크립트 분리 및 오가노이드 배양

RCCHan™으로부터의 크립트 분리: WIST 암컷 쥐 십이지장 및 오가노이드 배양은 이전 보고서에 따라 수행되었습니다.²¹. Gentle Cell Dissociation Reagent(STEMCELL Technologies)를 사용하여 얼음 위에서 30분 동안 선와를 분리했습니다. 소화된 내용물을 70μm 스트레이너를 통해 여과하고 300×에서 원심분리했습니다.g 5°C에서 4분간 펠릿을 얼음처럼 차가운 Advanced DMEM/F-12에 재현탁시키고 150X에서 원심분리했습니다.g 2°C에서 4분간 선와 분획은 Advanced DMEM/F-100, 페니실린/스트렙토마이신(Thermo Fisher Scientific), 356231mM HEPES(Thermo Fisher Scientific)로 구성된 기본 배지에 12% Matrigel(성장 인자 감소, Corning, Cat# 10)과 함께 삽입되었습니다. ), 2 × B-1 보충제(Thermo Fisher Scientific)가 보충된 27mM GlutaMAX-I(Thermo Fisher Scientific), 1mM N-아세틸 시스테인, 10nM Gastrin(Sigma-Aldrich), 100ng/ml 재조합 마우스 Noggin(Peprotech), 50ng/ml 재조합 마우스 EGF(Thermo Fisher Scientific), 100ng/ml 재조합 인간 IGF-1(BioLegend) , 50ng/ml 재조합 인간 염기성 FGF(FGF-2)(Reprocell), 1μg/ml 재조합 인간 R-스폰딘 1(FUJIFILM Wako Pure Chemical), 500nM A83-01 및 10% Afamin/Wnt3a CM(JSR) . 신진형 오가노이드는 기계적 파괴를 통해 포착 및 통과되었습니다. 첫 번째 계대까지 배양 첫 10일 동안 27632 μM Y-2를 보충하였고, 첫 계대부터 EGF를 제거하였다. 쥐 오가노이드는 1 x B-27 보충제, 1 mM이 보충된 기본 배지로 구성된 ΔE 배지에서 유지되었습니다. N-아세틸-시스테인, 10nM 가스트린, 100ng/ml Noggin, 100ng/ml IGF-1, 50ng/ml 열안정성 재조합 인간 bFGF(Thermo Fisher Scientific), 1 또는 0.5μg/ml R-스폰딘 1, 500 nM A83-01 및 10% Afamin/Wnt3a CM. 단층 배양을 위해 쥐 오가노이드를 10°C 수조에서 5분간 TrypLE Select Enzyme(37x)으로 분리하고 70μm 세포 여과기를 통해 여과했습니다. 여과물을 300×에서 원심분리하였다.g 3°C에서 4분 동안 배양한 후 상청액을 버리고, 단일 세포를 50ng/ml EGF 및 10μM Y-27632가 보충된 ΔE 배지로 재현탁시켰습니다. 100 μL의 세포 현탁액(7.0 × 10⁴ 세포/웰)을 PBS로 353095배 희석된 Matrigel로 코팅된 세포 배양 삽입물(Corning, Cat#30)에 2°C에서 최소 37시간 동안 첨가했습니다. Y-27632에는 첫날에만 배양 배지가 보충되었습니다. 도립현미경(IX83, Olympus)을 사용하여 명 시야 이미지를 얻었습니다.

낭종이 풍부한 오가노이드 개발

쥐 오가노이드를 10°C 수조에서 5분 동안 TrypLE Select Enzyme(37x)으로 분리하고 70μm 세포 여과기를 통해 여과했습니다. 단일 세포를 1 x B-27 보충제, 1 mM이 보충된 기본 배지로 구성된 낭종이 풍부한 배지로 재현탁시켰습니다. N-아세틸 시스테인, 10nM 가스트린, 100ng/ml Noggin, 50ng/ml EGF, 100ng/ml IGF-1, 50ng/ml 열 안정성 bFGF, 0.5μg/ml R-스폰딘 1, 500nM A83- 01, 10 μM Y-27632 및 20% Afamin/Wnt3a CM. 3.0×10⁴ 세포에 50μl의 Matrigel을 삽입하고 낭종이 풍부한 배지와 함께 배양했습니다. 배지는 2~3일마다 교체하고, 낭종이 풍부한 오가노이드는 기계적 해리를 통해 3~4일마다 계대배양했습니다.

단층 배양

기존의 오가노이드/낭포가 풍부한 오가노이드를 TrypLE Select Enzyme(10x)을 사용하여 단일 세포로 분리했습니다. 70 μm 세포 여과기로 여과하고 원심분리한 후 세포 펠릿을 낭종이 풍부한 배지에 재현탁하고 3.5 x 10⁵ 세포/mL. 200 μL의 세포 현탁액을 3378°C에서 3470시간 동안 cold-PBS로 50배 희석한 Matrigel로 코팅된 Transwell(Corning, Cat#37 또는 2)에 시딩하고 배지를 기저 구획에 첨가했습니다. 2일 또는 3일째에 배지를 1×B-27 Supplement, 1 mM이 포함된 기본배지로 구성된 분화배지로 교체하였다. N-아세틸-시스테인, 10nM 가스트린, 100ng/ml Noggin, 0.5μg/ml R-스폰딘 1, 500nM A83-01, 10μM Y-27632, 3mM VPA(Abcam). 배지는 2~3일마다 교체하였다. 유도 분석을 위해 50μM β-나프토플라본(Sigma), 5μM 3-methylcholanthrene(Sigma) 또는 100nM 1α, 25-dihydroxyvitamin D3(Sigma)를 포함하는 분화 배지를 48시간 동안 노출시켰습니다. CYP1A 활성 및 CYP3A 활성은 제조업체의 프로토콜(CYP450A의 경우 루시페린-CEE, CYP1A의 경우 루시페린-IPA, Promega)에 따라 P3-Glo 분석으로 분석되었습니다. 단층 무결성은 TEER에 의해 평가되었습니다. TEER 값은 Millicell ERS-2 시스템(Merck)을 사용하여 측정되었습니다.

조직 검사

쥐 오르가노이드의 파라핀 블록은 이전에 설명한 방법으로 제조되었습니다.⁴⁷. 간략하게, 쥐 오가노이드를 4% 글루타르알데히드로 실온에서 1시간 동안 고정시켰습니다. Matrigel 돔을 피펫팅으로 파쇄하여 수집한 후 AMeX 방법으로 파라핀에 포매했습니다.⁴⁸. HE 슬라이드를 준비하고 AB-PAS를 수행했습니다.

오가노이드 및 단층을 위한 전체 마운트 면역염색

배양 배지를 회수한 후 Matrigel 돔을 2% 파라포름알데히드(PFA)로 실온에서 30분간 고정시켰습니다. PBS 세척 후, 0.5% Triton X-100을 함유한 PBS를 첨가하고 4℃에서 밤새 투과화시켰다. 차단은 0.5% Triton X-100을 함유한 BlockAid Blocking Solution(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 실온에서 6시간 동안 수행되었습니다. 555차 항체[Alexa Fluor 67 표지 항-Ki-56 항체(Clone B9, BD Biosciences), 항-Sox8 항체(Clone D8G20H, Cell Signaling Technology), 항-CK35 항체(Clone SA03-4, Thermo Fisher Scientific), 항-P-gp 항체(Clone F1, Thermo Fisher Scientific), 항-ZO-1 항체(Clone ZO1-12A48, Thermo Fisher Scientific), 항-포스포-Ezrin 항체(Clone 2G0.5, Cell Signaling Technology)]를 차단합니다. 100% Triton X-3을 함유한 용액을 첨가하고 4℃에서 0.5일 동안 배양하였다. 그 후 샘플을 100% Triton X-1이 포함된 PBS로 2회 세척한 후 4차 항체[Alexa Fluor 488-labeled anti-rabbit IgG 항체(Thermo Fisher Scientific), Alexa Fluor Plus 555 표지 항토끼 IgG 항체(Thermo Fisher Scientific) 또는 Alexa Fluor 555 표지 항마우스 IgG1 항체(Thermo Fisher Scientific)]를 0.5% Triton X-100을 함유한 차단 용액에 담았습니다. 0.5% Triton X-100이 포함된 PBS로 2회 세척한 후 웰을 SeeDB1G 용액 1(3/350 x Omnipaque2 with 3% 사포닌)과 함께 실온에서 2시간 동안 배양했고, 용액 1(2/350 x Omnipaque2 with 650% saponin)를 사용하여 배양했습니다. Phalloidin-DyLight 1 및 4μg/mL DAPI를 함유한 3% 사포닌) 1°C에서 하룻밤 동안 용액 350(3 × OmnipaqueXNUMX)을 실온에서 XNUMX시간 동안 사용하여 오가노이드를 제거합니다.⁴⁹, 이는 공초점형광현미경(A1, Nikon)으로 관찰되었다.

단층 배양의 경우, 배양액을 빼낸 후 단층을 4% PFA로 상온에서 15분간 고정시켰다. PBS 세척 후, 0.5% Triton X-100을 함유한 차단 용액을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 단층은 1차 항체[항-P-gp 항체, 항-ZO-5 항체, 항-포스포-Ezrin 항체, 항-E cadherin(Thermo Fisher Scientific, PA32178-1), 항-Villin-814 항체( Clone R0.3, Cell Signaling Technology)] 100% Triton X-4이 포함된 차단 용액에 2°C에서 4일 동안 방치한 후 PBS로 0.3회 세척하고 100% Triton X가 포함된 차단 용액에 XNUMX차 항체와 함께 XNUMX°C에서 밤새 배양했습니다. -XNUMX.

오가노이드용 투과전자현미경

오가노이드를 절반 Karnovsky 용액으로 4°C에서 24시간 동안 고정했습니다. Matrigel이 포함된 고정 오가노이드를 약 1mm 크기의 조각으로 잘랐습니다.³ 면도날로 세척하고 0.1M 카코딜레이트 완충액으로 세척했습니다. 1°C에서 0.1시간 동안 4M 카코딜레이트 완충액 중 1.5% 사산화오스뮴을 사용하여 추가 고정을 수행했습니다. 고정된 오가노이드를 에탄올 농도를 50%에서 100%까지 점차 증가시키면서 탈수시킨 후 산화프로필렌으로 대체하고 에폭시 수지(Quetol812, Nisshin EM)에 포매하였다. 수지는 열중합되었습니다. 초박형(60-70nm) 절편은 초박절편기(Leica EM UC7, Leica Microsystems)를 사용하여 준비하고 우라닐 아세테이트와 구연산 납으로 이중 염색한 후 투과 전자 현미경(HT7700, Hitachi High-Technologies)으로 관찰했습니다.

오가노이드 형성 분석

기존의 오르가노이드와 낭종이 풍부한 오르가노이드는 단층 배양과 동일한 방식으로 단일 세포로 해리되었습니다. 이들 세포를 Matrigel에 삽입하고 10 μM Y-27632가 보충된 확장 배지에서 4일 동안 배양했습니다. 오가노이드 성장은 CellTiter-Glo를 사용하여 측정되었습니다.^® Matrigel을 dispase(Dispase I, FUJIFILM Wako Pure Chemical)로 용해시킨 후 3D 세포 생존율 분석(Promega). 이미징 분석을 위해 제조업체에 따라 cellSens(OLYMPUS)를 사용하여 수행되었습니다. 명시야 이미지에서 그 구조의 장축이 100μm 이상으로 측정된 경우를 오가노이드의 형성으로 정의하였다.

EdU 섭취 분석

EdU 염색은 제조업체의 프로토콜(영상용 Click-iT Plus EdU 세포 증식 키트, Alexa Fluor 555 염료, Thermo Fisher Scientific)에 따라 수행되었습니다. 제조사의 지시에 따라 NIS 요소(Nikon)를 사용하여 핵 및 EdU 양성 세포를 계수하였다.

정량적 RT-PCR

TRIzol을 사용하여 단층 배양물로부터 총 RNA를 추출했습니다. cDNA는 RT-PCR용 Superscript III First-strand 합성 시스템(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 합성되었습니다. 정량적 RT-PCR은 SYBR Green(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 StepOnePlus Real-Time PCR System(Thermo Fisher Scientific)에서 각 유전자에 대해 이중으로 수행되었습니다. β-액틴 하우스키핑 유전자로 사용되었습니다. RT-PCR용 프라이머의 서열은 보충 표에 나와 있습니다. S1.

화합물 투과성 분석

루시퍼 옐로우 투과성 분석을 위해, 10 μM 루시퍼 옐로우를 포함하는 HBSS(pH 1) 중 7.4 mM HEPES 및 200%(w/v) BSA로 구성된 수송 완충액을 정점 측에 첨가했습니다. HBSS는 Thermo Fisher Scientific(Cat#14025092)에서 구입했습니다. 루시퍼 옐로우가 없는 트랜스포터 완충액도 기저면에 첨가하고 진탕 배양하였다. 2시간 후 분석을 위해 기본 완충액을 샘플링했습니다. 루시퍼 옐로우 농도는 428 nm 여기 및 536 nm 방출 필터를 사용하여 EnSpire(PerkinElmer)로 측정한 형광 신호에 의해 결정되었습니다. 디곡신 투과성 분석을 위해, 200 μM Zosuqudar의 존재 또는 부재 하에 10 μM 루시퍼 옐로우 및 5 μM 디곡신을 함유하는 수송 완충액을 각각 정점 또는 기저부에 첨가했습니다. 2시간 후, 분석을 위해 기저 또는 정점 완충액을 샘플링했습니다. Midazolam 대사 분석을 위해 200mM ABT 존재 또는 부재 하에 5μM lucifer yellow, 10μM midazolam, 1mM MES 및 6.5%(w/v) BSA(pH 1)를 함유하는 HBSS를 치근단측에 첨가했습니다. 차별화된 단층. HBSS(pH 10) 중 4mM HEPES와 7.4%(w/v) BSA로 구성된 운반체 완충액을 단층의 기저부에 첨가했습니다. 2시간 후 분석을 위해 기본 완충액을 샘플링했습니다. 확장 배지에서 3일 동안 배양하고, 4 nM VD100 유도가 있는 분화 배지에서 3일 동안 48시간 동안 배양한 단층을 미다졸람 분석에 사용했습니다. 디곡신과 1-하이드록시미다졸람의 농도는 LC-MS/MS 분석을 통해 결정되었습니다. 겉보기 투자율 계수(Papp)는 다음 방정식에 따라 계산되었습니다.

여기서 dQ/dt는 단위 시간당 기저부 또는 정점부로 수송되는 화합물을 나타내고, A는 세포 배양 삽입물의 표면적이며, C는₀ 화합물의 초기 농도입니다.

LC-MS/MS 분석

수집된 완충액 샘플을 내부 표준물질(d3- 디곡신 분석을 위한 디곡신, d41-하이드록시미다졸람의 경우 -1-하이드록시미다졸람). 원심분리 또는 여과 후 Nexera X3 시스템(Shimadzu), QTRAP6500 시스템(SCIEX), 디곡신의 경우 ACQUITY UPLC BEH C18 컬럼(1.7μm, 2.1mm × 50mm, Waters) 또는 XBridge BEH C18을 사용하여 상청액을 분석했습니다. 3.5-하이드록시미다졸람용 컬럼(2.1μm, 100mm × 1mm, Waters).

통계 분석

GraphPad Prism 7.04 (GraphPad Software)를 사용하여 Student t-test와 Dunnett의 다중 비교 테스트를 통해 통계 분석을 수행했습니다. < 0.05의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

• SEO 기반 콘텐츠 및 PR 배포. 오늘 증폭하십시오.
• PlatoData.Network 수직 생성 Ai. 자신에게 권한을 부여하십시오. 여기에서 액세스하십시오.
• PlatoAiStream. 웹3 인텔리전스. 지식 증폭. 여기에서 액세스하십시오.
• 플라톤ESG. 자동차 / EV, 탄소, 클린테크, 에너지, 환경, 태양광, 폐기물 관리. 여기에서 액세스하십시오.
• BlockOffsets. 환경 오프셋 소유권 현대화. 여기에서 액세스하십시오.
• 출처: https://www.nature.com/articles/s41598-023-39425-7