkregen van neonatale varkens werden ook bereid als monsters (lever, pancreas, galboom en twaalfvingerige darm) in grote paraffineblokken om analyses van de verbindingen door de galboom en het pancreaskanaalsysteem te vergemakkelijken.

Immunohistochemie (IHC) werd gebruikt voor analyses van verschillende markers en eigenschappen. Voor immunofluorescente kleuring werden 5 μm ingevroren secties of gekweekte cellen gefixeerd met 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur, gespoeld met PBS, geblokkeerd met 10% geitenserum in PBS gedurende 2 uur, en gespoeld. Gefixeerde cellen werden geïncubeerd met primaire antilichamen bij 4 ° C gedurende 14 uur, gewassen, gedurende 1 uur geïncubeerd met gelabelde isotype-specifieke secundaire antilichamen, gewassen en tegengekleurd met 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) voor visualisatie van celkernen en bekeken met behulp van Leica DMIRB omgekeerde microscoop (Leica, Houston, TX) of een Zeiss ApoTome Axiovert 200 M (Carl Zeiss Inc, Thornwood, NY).

Voor IHC werden de weefsels een nacht gefixeerd in 4% PFA en bewaard in 70% ethanol. Ze werden ingebed in paraffine en in secties van 5 μm gesneden. Na deparaffinisatie werd het antigeen ophalen uitgevoerd met natriumcitraatbuffer (pH 6.0) of ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA)-buffer (pH 8.0) in een stomer gedurende 20 minuten. Endogene peroxidasen werden geblokkeerd door incubatie gedurende 15 minuten in 3% H₂O₂. Secties werden gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd met ImmPRESS peroxidase kleurkits en 3,3'-diaminobenzidinesubstraten (Vector Laboratories). Secties werden tegengekleurd met hematoxyline. De gebruikte antilichamen staan ​​vermeld in de aanvullende tabel 1.

Zuivering van celpopulaties voor genetische studies was belangrijk voor verschillende analyses. De zuiverheid van de geïsoleerde subpopulaties werd bepaald door een combinatie van strategieën voor de isolatie van de cellen. De volwassen hepatocyten werden vers geïsoleerd uit neonatale varkenslevers versus uit neonatale, pediatrische en volwassen menselijke levers door middel van standaard collagenase-digestie en percoll-fractionering⁸⁰. De geïsoleerde fracties van volwassen hepatocyten (die met een gemiddelde diameter van meer dan 17 µm) werden gespoeld in RPMI1640 aangevuld met 2% serum om de enzymen te inactiveren die werden gebruikt bij het isoleren van de cellen; vervolgens behandeld met meerdere spoelbeurten met serumvrij RPMI 1640-medium; en ten slotte snel ingevroren met vloeibare stikstof. De cellen werden niet gekweekt.

De subpopulaties van stam/voorouders, zowel mensen als varkens, werden bereid uit vers geïsoleerde cellen van de foetale of neonatale galboom (galboomstamcellen), van foetale of neonatale levers (leverstamcellen en hepatoblasten), of foetale of neonatale levers. pancreas (pancreasstamcellen en ductale voorlopercellen); gezuiverd door een combinatie van immunoselectie voor oppervlakte-antigenen, waardoor afzonderlijke cellulaire subpopulaties kunnen worden geïsoleerd^39,41,50,54. Aanvullende tabel 5 vat de markers samen van de subpopulaties die uitgebreid zijn gekarakteriseerd, vooral in eerdere studies^{31,32,33,38,39,40,41,42,43,49,50}.

De immuungeselecteerde cellen werden gesuspendeerd in serumvrij Kubota's medium⁸¹, ontworpen voor endodermale stamcellen, en gezaaid op kweekschalen met lage hechting gedurende 6-12 uur, waardoor de vorming van organoïden mogelijk wordt. De organoïden die zich in die 6-12 uur vormden, omvatten de endodermale stamcellen die samenwerkten met mesenchymale cellen in de vroege afstamming: angioblasten en voorlopers van endotheel- en stellaatcellen (opmerking: de volwassen mesenchymale cellen werden geminimaliseerd door het immunoselectieproces zoals aangegeven door de uitputting van cellen voor oppervlakte-antigenen voor de rijpe hemopoëtische en mesenchymcellen).

RNA-sequencing en analyse van genexpressie omvatten RNA gezuiverd met behulp van Qiagen RNeasy Kit uit de varkens- (of menselijke) volwassen lever, pancreas, galblaas en galboomweefsel en uit geïsoleerde celsuspensies van hepatocyten (AHeps), leverstamcellen (HpSC's), galboomstamcellen (BTSC's), elk van drie verschillende donoren voor menselijke cellen en vijf verschillende donoren voor varkenscellen (aanvullende tabellen 6 en 7). RNA-seq-gegevensverzameling en kwaliteitscontroleanalyses werden specifiek afgebeeld in onze vorige studie⁵². De LIMMA-pijplijn (versie 3.50.1) werd gebruikt om differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG's) te identificeren. Genexpressieprofielen werden vergeleken met behulp van Pearson's en Spearman's correlatieanalyses. Principale componentenanalyse (PCA) en hiërarchische clustering werden uitgevoerd in R (R-versie 4.1.0).

Kwantitatieve reverse transcriptie en polymerasekettingreactie werden gedaan met behulp van totaal RNA uit cellen. Totaal RNA werd uit de cellen geëxtraheerd met behulp van Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Eerste streng cDNA gesynthetiseerd met behulp van de Prime script 1e streng cDNA-synthesekit (Takara, Otsu, Japan) werd gebruikt als een sjabloon voor PCR-amplificatie. Kwantitatieve analyses van mRNA-niveaus werden uitgevoerd met behulp van Faststart Universal Probe Master (R oche Diagnostics, Mannheim, Duitsland) met ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Primers zijn ontworpen met het Universal Probe Library Assay Design Center (Roche Applied Science). Primersequenties worden vermeld in de aanvullende tabel 4a. De primers werden 50 minuten bij 2 °C en 95 minuten bij 10 °C gegloeid, gevolgd door 40 cycli van 95 °C (15 seconden) en 60 °C (1 minuten). Expressie van glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH) werd in het algemeen als standaard gebruikt.

statistische analyse

Statistisch significante verschillen tussen monsters worden berekend met behulp van Student's 2-tailed t-test en resultaten worden gepresenteerd als het gemiddelde ± SD. P waarden van <0.05 werden als statistisch significant beschouwd.

Rapportage samenvatting

Nadere informatie over onderzoeksontwerp is beschikbaar in de Samenvatting van de rapportage over de natuurportfolio gekoppeld aan dit artikel.

• Door SEO aangedreven content en PR-distributie. Word vandaag nog versterkt.
• PlatoData.Network Verticale generatieve AI. Versterk jezelf. Toegang hier.
• PlatoAiStream. Web3-intelligentie. Kennis versterkt. Toegang hier.
• PlatoESG. Automotive / EV's, carbon, CleanTech, Energie, Milieu, Zonne, Afvalbeheer. Toegang hier.
• BlockOffsets. Eigendom voor milieucompensatie moderniseren. Toegang hier.
• Bron: https://www.nature.com/articles/s41536-023-00303-5