Een van de unieke kenmerken van de mens is onze drang om verder te gaan dan de grenzen die onze omgeving ons stelt. Wetenschap is een van de instrumenten die mensen gebruiken om dit doel te bereiken. 1968, meldde Malcolm Dole ongebruikelijke ionenstroomsporen na verneveling onder atmosferische druk van een elektrisch geladen oplossing van polystyreen. 

In zijn boek, Patrick Arpino, beschrijft de ontdekking van Malcolm Dole dat mensen de "vluchtigheidsbarrière" doorbreken, net zoals kapitein Charles in 1947 de "geluidsbarrière" doorbrak door zijn nieuw ontworpen Bell X-1-vliegtuig sneller te laten vliegen dan het geluid. De voorspellingen dat de "geluidsbarrière." of "volatiliteitsbarrières" konden niet worden doorbroken als ze verkeerd waren. Na nog eens 25 jaar werden op basis van de doorbraak van Malcolm Dole volledig nieuwe analytische instrumenten ontworpen. Deze instrumenten worden algemeen genoemd vloeistofchromatografie massaspectrometers (LC-MS). Tegenwoordig wordt LC-MS beschouwd als een krachtig analytisch hulpmiddel en wordt het veel gebruikt in de farmaceutica, biotechnologie, milieumonitoring, voedselverwerking en andere gebieden.

Nut van LC-MS in bioanalyse

LC-MS is een chemietechniek die de fysieke scheidingsmogelijkheden van vloeistofchromatografie (of HPLC) combineert met de massaanalysemogelijkheden van massaspectrometrie. Het is erg handig voor het analyseren van kleine moleculen en biedt een hogere gevoeligheid en selectiviteit bij de sporenanalyse van stoffen die uit meerdere componenten bestaan. 

LC-MS wordt gebruikt in de farmaceutische industrie om kwantitatieve metingen van een actief medicijn en zijn metabolieten te bieden om nauwkeurig te genereren farmacokinetiek, toxicokinetisch en bio-equivalentie gegevens, die essentieel zijn voor de ontwikkeling van klinische medicijnen proces. De techniek wordt ook gebruikt voor de analyse van biologische matrices in een aantal andere domeinen (bv. sportdoping, forensische toxicologie).

Waarom pH belangrijk is bij vloeistofchromatografie

De Internationale Unie van Pure en Toegepaste Chemie (IUPAC) definieert chromatografie als volgt: "Chromatografie is een fysieke scheidingsmethode waarbij de te scheiden componenten worden verdeeld over twee fasen, waarvan er één stationair is (de stationaire fase), terwijl de andere (de mobiele fase) in een bepaalde richting beweegt." Bij HPLC is de mobiele fase een vloeistof die onder hoge druk wordt afgeleverd (tot 400 bar (4 × 107 Pa)) om een ​​constante stroomsnelheid en dus reproduceerbare chromatografie te garanderen. 

De stationaire fase is verpakt in een kolom en is bestand tegen de hoge drukken die nodig zijn. De pH en ionensterkte van het waterige deel van de mobiele fase kunnen de chromatografie op een aantal manieren beïnvloeden. Afhankelijk van de verbinding die wordt geanalyseerd, kan de pH de selectiviteit, piekvorm en retentie beïnvloeden.

Het voordeel van mobiele fase met hoge pH

Zwak basische verbindingen een groot deel uitmaken van farmacologisch actieve verbindingen. Vanwege de basiciteit van deze verbindingen dragen ze over het algemeen een positieve lading in waterige oplossingen met een zure of neutrale pH. Dit kan leiden tot slechte chromatografische prestaties, overbelastingsverschijnselen en slechte retentie-eigenschappen[6]. LC-MS/MS werkte onder reversed-phase chromatografie en mobiele fasen met een hoge pH heeft duidelijke voordelen getoond voor de analyse van zeer polaire basische geneesmiddelen. Onder mobiele fase-omstandigheden met een hoge pH worden basische moleculen gedeprotoneerd en daardoor minder polair. Door de sterkere retentie kunnen de basische verbindingen uit de kolom worden geëlueerd met een mobiele fase die rijk is aan organisch oplosmiddel, en dit leidt over het algemeen tot een hogere gevoeligheid met een elektrospray-ionisatiebron (ESI). 

Bovendien voorkomt de hogere retentie van de sterk polaire basische geneesmiddelen in vergelijking met het oplosmiddelfront een drastische onderdrukking van ionisatie door endogene bestanddelen in biologische matrices zoals plasma, volbloed en urine. Wegens de wijziging van ionisatietoestand van basische opgeloste stoffen, kan de selectiviteit van een HPLC-scheiding ook aanzienlijk worden verbeterd onder mobiele fase-omstandigheden met een hoge pH.

Casestudy: de bioanalytische methode voor ivabradine en zijn metaboliet in humaan plasma

Een gevoelige LC-MS/MS-methode voor gelijktijdige kwantificering van Ivabradine en zijn actieve metaboliet N-Desmethyl Ivabradine werd ontwikkeld. Het lineaire dynamische bereik van de methode is van 0.10 tot 100.0 ng/ml voor Ivabradine en van 0.01 tot 10 mg/ml voor N-Desmethyl-ivabradine. De inactieve metaboliet dehydro Ivabradine werd ook getest als interferentie tijdens de validatie van de methode bij 2.50 ng/ml in het plasmamonster. Dehydroivabradine verschilt slechts met 1 atomaire massa-eenheid (amu) van ivabradine en kan daarom niet alleen door massaspectrometrie van ivabradine worden onderscheiden. 

Het meest uitdagende aspect van deze methode is de LC-scheiding van drie verbindingen. Zonder scheiding zou Dehydro Ivabradine de piekvorm van Ivabradine kunnen beïnvloeden en daarmee de kwantitatieve nauwkeurigheid van de methode. 

Na zorgvuldige optimalisatie van de mobiele fase en kolommen, werden de drie componenten met succes gescheiden op een Waters X-Bridge®-kolom met behulp van gradiëntelutie en een mobiele fase met hoge pH. De methode werd volledig gevalideerd en toegepast in biostudies.

Waarom zou je kiezen BioPharma-diensten?

Bij BioPharma Services voeren we LC-MS/MS-analyses uit met behulp van AB Sciex triple quadrupool massaspectrometers die zijn uitgerust met HPLC-systemen. Onze chromatografische scheidingsmogelijkheden omvatten omgekeerde-fase-, ionenpaar- en HILIC-scheidingstechnieken voor een breed scala aan kleinmoleculaire geneesmiddelen in verschillende matrices, zoals volbloed, plasma, urine en cerebrospinale vloeistof. 

Alle methoden zijn ontwikkeld om de impact van belangrijke metabolieten die aanwezig zouden zijn in klinische monsters te kunnen beoordelen. Tijdens bioanalytische methode ontwikkeling, mobiele fase met hoge pH is een krachtige techniek in de "chromatografie-toolbox" om analytretentie, piekvorm en selectiviteit te beheersen om de ontwikkeling mogelijk te maken van nauwkeurige, nauwkeurige en betrouwbare assays voor toepassing in klinisch onderzoek en niet-klinische (GLP) onderzoeken.

Geschreven door: Hongzhi liu en Dr. Nicola (Nicki) Hughes

BioPharma Services, Inc., een Denk Onderzoeksmaatschappij en dienstverlener op het gebied van klinische proeven, is een full-service Contract Clinical Research Organization (CRO) gevestigd in Toronto, Canada, gespecialiseerd in Fase 1 klinische onderzoeken 1/2a en Bio-equivalentie klinische proeven voor internationale farmaceutische bedrijven wereldwijd. BioPharma heeft klinische faciliteiten in zowel de VS als Canada met toegang tot gezonde vrijwilligers en speciale populaties.