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지속 가능한 1,4-부탄디올 합성을 위한 공학 생물학

플라톤에 의해 재발행
플라톤에 의해 재발행

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생촉매는 현대 화학 산업이 환경에 미치는 영향을 해결하는 데 도움이 되는 녹색 화학의 초석입니다. 기존의 화학 합성과 비교하여 생체 촉매는 에너지 집약적인 반응 조건, 독성 용매 및 다운스트림 처리 요구 사항을 우회하여 보다 친환경적인 합성 프로세스를 촉진합니다.

1.

  • 쉘든 RA
  • et al.
생체 촉매 작용에 대한 히치하이커를 위한 안내서: 유기 합성에서 효소 사용의 최근 발전.

]. 또한 미생물 숙주 내에서 유전적으로 암호화되고 XNUMX차 대사 반응과 인터페이스될 때 재생 불가능한 화석 연료가 아닌 지속 가능한 바이오 기반 공급 원료의 발효를 통해 원팟에서 다단계 화학 합성을 수행할 수 있습니다. 리그닌 및 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 플라스틱과 같은 '폐기물' 공급원료를 XNUMX차 대사 기질로 재활용하는 미생물과 결합하여 지속 가능한 합성을 위한 공학 생물학은 산업 화학의 황금기를 시작하고 있습니다.

현장에서의 이전 작업은 실험실 미생물에서 고유한 생합성 경로를 재구성하고 강화함으로써 자연에서 알려진 대사산물인 플랫폼/벌크 및 정밀 화학물질을 대상으로 했습니다. 그러나 이 접근 방식은 오늘날 화학 산업에서 사용되는 작은 분자의 일부로 제한되므로 비천연 기원의 귀중한 화학 물질을 생산하기 위한 생물학적 시스템을 엔지니어링하는 것은 앞으로 나아가는 분야에서 중요한 과제입니다.

이 분야의 새로운 전략에는 리팩토링된 생합성 경로의 사용, 비 고유 화학을 수행하기 위한 효소의 진화, 자연에 새로운 효소의 계산 설계, 조작된 대사와 함께 작동하도록 비효소 촉매의 용도 변경이 포함됩니다. 경로('생체적합성 화학'이라고 함). Yim의 중요한 예 et al. 결합하여 이 분야에서 가장 초기에 성공한 것 중 하나입니다. 실리에 포도당으로부터 비천연 화학 1,4-부탄디올(BDO)의 높은 수준의 생물 생산을 달성하기 위한 대사 공학을 통한 경로 설계 [

2.

  • 임 H.
  • et al.
대사 공학 대장균 1,4-부탄디올의 직접 생산용.

].

BDO는 중요한 물질(예: 스판덱스)과 산업 제품(예: 테트라하이드로푸란)을 합성하는 데 널리 사용되는 석유화학 물질입니다.

3.

  • 주 Y.
  • et al.
바이오 기반 1,4-부탄디올 및 테트라히드로푸란 합성: 관점.

]. 그러나 전통적인 제조 경로는 지속 불가능한 화석 자원(아세틸렌 또는 n-부탄) 및 에너지 집약적 화학 공정. 따라서 발효에 의해 지속 가능한 공급원료로부터 BDO 생산을 가능하게 하는 엔지니어링 생물학은 중요한 과제입니다.

이 연구는 사내 SimPheny Biopathway Predictor 소프트웨어를 사용하여 적합한 '반응 연산자'를 식별하는 것으로 시작하여 ca. 중앙 대사 중간체에서 알려진 대사 화학(알려진 효소에 의해 반드시 촉매되는 것은 아님)을 통해 BDO로 가는 10개의 실행 가능한 경로. 경로 길이, 기본이 아닌 단계 수, 바람직하지 않은 열역학 및 최대 이론 수율을 포함한 속성을 기반으로 한 반복 순위는 사용 가능한 경로 설계를 초기 적중의 약 000%로 통합했습니다. 중앙 대사에서 가장 짧은 수의 단계를 대상으로 하는 알려진 효소 화학에 기반한 수동 큐레이션으로 인해 저자는 중간체 10-하이드록시부티레이트(4-HB)를 중심으로 두 가지 경로 디자인을 만들었습니다. 이후 두 번의 연속적인 NAD(P)에 의해 BDO로 감소될 수 있습니다. 4-하이드록시부티릴-CoA를 통한 H 의존적 효소 환원. 숙시닐 세미알데하이드를 통한 4-HB로의 4가지 경로가 제안되었다: 숙시네이트로부터, 숙시닐-CoA 신타제 및 CoA-의존 탈수소효소에 의해 촉매되는 숙시닐-CoA를 통해; 그리고 α-케토산 데카르복실라제에 의해 촉매되는 α-케토글루타레이트(그림 1). 4-HB 생합성 및 후속 환원 경로는 서로 다른 환경에서 두 개의 개별 '모듈'로 구성되고 검증되었습니다. 대장균 MG1655 라씨Q+ 단일 균주로 결합되기 전에 균주. 결과는 1.3시간 배양 후 40mM BDO였으며, 낮기는 했지만 미생물의 중심 대사산물로부터 BDO 생합성의 첫 번째 사례를 표시했습니다.

Figure 1

그림 1대사 공학 대장균 탄수화물 공급원료로부터 지속 가능한 1,4-부탄디올 합성을 위해.

전체 캡션보기

약어 : C. 베이제린키이(C. beijerinckii), 클로스트리디움 베이제린키이(Clostridium beijerinckii); 4-HB, 4-하이드록시부티레이트; 엠. 보비스, 마이코박테리움 보비스; P. 진지발리스, 포르피로모나스 진지발리스.

OptKnock 알고리즘을 사용하여 다중 녹아웃(ΔadhE, Δpfl, ΔLDH및 ΔMDH) 최대 BDO 생산을 세포 성장에 연결하여 에탄올, 포름산염, 젖산염 및 숙신산염에 대한 천연 발효 경로를 차단하고 BDO 생산을 유도하여 혐기성 조건에서 0.37g/g 수율을 예측하여 세포 산화 환원의 균형을 맞춥니다. 실제로, 녹아웃은 Δ로 세포 적합도를 심각하게 감소시켰습니다.adhEΔpflΔLDH 혐기성 조건에서 자랄 수 없는 중간 균주; 실험 조건 하에서 감소된 활성을 나타내는 천연 피루베이트 탈수소효소를 통한 재전환된 탄소 플럭스 때문일 가능성이 높습니다. 제한 서브유닛(lpdA)의 기능적 동족체 폐렴 간균, 이 장벽은 다음의 일반적인 한계를 강조합니다. 실리에 복잡한 대사 시스템에서 비경로 효과를 설명하기 위한 예측 모델과 합리적인 경로 공학을 통해 이러한 효과를 완화할 수 있는 방법. 회수된 균주는 개선된 BDO 생산을 나타내었지만 미세호기성 조건에서만 성장했으며 아세테이트, 피루베이트, 에탄올, 중단된 경로 중간체 및 4-하이드록시부티릴- CoA. 이를 해결하기 위해 저자는 녹아웃을 통해 BDO 합성을 통한 플럭스의 우선순위를 정했습니다. 아크A 과 MDH 호기성으로 발현된 여러 산화적 TCA 주기 유전자의 전사 억제를 완화하고 환원적 TCA 주기로의 진입을 각각 차단합니다. TCA 주기 중간체를 증가시키기 위해 NADH에 민감하지 않은 구연산 합성 효소 돌연변이 GltA(R163L)의 발현에 의해 생성된 균주는 BDO에 대한 95% 탄소 플럭스와 ca. 13시간 후 40mM. 펄스 라벨링에 의한 조작 변형률의 최종 평가 13C-포도당은 하류 경로에서 비효율적인 알코올 및 알데하이드 탈수소효소 활동으로 인해 발생하는 말기 4-HB 병목 현상을 나타냅니다. 코돈 최적화된 알데하이드 탈수소효소 클로스트리디움 베이제린키 4-HB-CoA에서 BDO로의 개선된 환원을 내인성 E. 대장균 아세트알데하이드에서 에탄올로 최소한의 경합 백그라운드 환원을 수반하는 환원효소 효소.

마지막으로 저자는 대체 탄수화물 공급원료를 포함하도록 경로를 확장했습니다. 자당 이용 오페론을 E. 대장균 게놈, 비교 가능한 BDO 역가는 자당, 자일로스 및 불순한 혼합 바이오매스 가수분해물에서 달성되었으며, 후자는 상대적으로 높은 비용과 대규모 공급원료로 포도당을 사용하는 환경적 영향을 고려할 때 생물공정 관점에서 매력적인 유연성을 제공합니다.

4.

  • 살림 I.
  • et al.
발효 원료인 밀에서 추출한 포도당의 환경적 지속 가능성 평가.

].

최종 조작된 균주는 18일 발효 동안 20g/l 포도당에서 5g/l BDO를 생산했습니다. 지속 가능한 화학 합성을 위한 대사 공학, 합성 생물학 및 산업 생명 공학 개발의 초기 단계에서의 이러한 성과는 주목할 만하며 예측을 통해 달성할 수 있는 것에 대한 기준을 설정합니다. 실리에 신진대사 모델링, 합리적 신진대사 공학, 드 노보 생화학적 경로 디자인. 여기에서 달성된 역가는 또한 알려진 대사물의 과잉 생산에 대해 보고된 역가를 능가했습니다 E. 대장균. 예를 들어, 이소프렌 생산은 2011년에 단 314mg/l 규모의 포도당 발효에 의해 달성되었습니다.

5.

  • 자오 Y.
  • et al.
에서 이소프렌의 생합성 대장균 메틸에리트리톨 포스페이트(MEP) 경로를 통해.

].

이 중요한 작업을 기반으로 지속적인 노력을 기울여 설계하고 상용화했습니다. E. 대장균 재생 가능한 공급원료로부터 125g/l BDO를 생산할 수 있는 균주 [

6.

  • 버가드 A.
  • et al.
설탕으로부터 1,4-부탄디올 생산을 위한 상업적 규모 공정 개발.

]. 산업적 사용에는 규모 확장에 필수적인 유전자 재구성 외에도 광범위한 숙주 계통 및 경로 공학(>50개의 추가 유전자 편집)이 필요했습니다. 원래 보고서와 일관되게 다음과 같은 합리적인 설계를 통해 새로운 수정 사항이 도입되었습니다. 13C 플럭스 및 전 사체 분석. 녹아웃 Δ슬픈ΔgabD 높은 4-HB 농도에서 석시네이트 세미알데하이드가 석시네이트로 전환되는 것을 제한하여 BDO 역가를 18g/l에서 29g/l로 증가시킴으로써 플럭스가 TCA 사이클로 다시 이동하는 것을 방지했습니다.

7.

  • 바튼 NR
  • et al.
지속 가능한 화학 공정 개발을 위한 통합 생명공학 플랫폼입니다.

]. 추가 균주 개선은 속도 제한 및 부산물 형성의 원인과 경쟁하는 부반응을 해결하는 데 중점을 두었습니다. 플럭스 분석은 최적화가 4-80g/l 규모에 도달하면 90-HB에서 BDO로의 최종 감소 단계 동안 경로에서 속도 제한 병목 현상을 정확히 지적했습니다. 이와 같이, Ald 및 Cat2 효소는 각각 경쟁하는 Ac-CoA 감소 경로를 억제하고 높은 BDO 역가에서 생성물 억제를 극복하기 위해 유도 진화를 통해 조작되었습니다. 일단 구현되면, 진화된 효소는 4-HB 역가를 75%까지 감소시킨 반면 BDO 역가는 20% 증가하여 110g/l [

6.

  • 버가드 A.
  • et al.
설탕으로부터 1,4-부탄디올 생산을 위한 상업적 규모 공정 개발.

]. 부산물 형성을 해결하기 위해, PPC 피루베이트로부터의 전체 TCA 사이클 플럭스를 향상시키기 위해 발현을 증가시켰다. 또한 ATP 비효율적인 전자 수송 사슬 구성 요소(ΔNDHΔ앱BCΔcydAB), 티오에스테라제(ΔybgCΔ테스B), 아세테이트 키나제/포스포트랜스아세틸라제(ΔackA-pta) 유전자는 CO 감소2, GBL 및 아세테이트 형성. 이러한 수정은 125g/l의 최종 BDO 역가에 도달하는 원인이 되었습니다.

산업적 활용을 개선하기 위해 유전적 안정성을 개선하고 처리 비용을 줄이기 위해 유전적 부분의 최종 재구성이 필요했습니다. 이는 구성적 프로모터 하에서 플라스미드로 인코딩된 경로 유전자의 염색체 통합 및 불안정한 숨겨진 프로파지의 제거에 의해 달성되었습니다. 추가 유전적 안정성은 파지 관련 수용체 유전자를 돌연변이시킴으로써 부여되었다.톤A/양고기) 중복 게놈 영역을 제거합니다. 이 안정화된 균주는 최종 성장 배지 및 생물공정 최적화를 거쳐 다운스트림 처리 단계를 최소화하여 상업화를 위한 최종 BDO 생산 균주를 제공했습니다.

이 작업의 성공은 미생물 생체 촉매 분야의 이정표 역할을 하며 공학적으로 실현 가능한 가능성을 보여줍니다. 드 노보 대규모 생합성 경로. 지속적인 효소 발견, 점점 더 빨라지는 효소 공학 및 합성 생물학 방법과 함께 보다 지속 가능한 화학 제조 기술에 대한 필요성과 수요가 현실화됨에 따라 이 분야의 밝은 미래가 분명히 있습니다.

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