재료 준비 및 특성화

GO 수용액을 탈이온수로 희석하여 0.15 mg ml를 얻었다.^{- 1} 용액을 넣고 0.025 μm 기공의 니트로셀룰로오스 막을 통해 진공 여과하여 GO 박막을 형성했습니다. 그런 다음 탈이온수에서의 습식 전사와 100°C에서 2분 동안 추가 열 어닐링을 사용하여 박막을 대상 기판으로 전사했습니다. GO 필름-기판 스택은 표준 오토클레이브에서 134°C에서 3시간 동안 열수 환원되어 EGNITE를 형성했습니다. EGNITE의 모든 특성화 연구를 위한 기본 기판은 정사각형(1 × 1 cm)이었습니다.²) Si/SiO₂ (400μm/1μm).

XPS

XPS 측정은 초고진공 조건(기본 압력, 150 × 5)에서 Phoibos 10 분석기(SPECS)를 사용하여 수행되었습니다.^-10 mbar)와 단색 Al Kα X선 소스(1,486.74 eV)를 사용합니다. 개요 스펙트럼은 50 eV의 통과 에너지와 1 eV의 스텝 크기로 획득되었으며 고해상도 스펙트럼은 20 eV의 통과 에너지와 0.05 eV의 스텝 크기로 획득되었습니다. 마지막 조건의 전체 분해능은 Ag 0.58의 최대 절반에서 전체 폭을 측정하여 결정된 3 eV입니다.d스퍼터링된 은의 5/2 피크. XPS 분석은 C-O 피크(에폭사이드 그룹과 관련됨)의 열수 처리 후 강한 감소를 보여 주지만 하이드록실, 카르보닐 및 카르복실로 인해 C-OH, C=O 및 C(O)OH가 약간 기여함을 보여줍니다. 감소 후 남아 있습니다. O1의 디콘볼루션s peak는 그러한 행동을 확인합니다. C1에 대한 주요 기여s 그러나 열수 환원 이후의 신호는 다음에서 비롯됩니다. sp² 혼성화된 C-C 오비탈^34,57.

X 선 회절

X선 회절 측정(θ- 2θ 스캔)은 Materials Research Diffractometer(Malvern PANalytical)에서 수행되었습니다. 이 회절계는 수평 방향을 가지고 있습니다. ω- 2θ 320원 형상의 측각기(반경 XNUMXmm)를 사용하고 Cu Kα 양극(λ = 1.540598 Å). 사용된 검출기는 Medipix2 기술을 기반으로 한 고속 X선 검출기인 Pixelcel입니다.

라만 분광학

라만 분광학 측정은 488nm 레이저 여기 라인이 장착된 Witec 분광기를 사용하여 수행되었습니다. 측정을 위해 라만 스펙트럼은 50× 대물렌즈와 nm당 600개의 홈 격자를 사용하여 획득되었습니다. 샘플 가열을 방지하기 위해 레이저 출력을 1.5mW 미만으로 유지했습니다.

TEM

EGNITE 샘플의 단면 연구를 위해 Helios NanoLab DualBeam(LMA-INA)을 사용하여 집속 이온빔 라멜라를 준비했습니다. HRTEM 및 고각 환형 암시야 STEM 기술을 포함하여 20kV에서 작동되는 Tecnai F200 현미경을 사용하여 TEM을 통해 구조 분석을 수행했습니다. STEM-EELS 실험은 20 mm 조리개, 200 mm 카메라 길이, 5mrad 수렴 각도 및 30mrad 수집 각도를 사용하여 12.7KeV에서 작동하는 Tecnai F87.6 현미경으로 수행되었습니다. 코어 손실 획득에서 픽셀당 0.5 eV와 250 eV를 시작 에너지로 사용했기 때문에 1,839eV에서 예상되는 Si K-에지, 2,122 eV에서 Pt M-에지, 에서 Au M-에지를 획득하지 못했습니다. 2,206 eV. 상대적인 C-O 원자 구성은 환원된 GO 층에 주의를 집중하고 분석된 가장자리(이 경우 C와 O)의 합이 100%라고 가정하여 얻어졌습니다. 이 가정은 우리의 경우에 유효합니다. 추가 정보 지도. 에너지 차등 단면적은 Hartree-Slater 모델을 사용하고 배경은 전력 부족 모델을 사용하여 계산되었습니다.

전기 전도도

전기 전도도 측정은 Keithley 2400 소스미터를 사용하여 1점 구성으로 수행되었습니다. 측정된 샘플은 1 × XNUMXcm 크기의 EGNITE 필름으로 구성되었습니다.² SiO 위에₂ 기판.

데이터 분석

X선 회절, Raman 및 XPS 데이터는 Python 3.7 패키지(Numpy, Pandas, Scipy, Xrdtools, Lmfit, Rampy, Peakutils, Matplotlib)를 사용하여 분석되었습니다. 평면 사이의 거리는 스넬의 법칙에 따라 X선 회절 측정을 통해 계산되었습니다. 데이터가 공간 영역으로 이동되면 최대 피크가 맞춰졌습니다. 해당 거리는 평면 사이의 거리의 평균값을 제공합니다. 이러한 평균값과의 편차는 공간 영역에서 피크의 Lorentzian 피팅의 최대 절반 폭에서 계산되었습니다. XPS 및 라만 분광학 측정은 해당 기능에 대한 예상 위치에 피크의 컨볼루션을 피팅하여 분석되었습니다. GO와 EGNITE의 전도도 값은 I-V 옴의 법칙에 따른 전기 전도도 측정에서 측정된 곡선. 데이터는 n = 1 각 측정에 대해.

유연한 어레이 제작

장치의 제작은 보충 그림 1에 나와 있습니다. 4. 장치는 4인치 Si/SiO로 제작되었습니다.₂ (400 μm/1 μm) 웨이퍼. 먼저, 10μm 두께의 PI 층(PI-2611, HD MicroSystems)을 웨이퍼 위에 스핀 코팅하고 질소가 풍부한 분위기에서 350°C에서 30분 동안 베이킹했습니다. 이미지 반전 포토레지스트(AZ5214, Microchemicals)의 광학 리소그래피를 사용하여 금속 흔적을 패턴화했습니다. 전자빔 증발을 사용하여 티타늄 20nm, 금 200nm를 증착하고 리프트오프를 수행했습니다. 우리는 전기화학적 성능과 어레이 유연성 사이의 절충점으로 약 1 μm 두께의 EGNITE 필름을 사용했습니다. GO 필름을 옮긴 후, 알루미늄을 e-빔 증발시키고, 네거티브 포토레지스트(nLOF 2070, Microchemicals)를 사용하여 미래의 미세 전극 상단 영역을 정의한 후 들어 올립니다. 다음으로, GO 필름은 5W에서 500분 동안 산소 반응성 이온 에칭(RIE)을 사용하여 미래의 미세 전극을 제외한 모든 곳에서 에칭되었으며, 보호 알루미늄 컬럼은 인산과 질산의 희석 용액으로 에칭되었습니다. 그런 다음, 3μm 두께의 PI-2611 층을 웨이퍼 위에 증착하고 앞서 설명한 대로 베이킹했습니다. 이후 미세전극의 PI-2611 개구부는 후속 산소 RIE에 대한 마스크 역할을 하는 두꺼운 포지티브 포토레지스트(AZ9260, Microchemicals)를 사용하여 정의되었습니다. 나중에 장치는 다시 AZ9260 포토레지스트와 RIE를 사용하여 PI 레이어에 패턴화되었습니다. 그런 다음 포토레지스트 층을 아세톤으로 제거하고 웨이퍼를 이소프로필 알코올로 세척한 후 건조시켰습니다. 마지막으로, 장치를 웨이퍼에서 떼어내고 멸균 파우치에 넣어 표준 오토클레이브에서 134°C로 3시간 동안 열수 처리할 준비가 되었습니다.

미세전극 전기화학적 특성화

미세전극의 전기화학적 특성화는 pH 128에서 1mM 인산염 완충액, 4417mM NaCl 및 10mM KCl을 함유하고 137전극 구성을 사용하여 2.7× PBS(Sigma-Aldrich, P7.4)에서 Metrohm Autolab PGSTAT45093N 전위차계를 사용하여 수행되었습니다. Ag/AgCl 전극(FlexRef, WPI)을 기준 전극으로 사용하고 백금 와이어(Alfa Aesar, XNUMX)를 상대 전극으로 사용했습니다.

성능 평가에 앞서 전극은 10,000개의 전하 균형 펄스(1 ms, 15 μA)로 펄스되었습니다. 100 mV s에서 0.9회 순환 전압전류 주기(-0.8 ~ +50 V)로 진행되는 연속 펄스 프로토콜에 대한 전극 노출^{- 1}, 20 펄스(5,000 ms)를 1회 반복하고 개방 회로 전위를 다시 결정합니다.

데이터 분석

전기화학적 특성화 데이터는 Python 3.7 패키지(Numpy, Pandas, Scipy, Pyeis, Lmfit, Matplotlib)를 사용하여 분석되었습니다. 임피던스 분광학 데이터는 저항으로 구성된 등가 전기 모델에 맞춰졌습니다.R)는 정위상 요소(CPE)와 직렬로 연결됩니다. 거기에서 CPE 값을 커패시턴스로 근사화하고 미세 전극 기하학적 영역으로 나누어 EGNITE의 계면 커패시턴스에 대한 등가 값을 얻었습니다. 미세전극 전하 저장 용량(CSC)은 측정된 전류의 음극 및 양극 체제를 통합하고 스캔 속도로 정규화하여 순환 전압전류 측정으로부터 계산되었습니다. EGNITE의 100 mV 스캔 속도에서 음극 및 양극 전하 저장 용량(cCSC 및 aCSC)은 45.9 ± 2.4 및 34.6 ± 2.8 mC cm입니다.^{- 2}, (n = 3). 다른 자료에 대해 보고된 대로⁵⁸, 획득된 CSC는 스캔 속도에 따라 달라집니다(보조 그림 2). 5). 산소 환원 반응의 존재를 평가하기 위해 질소 퍼지 전해질에서 CV 파형을 측정했습니다.⁵⁹ 파형의 실질적인 차이는 관찰되지 않았습니다(보조 그림 2). 6). 그러나 우리의 결과는 EGNITE의 전하 주입 용량에 대한 산소 환원 반응의 영향을 완전히 다루지 못하며 이를 적절하게 조사하려면 추가 작업이 수행되어야 합니다. 미세전극 전하 주입 용량(CIC)은 전극 전기화학적 수창(음극의 경우 -0.9 V, 양극의 경우 +0.8 V 대 Ag/AgCl)과 일치하는 전압 차이(옴 강하 제거 후)를 유도하는 전류 펄스 진폭을 결정하여 확립되었습니다. ) (보충 그림. 17)⁶⁰.

통계 분석

데이터는 평균  ± sd입니다. n = 18(EIS의 경우) 및 n 시간 전위차계의 경우 = 3. 음극 용량성 전압 편위 맵의 데이터는 각 펄스 형태에 대해 하나의 이벤트에 대한 음극 용량성 전압 편위의 평균입니다. n = 3개의 전극.

기계적 안정성 평가

초음파 초음파 처리

EGNITE 전극 어레이는 초음파 수조(Elmasonic P 180H)에서 물로 채워진 비이커 내부에 배치되었습니다. 초음파 처리는 37 W에서 15분 동안 200 kHz로 적용한 후 15 W로 전력을 증가시켜 37 kHz에서 추가로 300분 동안 초음파 처리했습니다. 초음파 처리 단계 전후에 전극 이미지를 획득했습니다.

굽힘 테스트

굽힘 설정(그림. 2k) 세 개의 원통형 막대로 구성됩니다. 가운데 부분(직경, 700 μm)이 아래로 낮아져 131°의 굽힘 각도가 생성되었습니다. 굽힘 테스트에는 세 개의 유연한 미세 전극 배열이 사용되었습니다. 각 어레이에는 직경이 18μm인 50개의 미세 전극이 포함되어 있습니다. 두 개의 어레이는 10주기와 20주기 후에 측정되었으며, 한 장치는 측정 후 취급 중 손상되어 10주기 동안만 측정되었습니다. 굽힘 테스트 주기는 10초 길이의 하중 적용과 무부하 10초로 구성되었습니다. 장치는 10회 및 20회 굽힘 주기 전후에 전기화학적으로 특성화되었습니다(EIS 및 CV).

외피 신경 녹음

외피 이식

모든 실험 절차는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 유럽 공동체 협의회 및 프랑스 법률의 권장 사항에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜은 그르노블 윤리위원회(ComEth)의 승인을 받았으며 프랑스 사역(번호 04815.02)의 승인을 받았습니다. Sprague–Dawley 쥐(수컷, 4개월령, 체중 측정) ∼600g)을 케타민(50mg/kg(체중))과 자일라진(10mg/kg(체중))으로 근육 내 마취시킨 후 정위 고정대에 고정시켰습니다. 측두골을 제거하면 청각 피질이 노출됩니다. 대뇌 피질 조직의 손상을 방지하기 위해 Dura mater가 보존되었습니다. 기준 전극을 삽입하기 위해 꼭지점에 구멍을 뚫고, 접지 전극을 삽입하기 위해 첫 번째 구멍에서 앞쪽으로 7mm 떨어진 두 번째 구멍을 뚫었습니다. 전극은 집적회로 소켓에 사용되는 0.5mm 두께의 핀이었습니다. 그들은 경질막과 전기적으로 접촉하도록 배치되었고 치과용 시멘트로 두개골에 고정되었습니다. 그런 다음 그림 XNUMX과 같이 청각 피질에 표면 미세 전극 리본을 장착했습니다. 3b. 정맥 패턴은 크리그의 쥐 뇌 지도 영역 41에서 청각 피질을 식별합니다. 피질 신호는 1,000의 이득으로 동시에 증폭되었으며 33kHz의 샘플링 속도로 디지털화되었습니다. 쥐의 귀 앞 20 cm, 노출된 피질 반대편에 있는 스피커가 음향 자극을 전달했습니다. 전달된 자극은 귀 근처에 배치된 0.25인치 마이크(Brüel & Kjaer, 4939)로 모니터링되었으며 음압 수준(dB SPL re 20μPa)으로 표시되었습니다. 우리는 80dB SPL에서 클릭을 번갈아 가며 발생하는 정점 포지티브(네거티브 업) 중간 지연 시간 반응과 70~5kHz 범위의 주파수, 40ms의 상승 및 하강 시간을 갖는 5dB SPL의 톤 버스트 자극을 조사합니다. 지속 시간은 200 ms입니다.

데이터 분석

전기생리학적 데이터는 Python 3.7 패키지(Numpy, Pandas, Scipy, Neo, Elephant, Sklearn Matplotlib)와 맞춤형 라이브러리 PhyREC(https://github.com/aguimera/PhyREC). R.M.S. 값은 20Hz 이상의 주파수에서 200ms의 슬라이딩 윈도우를 사용하여 계산되었습니다. 스펙트로그램은 70 Hz에서 1.1 kHz 사이의 범위에 대해 계산되었습니다. PSD는 60초의 연속 녹음에 대해 계산되었습니다. 주어진 전극 배열에 대해 두 개의 PSD(생체 내(IV) 및 사후(PM))가 계산되었습니다. SNR은 dB(20 × ln(rms.s.(IV)/rms.s.(PM)))로 표시되며 20 Hz와 10 kHz 사이의 로그 간격으로 1개 지점에 대해 보간됩니다.

통계 분석

그림에 제시된 외피 신경 데이터. 3 단일 동물에 대한 개별 측정에서 가져옵니다. 그림에서. 3c, 64개 전극의 데이터가 표시됩니다. 그림에서. 3d, 선택된 두 전극의 데이터가 표시됩니다. 그림에서. 3f, PSD 및 SNR은 64개의 EGNITE 전극에서 계산되며 평균  ± sd로 표시됩니다. 보충 그림에서 12c,d 192개의 EGNITE 전극에 대한 중앙값 데이터가 제공됩니다. n = 3개의 실험과 60개의 백금 전극 n = 1번의 실험.

피질내 신경 녹음

피질내 이식

동물을 케타민/자일라진(75:1, 0.35ml/28g i.p.)의 혼합물로 마취시키고 이 상태를 1.5% 이소플루란을 제공하는 흡입 마스크로 유지했습니다. 임플란트를 안정화하기 위해 여러 개의 미세 나사를 두개골에 삽입하고 소뇌 위에 있는 나사를 일반 접지로 사용했습니다. 프로브는 전두엽 피질에 이식되었습니다 (좌표 : AP, 1.5 mm, ML, ±0.5 mm, DV, 브레그마에서 -1.7 mm). 일시적인 프로브 강성을 제공하고 프로브 삽입을 용이하게 하기 위해 프로브를 말토스(아래 프로토콜 참조)로 코팅하여 이식을 수행했습니다. 프로브는 치과용 시멘트로 밀봉되었습니다. TDT-ZifClip 커넥터는 소형 케이블을 통해 프로브를 전기 생리학 시스템에 연결하는 데 사용되었습니다. 수술 후 마우스는 진통제(부프레노르핀)와 항염증제(멜록시캄) 치료를 받으며 1주간의 회복 기간을 거쳤다. 신경 활동은 Intan RHD30 증폭기를 사용하여 2132kHz의 샘플링 속도로 다중 채널 Open Ephys 시스템으로 기록되었습니다. 청각 작업 실험은 이전에 설명한 작업을 기반으로 하는 프로토콜을 사용하여 내부에 두 개의 스피커가 있는 방음 상자에서 수행되었습니다.⁶¹. 소리 자극은 15ms 길이의 백색 잡음 클릭으로 구성되었으며, 100회(주기) 반복되었으며 각각 5 s(자극 간 간격)로 구분되었습니다. 작업하는 동안 동물은 자유롭게 움직일 수 있었습니다.

말토스 보강재 프로토콜

말토스 수용액을 유리전이점(T_g), 핫플레이트나 전자레인지를 사용하여 130~160 °C 사이에서 가열합니다. 맥아당이 점성을 띠게 되면 탐침 뒷면은 맥아당에만 접촉하게 됩니다. 맥아당이 냉각되면서 탐침이 단단해지고 단단해집니다.

데이터 분석

SUA 및 LFP를 추출하기 위해 각 전극의 신경 신호를 오프라인으로 필터링했습니다. SUA는 450~6,000Hz 사이의 신호를 필터링하여 추정되었으며 개별 뉴런의 스파이크는 Offline Sorter v.4(Plexon)를 사용한 주성분 분석을 사용하여 정렬되었습니다. LFP를 얻기 위해 신호를 1 kHz로 다운샘플링하고 추세를 제거하고 노치 필터링하여 Python에서 맞춤 작성된 스크립트를 사용하여 노이즈 라인 아티팩트(50 Hz 및 해당 고조파)를 제거했습니다. AEP SNR은 피크 N1 진폭과 sd의 비율로 계산되었습니다. 자극 전 20ms 기간.

통계 분석

그림에 표시된 데이터. 3시간,나 평균  ± sd.입니다. n = 30은 평균 시행 횟수입니다. 동일한 전극에서 기록된 데이터는 30일, 60일, 90일에 표시됩니다. 단일 동물의 데이터가 표시됩니다.

만성 상피질 생체 적합성

장치의 외과적 이식

총 27마리의 성체 수컷 Sprague-Dawley 쥐가 이 연구에 사용되었습니다(Charles River). 동물은 21 h 명/2 h 암주기로 주변 온도 40 ± 50 °C 및 습도 12~12%에서 사육되었습니다. 쥐를 그룹으로 나누어 실험 기간 동안 식이와 물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 했습니다. 실험 절차는 영국 내무부 및 지역 동물 복지 윤리 심사 기관(AWERB)의 승인을 받아 동물 복지법(1998)에 따라 수행되었습니다. 수술 기간 동안 동물을 이소플루란(2-3%)으로 마취시켰으며, 마취 깊이는 발가락 핀치 반사 테스트를 통해 모니터링했습니다. 체온을 유지하기 위해 열 담요 위에 위치한 정위 프레임(Kopf, 900LS)에 동물을 배치했습니다. 개두술 구멍(∼5 mm ×4 mm)을 1 mm 버 드릴 비트가 있는 치과용 드릴을 사용하여 정중선에서 0.9 mm 떨어진 곳에 만든 후 경막을 제거하고 외피질 장치를 뇌의 피질 표면에 배치했습니다. 개두술 구멍을 곽실로 봉합한 후 치과용 시멘트로 고정하고 피부를 봉합하였다. 손실된 체액을 보충하고 수술 후 통증을 줄이기 위해 식염수(kg(체중)당 1 ml)와 부프레노르핀(kg(체중)당 0.03 mg)을 피하 주사하고 마취를 중단했습니다.

조직 수집 및 처리

수행할 분석 유형에 적합한 방법을 사용하여 이식 후 2, 6 또는 12주에 동물을 종료했습니다.

조직학 및 면역조직화학

이식 후 2, 6 또는 12주에 쥐를 헤파린 처리된(10 U ml) 심장 관류를 통해 종료시켰습니다.^{- 1}, Sigma-Aldrich) PBS에 이어 PBS에 4% 파라포름알데히드(PFA, Sigma-Aldrich)를 첨가했습니다. 뇌를 4시간 동안 24% PFA에 고정한 후 적어도 30시간 동안 PBS에 있는 48% 자당으로 옮겨 이소펜탄에 동결시켰습니다. 그런 다음 뇌를 80 μm에서 냉동절편할 때까지 -25 °C에서 보관했습니다. 그런 다음 조직을 이온화된 칼슘 결합 어댑터 분자 1(Iba-1)에 대해 염색하여 소교세포 활성화 수준을 결정했습니다. 간단히 말하면, 조직 절편을 5차 항체 항-Iba-0.1(1:4, 1-1, Wako)과 함께 1,000°C에서 밤새 배양하기 전에 019% Triton-X가 포함된 PBS에서 19741% 염소 혈청으로 594시간 동안 차단했습니다. 그런 다음 절편을 1차 항체인 항토끼 Alexa Fluor 400(11012:1, A-4,6, Thermo Fisher)로 실온에서 2시간 동안 염색했습니다. 슬라이드는 3-diamidino-3.7-phenylindole(Thermo Fisher)이 포함된 Prolong Gold 퇴색 방지 장착 미디어를 사용하여 커버슬립으로 장착되었습니다. 프로브의 면적은 XNUMX × XNUMX mm입니다.² 뇌의 피질 표면에; 염색을 위해 선택된 조직 섹션은 이 영역의 길이가 3.2mm로 덮여 있습니다. 슬라이드는 3DHistech Pannoramic-250 현미경 슬라이드 스캐너를 사용하여 20×에서 이미지화하고 이미지는 CaseViewer v.2.4(3DHistech)를 사용하여 분석했습니다. 소교세포 활성화를 평가하기 위해 3.2mm 영역을 덮었고 100μm마다 하나의 이미지를 분석했습니다. 탐침 부위 바로 아래 영역을 포함하는 뇌 정중선에서 8.5mm 떨어진 외피질 탐침 부위의 단면을 자세히 설명하는 이미지를 3× 배율로 촬영했습니다.

이미지 처리

현미경 데이터는 소교세포 표현형 특성화를 위한 알고리즘을 사용하여 이미지 처리되었습니다(보충 그림 2). 13). 소교세포 활성화는 맞춤형 CellProfiler*(Broad Institute, v.3.1.9 from from)을 사용하여 분석되었습니다. https://cellprofiler.org/) 파이프라인. 먼저, EnhanceOrSuppressFeatures 모듈을 사용하여 관성 강화 방법을 적용하여 신경돌기와 같은 사상체 구조를 강화했습니다. 향상된 이미지에서 IdentityPrimaryObjects 모듈을 사용하여 셀을 분할했습니다. 셀의 예비 측정에서는 적절한 물체 직경 범위가 3~40 픽셀인 것으로 나타났습니다. 이 직경 범위를 벗어나거나 이미지 가장자리에 닿는 개체는 폐기되었습니다. 적응형 창 크기가 50픽셀인 XNUMX클래스 Otsu 적응형 임계값 지정 전략을 사용하여 셀을 분할했습니다. IdentityPrimaryObjects 모듈에 의해 식별된 개체는 셀 분류에 필요한 속성을 계산하기 위해 MeasureObjectSizeShape 모듈에 입력되었습니다. ClassifyObjects 모듈에서는 분류의 기반이 되는 범주를 AreaShape로 지정하고 해당 측정값으로 Extent를 선택했습니다. 세포는 다음과 같이 분류되었다. '범위 속성은 경계 상자가 차지하는 영역에 대한 셀이 차지하는 영역의 비율인 범위 속성에 따라 활성화됨' 또는 '비활성화됨'입니다. 이 분류 접근법은 활성화된 미세아교세포가 큰 세포체를 갖고 프로세스가 없기 때문에 활성화되지 않은 미세아교세포보다 경계 상자의 훨씬 더 많은 부분을 차지한다는 사실에 의해 합리화되었습니다. 마지막으로 CalculateMath 및 ImportToSpreadsheet 모듈을 사용하여 원하는 통계를 계산하고 출력했습니다.

통계 분석

데이터 세트는 n =  3 각 장치 유형(PI 전용 임플란트(PI), 미세 가공된 금(금)이 노출된 PI, 항상 미세 가공된 금과 EGNITE(EGNITE)이 포함된 PI). 단, 6 주 금은 예외입니다. n ELISA 데이터의 경우 = 2. 반대쪽 반구는 각 시점에서 결합되어 n 이식 후 9주 및 2주에 = 12 및 n = 8 이식 후 6주째. 데이터 분석은 GraphPad Prism v.8 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 통계 분석은 적절한 경우 Tukey의 다중 비교 테스트와 함께 양방향 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 완료되었습니다. P < 0.05는 유의미한 것으로 간주되었습니다.

엘리사

이식 기간 이후, 동물은 경추 탈구로 종료되었습니다. 뇌 조직은 뇌의 우반구와 좌반구 모두에서 추출되었으며, 액체 질소에서 급냉되었으며 추가 사용 시까지 -80°C에서 보관되었습니다. 프로테아제와 포스파타제 억제제(Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, Thermo Fisher)를 함유한 NP-40 용해 완충액(150mM NaCl, 50mM Tris-Cl, 1% Nonidet P40 대체물, Fluka, pH 7.4로 조정됨)을 사용하여 조직을 용해시켰습니다. 이어서 조직의 기계적 파괴가 뒤따른다(TissueLyser LT, Qiagen). 그런 다음 샘플을 10rpm에서 5,000분 동안 원심분리하고, 추가 사용 시까지 상층액을 4°C에서 보관했습니다. 비드 기반 다중 ELISA 키트인 LEGENDplex Rat Inflammation Panel(카탈로그 번호 740401, BioLegend)을 실행하여 다음 사이토카인을 정량화했습니다. IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-17A, IL-18, IL-33, CXCL1(KC), CCL2(MCP-1), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자, 인터페론-γ 및 종양 괴사 인자. 키트는 제조업체의 지침에 따라 실행되었으며 단백질은 15μl의 고정 용량으로 로드되었습니다. 상청액과 함께 인큐베이션한 후 비드를 BD FACSVerse 유세포 분석기에서 작동시키고 LEGENDplex 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석했습니다.

신경 자극

근막 내 이식

모든 동물 실험은 유럽 공동체 협의회 지침 2010/63/EU에 따라 Universitat Autònoma de Barcelona 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 동물은 22h 명/2h 암주기 하에 12 ± 12 °C에서 사육되었으며 음식과 물은 자유롭게 이용 가능했습니다. 마취된 암컷 Sprague-Dawley 쥐의 좌골 신경(250~300 g, ∼18주령)을 수술적으로 노출시키고 10-0 루프 스레드에 부착된 직선 바늘을 사용하여 좌골 신경을 가로질러 TIME 전극을 이식했습니다.⁴⁶. 신경 다발 내부 활성 부위의 정확한 위치를 확인하기 위해 해부 현미경으로 과정을 모니터링했습니다(그림 1). 4b). 실험 동안 동물의 체온은 가열 패드를 사용하여 유지되었습니다.

신경 자극은 위상당 100 μs의 고정 지속 기간의 이상 전류 펄스 열을 적용하고 다른 EGNITE를 통해 0 초 동안 150 Hz에서 1 또는 3 μA 단계로 3에서 33 μA까지 진폭을 증가시킴으로써 수행되었습니다(자극기 DS4, Digitimer). 미세 전극. 동시에 각 근육에 배치된 작은 바늘 전극(길이 13mm, 직경 0.4mm, 스테인레스 스틸 바늘 전극 A-03-14BEP, Bionic)을 사용하여 GM, TA 및 PL 근육에서 CMAP를 기록했습니다.⁶². 활성 전극은 근육 배에 배치되었고 기준은 힘줄 수준에 배치되었습니다. 근전도 기록은 증폭(GM 및 TA의 경우 ×100, PL의 경우 ×1,000, P511AC 증폭기, Grass), 대역 통과 필터링(3 Hz ~ 3 kHz) 및 PowerLab 기록 시스템(PowerLab16SP, ADInstruments)을 사용하여 20kHz에서 디지털화되었습니다.

데이터 분석

각 CMAP의 진폭은 기준선부터 최대 음의 피크까지 측정되었습니다. 전압 피크 측정은 실험에서 각 근육에 대해 얻은 최대 CMAP 진폭으로 정규화되었습니다. 선택성 지수(SI)는 각 활성 부위에 대해 한 근육에 대한 정규화된 CMAP 진폭 CMAP 간의 비율로 계산되었습니다._i, 공식 SI에 따라 세 근육의 정규화된 CMAP 진폭의 합_i = nCMAP_i/∑nCMAP_j, 기능적으로 관련된 최소한의 근육 반응(이전에 결정된 해당 근육의 ​​최대 CMAP 진폭과 관련하여 근육 중 하나에 대한 최소 5% CMAP 진폭으로 정의됨)을 유도하는 최소 자극 전류 진폭에서. 그런 다음 세 가지 근육 각각에 대해 가장 높은 SI를 갖는 활성 부위를 주어진 실험에서 각 근육에 대한 SI로 선택했습니다.

만성 신경내 생체적합성

이전에 보고된 절차에 따라^50,63, 마취된 Sprague-Dawley 암컷 쥐의 좌골 신경(250-300 g, ∼18주령)을 노출시키고 EGNITE 유무에 관계없이 생체 내 생체 적합성을 위한 장치를 좌골 신경의 경골 가지에 세로로 이식했습니다(n =그룹당  6–8). 간단히 말하면, 10-0 루프 스레드(STC-6, Ethicon)에 부착된 직선 바늘을 사용하여 세분지에서 신경을 관통합니다. 실은 구부러진 전극 스트립의 화살표 모양 끝을 당깁니다. 실을 빼기 위해 끝부분을 자르고, 장치가 빠지는 것을 방지하기 위해 각 팔의 끝부분을 살짝 구부립니다. 신경 내부의 이물질 반응을 더 잘 연구할 수 있기 때문에 종방향 임플란트가 선택되었습니다.⁵⁰.

신경 및 동물 기능 평가

신경 전도, 알제시메트리 및 걷기 트랙 운동 테스트를 통해 이식 후 후속 조치 동안 동물을 평가했습니다.⁶². 전도 테스트를 위해 이식된 발과 반대편 발의 좌골 신경을 좌골 절흔의 바늘 전극으로 자극하고 PL 근육의 CMAP를 위와 같이 기록했습니다. CMAP의 대기 시간과 진폭을 측정했습니다. Algesimetry 테스트를 위해 쥐를 철망 플랫폼에 놓고 전자 Von Frey algesimeter(Bioseb)에 연결된 금속 팁을 사용하여 기계적 무해 자극을 가했습니다. 이식된 발과 반대편 발의 통각 역치(동물이 발을 빼내는 그램 단위의 힘)를 측정했습니다. 보행 트랙 테스트를 위해 뒷발의 발바닥 표면을 검정색 잉크로 칠하고 각 쥐를 복도를 따라 걷게 했습니다. 발자국을 수집하고 좌골 기능 지수를 계산했습니다.⁶².

조직학

2주 또는 8주 후, 동물에게 PFA(4%)를 관류하고, 좌골 신경을 수확하고, 후고정하고, 냉동보존하고, 조직학적 분석을 위해 처리했습니다. FBR의 평가를 위해 좌골 신경을 저온 유지 장치(Leica CM15)를 사용하여 190μm 두께의 횡단면으로 절단했습니다. 샘플은 수초화된 축색돌기(신경필라멘트 97K, 200:1, 발달 연구 하이브리도마 은행 라벨을 붙인 항-RT200) 및 대식세포(항-Iba-1, 1:500, Wako)에 대한 1차 항체로 염색되었습니다. 그런 다음 섹션을 488차 항체 당나귀 항 마우스 Alexa Fluor 555 및 당나귀 항 토끼 Alexa Fluor 1(200:2, Invitrogen)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양했습니다. 경골 신경에 있는 임플란트 중심부의 대표 절편을 선정하고, 디지털 카메라(DS-RiXNUMX, Nikon)에 부착된 표면형광현미경(Eclipse Ni, Nikon)으로 영상을 촬영하고 ImageJ 소프트웨어(National Institutes)를 이용하여 영상 분석을 수행하였다. 건강). 경골 신경 전체 영역에서 Iba-XNUMX 양성 세포의 양을 정량화하였고, 조직 피막의 두께는 보형물 각 면에서 가장 가까운 축삭까지의 평균 거리로 측정하였다.

통계 분석

데이터의 통계적 분석을 위해 단방향 또는 양방향 ANOVA를 사용하고 그룹 또는 시간 간의 차이에 대한 Bonferroni 사후 테스트를 사용했습니다. GraphPad Prism 소프트웨어는 그래픽 표현 및 분석에 사용되었습니다. 다음과 같은 경우 통계적 유의성을 고려했습니다. P <0.05.

보고 요약

연구 설계에 대한 추가 정보는 Nature 포트폴리오 보고 요약 이 기사에 링크되어 있습니다.

• SEO 기반 콘텐츠 및 PR 배포. 오늘 증폭하십시오.
• PlatoData.Network 수직 생성 Ai. 자신에게 권한을 부여하십시오. 여기에서 액세스하십시오.
• PlatoAiStream. 웹3 인텔리전스. 지식 증폭. 여기에서 액세스하십시오.
• 플라톤ESG. 탄소, 클린테크, 에너지, 환경, 태양광, 폐기물 관리. 여기에서 액세스하십시오.
• PlatoHealth. 생명 공학 및 임상 시험 인텔리전스. 여기에서 액세스하십시오.
• 출처: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01570-5