달리 명시하지 않는 한 모든 시약은 받은 대로 사용되었습니다. 계수 비드(CountBright Absolute Counting Beads, Invitrogen)를 제외한 모든 화학 물질은 Sigma Aldrich에서 구입했습니다. ζ-전위는 Zetasizer NanoZS90(Malvern Instruments)을 이용하여 측정하였다. 입자의 크기와 형태는 원소 분석을 제공하기 위해 EDS가 통합된 JEOL JSM 7800F Prime 현미경에서 SEM으로 연구되었습니다. 50개의 독립적인 입자를 측정하여 입자 크기를 결정했습니다. 무선 순간 박층 크로마토그래피(ITLC)는 규산이 함침된 Agilent Technologies 유리 마이크로파이버 크로마토그래피 종이에서 개발되었으며 Laura 소프트웨어를 사용하는 Lablogic Flow-count TLC 스캐너 및 BioScan B-FC-3200 광전 증배관(PMT) 검출기를 사용하여 분석되었습니다. ITLC 이동상은 달리 명시하지 않는 한 물에 용해된 0.175M 구연산과 0.325M 구연산삼나트륨으로 구성되었습니다. 방사성 샘플은 EdenTerm 소프트웨어를 사용하여 데이터가 수집된 Capintec CRC-25R(Capintec) 또는 LKB Wallac 1282 Compugamma CS(PerkinElmer)를 사용하여 측정되었습니다. BD FACSChorus 소프트웨어를 사용하여 BD FACSMelody 세포 분류기에서 유세포 분석 실험을 수행했습니다. PET/CT 이미지는 NanoPET/CT 스캐너(Mediso)를 사용하여 획득하고 Nucline v.0.21 소프트웨어를 사용하여 재구성했으며 VivoQuant 소프트웨어(버전 3.5, InviCRO)를 사용하여 이미지를 분석했습니다. 목록 모드 데이터는 Mediso에서 개발한 특정 MATLAB 소프트웨어 도구로 얻었습니다. GE Amersham Typhoon 기기에서 자동방사선촬영을 수행했습니다.

마이크로미터 이하 크기의 실리카 입자 합성

입자는 Stöber 방법을 사용하여 합성되었습니다. 이 방법은 단분산 구형 실리카 입자를 생성하기 위한 실리콘 알콕시드의 가수분해 및 연속 축합을 기반으로 합니다.²⁷. 테트라에틸 오르토실리케이트(TEOS)는 실리콘 공급원으로, 암모니아는 기본 촉매로, 염화칼륨은 전해질로 사용되었습니다. 에탄올에 녹인 TEOS 용액을 촉매와 전해질을 함유한 용액에 연속적으로 첨가했습니다. 시약 시작 수량 또는 추가 속도를 수정하면 이전에 보고된 입자 크기의 차이가 나타납니다.²⁸. 여기서는 입자 합성 전에 두 가지 용액이 준비되었습니다. 1ml의 EtOH에 19.0mmol의 TEOS를 포함하는 용액 33.3과 2ml의 암모니아, 0.23ml의 EtOH 및 9ml의 H에 65mmol의 KCl을 포함하는 용액 6.75₂O. 합성을 위해, 용액 2를 250℃로 가열된 50ml 둥근바닥 플라스크에 넣고 300rpm으로 15분 동안 교반하였다. 그런 다음 용액 1을 용액 2에 적가했습니다(공급 속도 0.2 ml min^{- 1}). 용액 1을 첨가한 후, 얻은 입자를 18,300℃에서 원심분리하여 정제하였다.g 3분 동안 EtOH로 XNUMX회 세척하였다. 마지막으로 SiO₂ 미세입자를 진공 하에 건조시켰다.

실란-PEG를 이용한 서브 마이크로미터 크기 입자의 접목_5k

20mg ml^{- 1} 실란-PEG 용액_5k (Sigma Aldrich) EtOH 98%를 smSiP 용액 위에 5 mg/mL 첨가했습니다.^{- 1} EtOH 98% 및 암모니아 2.8%. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, 18,300 ℃에서 원심분리에 의해 입자를 회수하였다.g 3분 동안. 마지막으로, 입자를 증류수로 XNUMX회 세척하고 밤새 진공 건조시켰다. 세척 용액을 밤새 동결 건조시켰고, 부착되지 않은 실란-PEG의 양은_5k 반응 수율 계산을 위해 가중치를 적용했습니다. 0.05mg ml^{- 1} smSiP-PEG 솔루션_5k 추가 방사성 표지 반응을 위해 증류수에 사용되었습니다.

[⁶⁸Ga]GaCl₃

갈륨-68은 [⁶⁸Ga]GaCl₃ 에커트와 지글러로부터 ⁶⁸Ge /⁶⁸우수제조관리기준(ABX) 요건에 따라 제조된 초순수 HCl(4ml, 0.1M)의 Ga 발생기입니다.

농도 [⁶⁸Ga]GaCl₃ 양이온 교환에 의한 용출

보충 그림 1에 설명된 설정을 사용하여 용출 농도를 수행했습니다. 1. 먼저, 4ml의 [⁶⁸Ga]GaCl₃ 용출액을 Strata-XC 33u 카트리지(Phenomenex)에 로드하고 용출액을 폐기했습니다. 그런 다음, 카트리지를 5ml의 아세톤/0.1M HCl(80:20) 용액으로 세척하고 용출액을 버렸다. 마지막으로 집중된 [⁶⁸Ga]GaCl₃ 700μl의 아세톤/0.05M HCl(98:2) 용액을 첨가하여 수집하고 NXNUMX하에 건조시켰습니다.₂ 스트리밍하고 50μl의 0.5M HEPES 완충액(pH 4.9)에 재현탁했습니다. Radio-TLC는 품질 관리를 위해 여러 단계에서 수행되었습니다. 프로토콜은 20 ± 86.2%의 복구 수율을 제공하는 데 약 8.5분이 소요됩니다.

다양한 농도의 실리카 입자의 방사성 표지 ⁶⁸Ga

실리카 입자는 다양한 농도 (1 ~ 0.002 mg ml )로 재현 탁되었습니다.^{- 1}) 0.5M HEPES 완충액(pH 4.9). 그런 다음, 농축된 [⁶⁸Ga]GaCl₃ 50 M HEPES 완충액(pH 0.5) 4.9 μl에서 용출됩니다. 반응은 90℃에서 30분 동안 진행되었으며, 방사성화학 수율을 계산하기 위해 radio-TLC를 수행하였다.

유세포 분석을 통한 입자 농도 측정

제조업체의 지침에 따라 계수 비드(CountBright Absolute Counting Beads, Invitrogen)를 사용하여 유세포 분석법으로 입자 농도를 계산했습니다. 실리카 입자를 0.05 mg ml 로 재현탁시켰습니다.^{- 1}, 10분 동안 초음파 처리한 후 10μm 컷오프 크기 필터(KX 주사기 필터, 나일론, 25mm, 10μm)를 통과했습니다. CountBright Absolute Counting Bead를 실온으로 데우고 30초 동안 와류시켰습니다. 그런 다음, 50 μl의 비드를 300 μl의 실리카 입자에 첨가하고 혼합물을 30분 동안 볼텍싱하여 균질한 용액을 얻었습니다. 샘플을 유세포 분석기에서 실행하고 선형-FSC 대 선형 측면 산점도 플롯에 비드와 입자를 포함하도록 설정된 전방 산란(FSC) 임계값을 설정했습니다. 그 후, 형광 검출기 전압을 계수 비드에 맞게 조정하고 게이팅 전략을 수행하여 실리카 입자와 계수 비드 집단을 분리했습니다. 마지막으로, 입자의 게이트와 절대 계수 비드를 그리고 각 샘플에 대해 1,000개의 비드 이벤트를 기록했습니다. 이 전략을 사용하여 다음 방정식을 사용하여 용액 내 입자 수를 계산했습니다.

500 smSiP의 방사성 표지

50개의 smSiP를 XNUMX μl의 농축된 [⁶⁸Ga]GaCl₃ 0.5 M HEPES 완충액 pH 4.9에서 용출. 그런 다음, 폴리소르베이트 5.6 80 μl를 첨가하고 혼합물을 열 혼합기에서 90 rpm으로 30분 동안 900 °C에서 가열했습니다. 그 후, 미반응/콜로이드를 제거하기 위해 최종 다단계 정제 프로토콜을 설계했습니다. ⁶⁸Ga. 10 마이크로리터의 5mM EDTA를 첨가하고 혼합물을 실온에서 3분간 배양했습니다. 그런 다음 입자를 18,300°C에서 XNUMX분간 원심분리했습니다.g, 500mM EDTA + 1% 폴리소르베이트 0.1을 함유한 PBS 80μl에 재현탁하고 10초 동안 부드럽게 볼텍싱했습니다. 입자를 다시 원심분리하고, PBS 중 0.1 mM EDTA + 0.1% 폴리소르베이트 80 용액으로 세척하고 10초 동안 부드럽게 와류시켰습니다. 마지막으로, 입자를 원심분리하고 PBS + 0.1% 폴리소르베이트 80으로 500회 더 세척한 후 XNUMXμl PBS에 재현탁시켰습니다. 방사성 표지 반응은 콜로이드(제대로 제거되지 않으면 입자와 혼동될 수 있음)의 존재, 입자의 방사성 표지 및 최종 제품의 순도를 평가하기 위해 연속적인 반응 단계 동안 radio-TLC로 모니터링되었습니다. RLY는 세척 단계 후 입자와 상청액의 방사능 양을 비교하여 계산되었습니다.

분류

분별 전략의 경우 0.5 µl ~ 20 µl의 용량을 사용합니다. ⁶⁸1 입자 μl의 이론적 농도에서 Ga-smSiP^{- 1} 다양한 시료 튜브에 1 µl 단계(0.5, 1, 2, 3…)로 첨가하고 PBS를 첨가하여 최종 부피를 50 µl로 만들었습니다. 그런 다음, 첫 번째 튜브의 37.5 μl를 두 번째 시료 튜브에 피펫팅하고, 두 번째 튜브의 25 μl를 세 번째 튜브에, 마지막으로 세 번째 튜브의 12.5 μl를 네 번째 튜브에 피펫팅했습니다. 이 전략은 샘플당 12.5개의 튜브를 제공하며 최종 부피는 튜브당 30μl입니다. 각 튜브의 방사능은 감마 계수기에서 측정되었으며 추가 비교 및 ​​분석을 위해 보정 곡선을 사용하여 값을 kBq 단위로 계산했습니다. 하나의 튜브에만 대부분의 방사능이 포함된 샘플을 실온에서 XNUMX초 동안 초음파 처리한 후 두 번째 분획 단계를 거쳤습니다. 그런 다음 단일 튜브에서 모든 방사능이 발견된 샘플(다른 XNUMX개 튜브에서는 활성이 무시할 수 있음)을 추가 생체 내/생체 외 실험에 사용했습니다.

PET/CT 팬텀 이미징

팬텀 이미징 실험은 다음과 같이 수행되었습니다. ⁶⁸Ga-smSiP. 캐뉼라를 사용하여 입자를 샘플 튜브에 전달하여 단일 입자가 투여 중에 캐뉼라 튜브에 갇혀 있을 수 있는지 여부를 평가했습니다. 간단히 말하면, 팬텀 튜브를 튜브에 부착된 캐뉼라 팁의 끝과 함께 nanoPET/CT 스캐너에 배치했습니다. PET 획득을 시작한 후, PBS 100μl에 재현탁된 입자를 캐뉼라 시작 부분에 부착된 인슐린 주사기를 사용하여 전달했습니다. 그런 다음 캐뉼라를 50 μl의 PBS로 세척하여 입자가 팬텀 튜브로 전달되도록 했습니다. PET 획득을 2시간 동안 수행한 후 표준 CT 스캔을 수행했습니다.

생체 내 PET/CT 영상

동물 영상 연구는 동물 실험에 관한 동물(과학적 절차)법 1986(ASPA) 영국 본국 규정에 따라 윤리적으로 검토되고 수행되었습니다. 생체 내 이미징은 건강한 8주령 BALB/c 마우스에서 수행되었습니다. 동물을 이소플루란(산소 중 2~3%)으로 마취하고, 캐뉼러를 삽입한 후 마취하에 스캐너 베드에 배치했습니다. 동물의 정상적인 체온을 유지하기 위해 내부 공기 흐름에 의해 침대를 37 °C로 가열했으며 호흡률을 모니터링하여 분당 60-80 호흡으로 유지했습니다.^{- 1} 스캔하는 내내. 예상치 못한 온도 강하로 인해 혈액 내 입자 속도가 감소할 수 있으므로 동물 온도에 대한 통제력을 유지하는 것이 중요합니다. 하나 ⁶⁸Ga-smSiP(n = 4) 또는 ⁶⁸Ga-smSiP-PEG_5k 입자(n = 2) 100μl의 PBS에 캐뉼라를 통해 투여한 다음 PET 획득을 시작한 후 50μl의 PBS로 세척했습니다(1:5 일치 모드, 5ns 일치 시간 창). PET를 2시간 동안 기록한 후 반원형 CT 스캔을 수행했습니다. 전체 과정 동안 동물의 체온과 호흡률을 모니터링했습니다. 동적 PET/CT 이미지는 3 × 400 × 600mm의 복셀 크기에서 Tera-Tomo 1D 재구성(5-20keV 에너지 창, 1:0.4 일치 모드, 0.4회 반복 및 0.4개 하위 세트)을 사용하여 재구성되었습니다.³ 감쇠, 산란 및 감쇠를 수정했습니다. 모든 PET/PEPT 획득에 대한 목록 모드 데이터는 다음에서 찾을 수 있습니다. ⁶⁸심판의 Ga-smSiP. ²⁹ ~을 위해 ⁶⁸Ga-smSiP-PEG_5k 심판에서. ³⁰.

실시간 추적

먼저, 데이터는 목록 모드 형식(즉, 감지된 일치 광자에 대한 타임스탬프 및 크리스탈 인덱스가 있는 형식)으로 스캐너에서 내보내졌습니다. 결정 지수를 mm 단위의 위치로 변환하기 위해 기하학적 변환이 적용되었습니다. 버밍엄 방법은 모든 LoR의 하위 집합에서 MDP를 반복적으로 계산합니다. 이는 잘못된 LoR(예: 산란에서 발생할 수 있는 LoR)에서 발생할 가능성이 높기 때문에 MDP에서 설정된 거리보다 더 멀리 있는 LoR을 삭제하여 이를 수행합니다. MDP는 반복할 때마다 개선됩니다. 반복 횟수는 다음에 의해 효과적으로 설정됩니다. f-인수는 해당 하위 집합 내의 최종 입자 위치를 추정하는 데 사용되는 LoR의 총 수와 관련됩니다(예: f-인수 0.5는 하위 집합의 LoR이 50% 남으면 반복 루프가 종료됨을 의미합니다. 하위 집합에 사용되는 LoR의 수는 위치의 불확실성을 증가시키면서 시간적 샘플링(하위 집합은 겹치지 않고 시간 연속임)을 개선하기 위해 줄어들 수 있습니다(알고리즘에 대한 자세한 내용은 Parker et al.⁵) PET 스캐너의 목록 모드 데이터를 분석하기 위해 Birmingham 방법이 사용되었습니다. 마우스의 입자를 추적하기 위해 적응형 샘플 크기가 사용되었습니다. 샘플 크기는 위치 오류를 최소화하면서 충분한 시간적 샘플링의 균형을 이루도록 설정되었습니다. 스캔 초기 단계(스캔 시작 후 <100초)에는 200~60 LoR 사이의 샘플 크기가 사용되었습니다. f = 0.1, 대략 1~5초 간격을 생성합니다. 스캐닝 시간 >60초에서 샘플 크기는 1,000에서 2,000 사이로 다양했으며, 이는 생체 내 실험에 따라 30초에서 60초 사이의 시간 간격을 산출했습니다. MDP를 계산하는 데 사용된 카운트 수(최종 반복에서)는 표본 크기에 f-요인 값. 이러한 매개 변수는 이전 경험을 기반으로 하며 이전 간행물에서 정보를 얻었습니다.¹.

속도는 다음과 같이 얻어졌습니다. (sqrt{{v}_{x}^{2}+{v}_{y}^{2}+{v}_{z}^{2}}) 어디에 ({v}_{m}^{2}) 의 속도는 x, y 과 z 지도.

생체 외 장기 흡수

다양한 기관에서의 흡수를 감마 계수로 평가했습니다. 생체 내 PET/CT 영상화 후, 경추 탈구로 동물을 죽이고 장기를 절제하고 감마 계수기(LKB Wallac 1282 Compugamma CS)에서 방사능 계수를 위해 무게를 측정했습니다. 데이터는 조직 그램당 주입된 투여량(기관 내 투여량/총 주입된 투여량)(%ID g)으로 표현되었습니다.^{- 1}).

자가방사선촬영

폐의 방사능을 방사선 검출기(EP15 프로브, Morgan)로 추적하고, 방사성 신호가 있는 조직의 작은 부분이 얻어질 때까지 폐를 메스를 사용하여 작은 부분으로 절단했습니다. 조직을 -80 °C 이소프로판올에서 급속 냉동했습니다. 동결 직후, 조직을 최적 절단 온도 매체에 매립하고 저온 유지 장치에서 20μm 슬라이스로 절단했습니다. 방사성 조각이 발견될 때까지 각 조각을 검출기로 조사했습니다. 이전(배경 아래), 방사성 및 다음(배경 아래) 슬라이스를 Superfrost 현미경 슬라이드(Epredia)에 배치했습니다. 나머지 조직도 배경 아래에 있었습니다. 25개의 섹션이 있는 현미경 슬라이드를 접착 필름으로 덮고 밤새 GE 자동방사선 사진 플레이트에 대향시켰습니다. 플레이트는 4,000μm 분해능과 1의 PMT 설정을 갖춘 GE Amersham Typhoon을 사용하여 분석되었습니다. 방사선 사진 이미지는 조직 사진 위에 겹쳐져 방사성 조각의 방사능 한 지점을 보여줍니다. 정량화를 위해 표준물질은 알려진 다양한 활성으로 준비되었으며 각각은 종이에 5μl 2.0중주로 표시되었습니다. 단일 입자를 정량화할 때 스팟을 동일한 저장 인광체 스크린인 GE의 BAS-IP MS(다목적 표준)에서 배양했습니다. 이미지는 픽셀 크기 100μm, 감도 4,000의 인광체 모드에서 제어 소프트웨어 버전 10.0을 사용하는 Amersham Typhoon 261를 사용하여 획득했습니다. 겔 정량화 도구 상자를 사용하여 소프트웨어 ImageQantTL vXNUMX-XNUMX로 이미지를 정량화했습니다. 스팟 바로 앞이나 뒤의 영역을 일정한 배경으로 선택하여 스팟을 수정했습니다. 스폿의 결과 부피는 보정 곡선을 기반으로 입자의 Bq를 계산하는 데 사용되었습니다.

통계 및 재현성

정량 분석을 위해 생체 내 데이터를 제외하고 최소 3개의 생물학적 복제물을 분석했습니다. ⁶⁸Ga-smSiP-PEG_5k (n = 2). 데이터는 Dunnett의 다중 비교 테스트와 Student's의 일반 일원 분산 분석(ANOVA)으로 분석되었습니다. t-시험. ㅏ P 값 <0.05는 통계적으로 유의미한 것으로 간주되었습니다.

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• 출처: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01589-8