일차 뉴런 배양 준비

동물 조직 수확과 관련된 실험 프로토콜은 동물 복지에 관한 스위스 연방법에 따라 Canton Basel-Stadt의 수의과 사무실에서 승인되었으며 승인된 지침에 따라 수행되었습니다. HD-MEA 칩 또는 유리 커버슬립을 70% 에탄올에서 60분 동안 멸균하고 층류 기류 하에서 멸균 탈이온수로 세척했습니다. 그런 다음 전극 어레이 또는 커버슬립을 붕산염 완충액(Thermo Fisher Scientific)에 용해된 10μl의 0.05%(v/v) 폴리(에틸렌이민)(Sigma-Aldrich)으로 실온에서 40분 동안 처리하고 탈이온수로 세척한 후 8 mg ml 0.02 μl와 함께 배양하여^{- 1} 라미닌(Sigma-Aldrich)을 신경기저(NB) 배지(Gibco)에서 30°C에서 37분 동안 처리합니다. E-18 Wistar 쥐 배아를 얼음처럼 차가운 HBSS(Gibco)에서 해부하여 피질을 수확한 다음 0.25% 트립신-EDTA(Gibco)에서 분리했습니다. 해리된 피질 세포를 부드럽게 분쇄하고 0.45 μm 체를 통해 여과하여 단일 세포를 얻었습니다. 세포 밀도를 추정하였고, 10개 세포 3,000μl를 사용하였습니다.^{- 1} 용액을 전극 배열 위에 도금했습니다. 37 ml의 NB 도금 배지를 첨가하기 전에 칩을 40 ° C에서 2 분 동안 배양하여 세포를 어레이에 부착하도록 허용했습니다. NB 플레이팅 배지는 Neurobasal(Gibco) 50ml에 말 혈청(HyClone) 1.25ml, 글루타맥스(Invitrogen) 10ml 및 B-27(Invitrogen) 450ml를 첨가하여 제조하였다. HD-MEA 칩은 37°C 및 5% CO의 세포 배양 인큐베이터 내부에 보관되었습니다.₂. 3일 후, 20일에 한 번씩 배양 배지의 50%를 새로운 NB 도금 배지로 교환하여 세포를 무혈청 NB 도금 배지에서 DIV 3까지 배양하였다. 그림에 표시된 데이터를 제외한 모든 실험. 1i, DIV 14와 16 사이에 세포가 성장하는 동안 다른 기계적 특성을 나타냈기 때문에 수행되었습니다.¹¹. 그림 1에 표시된 데이터에 대한 실험입니다. 1i 뉴런 네트워크가 동기 파열 활동을 보인 DIV 22와 24 사이에 수집되었습니다.

소뇌 슬라이스 준비

야생형 마우스(출생 후 14일 C57BL/6Rj, Janvier Labs)는 이소플루란 마취하에 목이 잘렸습니다. 그들의 뇌를 제거하고 얼음처럼 차가운 탄수화물 버블(95% OXNUMX)에 담갔습니다.₂ + 5% CO₂) 인공 뇌척수액(aCSF) 용액. 시상 소뇌 조각 ∼vibratome (VT350S, Leica)을 사용하여 1200 μm를 얻었습니다. 모든 슬라이스는 사용할 때까지 aCSF의 실온에서 유지되었습니다. aCSF는 125mM NaCl, 2.5mM KCl, 2mM CaCl로 구성되었습니다.₂, 1 mM MgCl₂, 25mM 포도당, 1.25mM NaH₂PO₄ 및 25mM NaHCO₃. 그런 다음 HD-MEA 칩의 전극 배열을 붕산염 완충액(Thermo Fisher Scientific)에 용해된 10μl의 0.05%(v/v) 폴리(에틸렌이민)(Sigma-Aldrich)으로 실온에서 40분 동안 처리하고 탈이온수로 세척했습니다. 물, 8 mg ml 0.02 μl로 배양^{- 1} 라미닌(Sigma-Aldrich)을 Neurobasal 배지(Gibco)에서 30°C에서 37분 동안 처리했습니다. 인큐베이션 후 과잉 라미닌을 피펫으로 제거하고 어레이를 건조시켰습니다. 피펫팅 중 전단력으로 인한 손상을 방지하기 위해 절단된 피펫 팁을 사용하여 소뇌 슬라이스를 전극 어레이에 부드럽게 배치했습니다(보조 그림 XNUMX). 13). 2mm 맞춤형 하프를 조직 조각 위에 배치하여 조직 조각을 고정했습니다. 그런 다음 조직 조각을 한 방울씩 부드럽게 추가하여 aCSF에 담갔습니다. aCSF에 담근 고정화된 조직 절편을 30분 동안 전극 배열에 부착시켰습니다. 녹음 직전에 하프를 제거하고 AFM 헤드를 HD-MEA 칩에 장착했습니다. 세포 생존력과 활성을 유지하기 위해 조직에 카보겐 버블 aCSF를 지속적으로 관류했습니다.

HD-MEA 설정

26,400 × 17.5mm의 전체 감지 영역 내에서 3.85개의 전극(2.10μm 피치)을 갖춘 CMOS(상보형 금속 산화물 반도체) 기반 HD-MEA 칩² 사용 된²⁵. 칩은 상업용 주조소에서 제조되었으며 사내에서 후처리 및 포장되었습니다(보조 그림 2). 1b). 직경 4cm의 투명한 폴리카보네이트 링(GB Plex)을 칩에 접착하고 와이어 본드를 생체적합성 다크 에폭시(EPO-TEK 353 ND)로 캡슐화했습니다. 전극의 백금-흑색 코팅은 전극 임피던스를 감소시키고 신호 대 잡음 특성을 향상시키기 위해 전착되었습니다(보조 그림 XNUMX). 1c). 맞춤형으로 개발된 HD-MEA 시스템의 상용 버전(MaxOne 모델)은 MaxWell Biosystems에서 구입할 수 있습니다.

샘플 홀더 및 스테이지 히터

폐쇄 루프 피드백을 위한 온도 프로브가 있는 열전 펠티에 기반 샘플 히터는 샘플을 37°C로 유지하기 위해 집에서 만든 온도 컨트롤러로 제어되었습니다. 샘플 히터는 HD-MEA 칩의 열 전도 패드와 정렬되었습니다. 그런 다음 칩을 샘플 홀더에 장착하고 홀더의 스프링 장착 핀으로 제자리에 고정했습니다. Prusa I3 MK3S+는 샘플 홀더에 부착된 관류 설정을 위한 알뜰한 주사기 홀더를 3D 프린팅하는 데 사용되었습니다. 전체 셋업은 맞춤형으로 장착되었습니다. x,y 베이스 플레이트를 통한 피에조 스테이지.

x,y 피에조 스테이지

인코더 분해능이 1 nm인 두 개의 선형 피에조 스테이지(Xeryon XLS-5 시리즈)가 서로 수직으로 부착되었습니다(보조 그림 XNUMX). 1a). 선형 스테이지는 LabVIEW 기반 사용자 인터페이스에 연결된 Xeryon XD-M 다축 컨트롤러로 제어되었습니다. HD-MEA 칩의 왼쪽 상단 전극을 좌표계의 원점으로 등록하고, MaxWell Biosystems 사용자 인터페이스에서 관심 뉴런과의 전극 좌표를 추출했습니다. 그런 다음 이러한 좌표는 AFM 캔틸레버 아래에서 뉴런을 쉽게 배치할 수 있도록 사용자 정의 스크립트를 사용하여 XD-M 컨트롤러에 공급되었습니다.

장거리 형광현미경

25× 조정 가능한 줌 렌즈와 15.75× 대물렌즈(Nikon, MNH1 P55100-SHR PlanApo 2X, 개구수, 1)를 갖춘 광학 현미경(Nikon SMZ 0.156)을 본문에 언급된 대로 설정에 맞춰 정렬했습니다. TTL 제어가 가능한 발광 다이오드(LED) 조명기(CoolLED PE 300^ultra)는 여기/방출 필터 없는 이미징을 위한 광원으로 사용되었습니다. 삼중 대역통과 빔 스플리터(F66-412, AHF Analysentechnik)를 사용하여 HD-MEA 칩에서 반사된 여기광을 필터링했습니다. 2 × 4,908 픽셀(픽셀 크기, 3,264 × 7.3 µm)의 대형 CMOS 어레이 카메라(Nikon DS-QI7.3)²)는 2.5× f-마운트 프로젝터 렌즈를 사용하여 현미경에 장착되어 최종 배율로 최대 45fps의 샘플링이 가능합니다. ∼40× 및 픽셀당 0.46μm의 해상도.

AFM

AFM 헤드(Catalyst, Bruker)를 장착하고 본문에 언급된 설정에 맞게 정렬했습니다. 머리에 있는 15μm 피에조 스캐너를 사용하여 모든 힘-변위 및 힘-시간 곡선을 수집했으며, 150μm 피에조를 사용하여 뉴런에 캔틸레버를 배치했습니다. AFM 소프트웨어(Nanscope v.9.2, Bruker)를 사용하여 데이터를 수집하고 .txt 파일로 내보냈습니다. 데이터는 Python 스크립트를 사용하여 분석되고 표시되었습니다. 5 μm 직경의 실리카 비드(Kisker Biotech)를 자외선 접착제(Dymax)를 사용하여 팁이 없는 마이크로캔틸레버(CSC-37 또는 38, Micromash HQ)의 자유 단부에 접착하고 20분 동안 자외선 경화했습니다. 비드 캔틸레버를 플라즈마 클리너(Harrick Plasma)를 사용하여 5분 동안 청소한 다음 2mm 사파이어 창이 있는 유체 프로브 홀더에 장착하고 열 잡음 방법을 사용하여 보정했습니다.⁴⁸.

상관 AFM, HD-MEA 및 광학 현미경

AFM, HD-MEA 및 광학 현미경은 그림과 같이 정렬되었습니다. 1a). HD-MEA 칩의 뉴런에서 나오는 형광광은 AFM 캔틸레버 홀더의 사파이어 창을 통해 수집되어 광학 현미경으로 전달되었습니다. HD-MEA 칩의 뉴런의 형광 이미지를 관심 영역에서 순차적으로 수집하고 Maxwell MEA 사용자 인터페이스에 등록하여 HD-MEA 칩의 뉴런 위치를 파악했습니다(보조 그림 2). 2a~d). x,y 그런 다음 관심 있는 뉴런의 좌표가 x,y LabVIEW 스크립트를 통해 스테이지를 진행하여 AFM 캔틸레버를 원하는 위치에 배치합니다. ∼5nm 정밀도. 전체 설정은 감쇠 격리 테이블에 설치되었으며 기계적 소음과 열 드리프트를 줄이기 위해 소음 방지 및 온도 제어 챔버에 배치되었습니다.

TTL 동기화

DS-Qi2의 TTL 펄스는 3.5인치 24극 핀, 한쪽에는 미니 플러그, 다른 쪽에는 암 255 AWG 점퍼(RND 00015-1, Distrelec)가 있는 자체 제작 커넥터를 사용하여 추출되었습니다. 핀 4은 접지이고 핀 2.4(EXP_TMG)는 설정된 노출 시간에 따라 실시간 작동 시 HI(높음) 레벨에서 0V를 수신했습니다. 한쪽에 표준 BNC 수 핀이 있고 암 5 AWG 점퍼(RND 1)가 있는 자체 제작 커넥터를 통해 AFM 컨트롤러(Bruker Nanoscope V)의 전면 패널 출력 채널 24에서 255~00015V의 음의 펄스가 추출되었습니다. -2, Distrelec) 반대쪽에 있습니다. 카메라와 AFM 모두에서 추출된 신호는 단일 고속 광커플러의 핀 8와 20로 라우팅되었습니다. 그런 다음 신호는 현장 프로그래밍 가능 게이트 어레이를 통해 HD-MEA 데이터 수집 시스템으로 전송되어 XNUMXkHz에서 수집된 HD-MEA 데이터의 원시 파일 기록에서 AFM 및 광학 현미경으로 감지된 이벤트의 정확한 타임 스탬프를 제공합니다.

강성 추적 프로토콜 및 측정

겉보기 영률은 신경 세포체에서 수집된 30개의 힘-변위 곡선의 평균으로부터 계산되었습니다. 그런 다음 뉴런에 측정으로 인한 기계적 변화가 없는지 확인하기 위해 XNUMX초를 기다렸다가 XNUMX개의 힘-변위 곡선을 다시 수집했습니다(그림 XNUMX). 2a), 이를 하나의 측정 주기로 표시하고 하나의 점으로 표시합니다(그림 1). 2b). 우리는 뉴런에 대해 이 측정 주기를 최대 5분까지 반복하고 네트워크의 다음 뉴런으로 이동했습니다. 첫 번째 뉴런에 대한 첫 번째 측정 후 XNUMX분 후에 동일한 뉴런으로 돌아가 측정 주기가 반복되었습니다. 측정은 장기간 규모 추적 주기로 구성되었습니다. 이 장기간 추적 주기는 XNUMX번 반복되었습니다(그림 XNUMX). 2c). 신경돌기의 강성 측정을 위해 먼저 뉴런의 전기 생리학적 활동을 5분 동안 기록한 다음 뉴런당 두 개의 잘 분리된 신경돌기를 식별하고 이에 대한 힘-변위 곡선을 수집했습니다. 힘-변위 곡선은 CSC-38 마이크로캔틸레버(공칭 스프링 상수, ∼0.02N·m^{- 1}) 위에서 언급한 대로 5μm 직경의 비드가 특징입니다. 힘-거리 곡선을 수집하기 위해 체세포에 700pN, 신경돌기에 400pN의 최대 힘을 ​​사용했습니다(보조 그림 XNUMX). 14a,b). 모든 측정에서 팁 속도는 10 μm s 로 일정하게 유지되었습니다.^{- 1}. 접촉점은 접근력-변위 곡선으로부터 다음과 같이 결정되었습니다. x 기본 소음의 표준 편차보다 5배 더 높은 힘 값에서 차단한 후 수동 큐레이션을 수행했습니다. 압입 깊이는 힘-변위 곡선에서 캔틸레버 편향을 빼고 최대 힘에서의 변위 값을 0으로 설정한 후 접촉점에서의 변위 값으로 계산되었습니다(보조 그림 2). 14c). 동일한 최대 힘에 대한 압입 깊이는 강성에 따라 소마마다 다릅니다. 따라서 우리는 압입 깊이 컷오프를 750 nm로 설정했습니다. 힘-변위 곡선에서 해당 변위 값이 압입 깊이 컷오프를 초과하는 모든 힘 값은 삭제되었습니다. 겉보기 영률은 탄성 반 공간을 갖는 구형 압입기에 대한 Hertz 모델이 적용되는 곡선으로부터 계산되었습니다.⁴⁹ Python의 사용자 정의 코드를 사용하여 장착되었습니다.

뉴런의 소마에 대한 연구에서 측정된 영률 값은 이전 보고서와 비슷한 범위에 있습니다.^10,11. 그러나 신경돌기의 영률은 보고된 값보다 낮지만 여전히 비슷한 수준입니다. 이러한 편향은 일반적으로 더 부드러운 뉴런의 가장 두꺼운 두 개의 기저 신경돌기를 측정하기로 한 우리의 선택으로 인해 발생할 수 있습니다. 버스트 및 IBI 동안 신경 세포체의 강성을 측정하기 위해 5Hz의 주파수에서 힘-변위 곡선을 수집했습니다. 이 과정은 각 체세포에 대해 여러 번 반복되었으며 파열 기간 및 IBI 동안 체체의 평균 강성을 계산했습니다. 파열은 일반적으로 리드미컬한 패턴으로 나타나는 반면(그림 XNUMX) 2h), 단일 뉴런이 파열될 때 배양된 뉴런을 예측하는 것은 어렵습니다. 파열 기간 또는 IBI 동안 적어도 두 개의 힘-변위 곡선을 수집하기 위해 프로브가 뉴런과 접촉하는 횟수를 최소화하면서 뉴런을 s 5번 들여쓰기했습니다.^{- 1}.

정적 압축 프로토콜

팁이 없는 AFM 마이크로캔틸레버(CSC-5, 공칭 스프링 상수, ∼0.8N·m^{- 1})는 소마 위에 위치했습니다. 0.1 kPa 또는 5 kPa를 적용하는 데 필요한 설정점 힘에 도달할 때까지 비드를 소마 위로 낮추고 비드를 철회하기 전에 일정한 높이 피드백을 사용하여 60초 동안 접촉을 유지했습니다(그림 XNUMX). 5b). 500kHz 샘플링 속도로 기록된 힘-시간 곡선은 AFM 헤드의 수직 변위와 소마의 힘 반응을 모두 보여줍니다. 쥐의 피질 뉴런의 체세포의 평균 높이는 ∼8μm(보조 그림. 11a).

기능성 칼슘 이미징

유전적으로 암호화된 칼슘 센서는 아데노 관련 바이러스(AAV)를 사용하여 뉴런에서 발현되었습니다. AAV1-EF1a-GCaMP6s(1.8 × 10¹³ 바이러스 게놈 ml^{- 1})는 5.0 × 10 의 다중 감염에서 사용되었습니다.⁴ GCaMP6을 표현합니다. 뉴런은 DIV 3에서 감염되었습니다. 표현은 일반적으로 DIV 5-9에서 나타났습니다.

기계적으로 자극된 뉴런의 기능성 칼슘 영상 분석

평균 형광 강도 곡선 ΔI/I GCaMP6s 곡선의 비율은 이미지 기준선을 기준으로 전체 이미지에 대한 평균 신호로 계산되었습니다. 신호의 피크 검출은 3초 창 내에서 로컬 최대값을 찾아 수행되었습니다. 칼슘 신호 진폭이 피크 값의 10%에 도달하면 이벤트가 신경 반응의 시작으로 표시되었습니다. 응답 피크 시작 2.5초 전과 10초 후의 데이터(t = 0)이 그려졌습니다.

HD-MEA 녹음

MaxWell Biosystem 사용자 인터페이스(MaxLab Live v.22.13)를 사용하여 데이터를 기록했습니다. 전체 칩 형광 이미지는 사용자 인터페이스에 등록되었습니다(보조 그림 XNUMX). 2c). 관심 있는 뉴런은 칼슘 스파이크에서 식별되었으며 스파이크 활동(활동 전위)은 사용자 인터페이스의 실시간 래스터 플롯에서 얻어졌습니다. 관심 있는 뉴런이 식별되면 직사각형 구성의 이 뉴런 주변의 512개 전극이 판독값으로 라우팅되었습니다. 뉴런에 AFM 캔틸레버를 배치한 후 기록을 시작하기 전에 캔틸레버 편향을 감지하기 위해 AFM에서 사용하는 적외선 레이저의 노이즈를 보상하기 위해 채널을 512회 오프셋했습니다. 모든 녹음에는 300의 게인과 XNUMXHz에서 차단되는 고역 통과 필터가 사용되었습니다. 그림 XNUMX의 스파이크 정렬 알고리즘의 성능을 향상시키기 위해. 5, 신경 활동 전위는 기계적 자극 전후 2.5분에 기록되었습니다.

HD-MEA 데이터 분석

수집된 모든 HD-MEA 데이터는 Spikeinterface 기반의 맞춤형 스크립트를 통해 처리되었습니다.⁵⁰. 간단히 말하면, Kilosort2를 사용하여 세포외 녹음을 필터링하고 스파이크 정렬한 다음 모든 녹음을 수동으로 큐레이션했습니다. 보수적인 스파이크 간 간격 위반 임계값 0.5와 신호 대 잡음비 임계값 5.0이 큐레이션에 사용되었습니다. 단위 품질 평가에는 템플릿 유사성, 자동 상관도형 및 교차 상관도형이 사용되었습니다. Spikeinterface의 함수를 사용하여 Python 스크립트를 사용하여 각 신기원에 대한 스파이크 정렬 단위에 대해 반폭 및 재분극 기울기와 같은 파형 특징을 추출했습니다(보조 그림 XNUMX). 12a–i). 뉴런의 세포외 풋프린트 내의 모든 전극에 대한 파형 특징의 상대적 변화는 기계적 압축 중 모든 스파이크의 평균 파형 특징 값을 압축 전 모든 스파이크의 평균 파형 특징으로 나누어 얻은 것입니다. 추출된 스파이크 트레인으로부터 Elephant 전기생리학 분석 툴킷 0.11.2를 사용하여 평균 발사 속도와 스파이크 간 간격을 계산했습니다.⁵¹. 강성 상관 데이터의 평균 발사 속도는 강성 값의 시점과 일치하도록 30초 저장소에 스파이크를 배치하여 계산되었습니다. 압축 프로토콜의 평균 발사 속도는 압축 전, 압축 중, 압축 후의 XNUMX개 빈에 스파이크를 배치하여 계산되었습니다.

결합된 AFM 및 공초점 현미경

저속 공초점 이미징은 1×/700 LCI PlanApo 수중 대물렌즈(Zeiss)가 장착된 도립 레이저 스캐닝 공초점 현미경(Observer Z25, LSM 0.8, Zeiss)에서 수행되었습니다. AFM(CellHesion 200, JPK Instruments)을 공초점 현미경에 장착했습니다. 기계적 압축 프로토콜은 JPK CellHesion 소프트웨어를 사용하여 실행되었습니다. 기계적 자극을 위해 AFM을 사용하여 0.1, 1, 10 또는 100 μm s 의 속도로 비드가 있는 캔틸레버에 세포에 접근했습니다.^{- 1} 설정점 힘에 도달할 때까지, 그 후에는 접근에 사용된 것과 동일한 속도로 즉시 후퇴합니다. 뉴런을 기계적으로 자극하기 위한 역치 힘을 결정하는 실험의 경우, 적용된 설정점 힘은 50nN 증분 및 400초 간격으로 50nN에서 20nN으로 단계적으로 증가되었습니다(보충 그림 XNUMX). 6). 접근하는 비드의 설정점 힘은 신경 반응이 기록될 때까지 단계적으로 증가되었습니다. 뉴런의 성공적인 자극 후 캔틸레버를 수축시키고 자극을 위해 새로운 뉴런을 선택했습니다.

통계 분석

파형 속성을 보여주는 모든 데이터는 Shapiro-Wilk 테스트를 통해 정규성을 테스트했으며 Q-Q 플롯. 모든 데이터 그룹은 정규 분포가 아니며 종속 데이터 그룹이었습니다. 따라서 우리는 Wilcoxon 부호 순위 테스트를 사용했습니다. 귀무가설은 쌍별 비교 분포 사이의 중앙값에 차이가 없다는 것입니다. P >0.05 값은 중요하지 않은 것으로 간주되었습니다. 파형 특징은 다음에서 얻은 각 뉴런의 평균 파형에서 추출되었습니다. n > 5,000개의 스파이크. 평균 발사율을 보여주는 모든 데이터는 Wilcoxon 부호 순위 테스트와 비교되었습니다. n > 10,000개의 스파이크. AFM 데이터 그룹은 양측 Mann-Whitney를 사용하여 비교되었습니다. U-테스트. P 각 비교에 대한 값은 그림 범례에 언급되어 있습니다. Pearson 상관관계는 강성과 평균 발사율 값의 선형 상관관계를 결정하는 데 사용되었습니다. 표본 크기를 미리 결정하는 데 통계적 방법이 사용되지 않았습니다. 데이터 수집 및 분석은 실험 조건에 대해 맹목적으로 수행되지 않았습니다.

보고 요약

연구 설계에 대한 추가 정보는 Nature 포트폴리오 보고 요약 이 기사에 링크되어 있습니다.

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• 출처: https://www.nature.com/articles/s41565-024-01609-1