Préparation de la culture neuronale primaire

Les protocoles expérimentaux impliquant la récolte de tissus animaux ont été approuvés par l'Office vétérinaire du canton de Bâle-Ville conformément à la loi fédérale suisse sur le bien-être des animaux et ont été réalisés conformément aux directives approuvées. Les puces HD-MEA ou les lamelles de verre ont été stérilisées dans de l'éthanol à 70% pendant 60 minutes et lavées avec de l'eau déminéralisée stérile sous flux d'air laminaire. Le réseau d'électrodes ou les lamelles ont ensuite été traités avec 10 µl de poly(éthylèneimine) à 0.05 % (v/v) (Sigma-Aldrich) dans un tampon borate (Thermo Fisher Scientific) pendant 40 min à température ambiante et lavés avec de l'eau déionisée, puis par incubation avec 8 µl de 0.02 mg ml^-1 laminine (Sigma-Aldrich) dans un milieu neurobasal (NB) (Gibco) pendant 30 min à 37 °C. Des embryons de rat E-18 Wistar ont été disséqués dans du HBSS glacé (Gibco) pour récolter leurs cortex, qui ont ensuite été dissociés dans 0.25, 0.45% de trypsine – EDTA (Gibco). Les cellules corticales dissociées ont été doucement triturées et filtrées à travers un tamis de 10 µm pour obtenir des cellules uniques. La densité cellulaire a été estimée et 3,000 µl de XNUMX XNUMX cellules µl^-1 La solution a été déposée sur le réseau d'électrodes. Les cellules ont été autorisées à se fixer aux matrices en incubant les puces à 37 ° C pendant 40 minutes avant d'ajouter 2 ml de milieu de placage NB. Le milieu de placage NB a été préparé en ajoutant 50 ml de sérum de cheval (HyClone), 1.25, 10 ml de glutamax (Invitrogen) et 27 ml de B-450 (Invitrogen) à 37 ml de Neurobasal (Gibco). Les puces HD-MEA ont été conservées dans un incubateur de culture cellulaire à 5 °C et XNUMX % de CO₂. Après 3 jours, les cellules ont été cultivées dans un milieu de placage NB sans sérum jusqu'à DIV 20 en échangeant 50 % du milieu de culture avec du milieu de placage NB frais une fois tous les 3 jours. Toutes les expériences, à l'exception des données présentées sur la Fig. 1i, ont été réalisées entre DIV 14 et 16 car les cellules présentaient des propriétés mécaniques différentes lors de leur croissance¹¹. Les expériences pour les données présentées dans la Fig. 1i ont été collectés entre DIV 22 et 24, lorsque les réseaux neuronaux ont montré une activité d'éclatement synchrone.

Préparation des tranches de cervelet

Des souris de type sauvage (jour postnatal 14 C57BL/6Rj, Janvier Labs) ont été décapitées sous anesthésie à l'isoflurane ; leurs cerveaux ont été prélevés et immergés dans des bulles de carbogène glacées (95 % d'O₂ + 5% de CO₂) solution de liquide céphalo-rachidien artificiel (LCRa). Coupes cérébelleuses sagittales de ~350 µm ont été obtenus à l'aide d'un vibratome (VT1200S, Leica). Toutes les tranches ont été maintenues à température ambiante dans du aCSF jusqu'à utilisation. L'aCSF était composé de 125 mM de NaCl, 2.5 mM de KCl, 2 mM de CaCl₂, 1 mM MgCl₂, glucose 25 mM, NaH 1.25 mM₂PO₄ et NaHCO 25 mM₃. Le réseau d'électrodes des puces HD-MEA a ensuite été traité avec 10 µl de poly(éthylèneimine) à 0.05 % (v/v) (Sigma-Aldrich) dans un tampon borate (Thermo Fisher Scientific) pendant 40 min à température ambiante et lavé avec du liquide désionisé. eau, suivi d'une incubation avec 8 µl de 0.02 mg ml^-1 laminine (Sigma-Aldrich) dans un milieu Neurobasal (Gibco) pendant 30 min à 37 °C. L'excès de laminine après l'incubation a été retiré à la pipette et la matrice a été laissée sécher. La tranche cérébelleuse a ensuite été délicatement placée sur le réseau d'électrodes à l'aide d'une pointe de pipette coupée pour éviter les dommages causés par les forces de cisaillement lors du pipetage (Fig. 13). Une harpe sur mesure de 2 mm a été placée sur la tranche de tissu pour immobiliser la tranche de tissu. Des tranches de tissus ont ensuite été immergées dans du aCSF en les ajoutant doucement goutte à goutte. La tranche de tissu immobilisée immergée dans l'aCSF a ensuite été laissée adhérer au réseau d'électrodes pendant 30 min. Juste avant l'enregistrement, la harpe a été retirée et la tête AFM a été montée sur la puce HD-MEA. Le tissu a été perfusé en continu avec de l'aCSF barboté de carbogène pour maintenir la viabilité et l'activité cellulaire.

Configuration HD-MEA

Puces HD-MEA basées sur des semi-conducteurs à oxyde métallique complémentaire (CMOS) comprenant 26,400 17.5 électrodes (pas de 3.85 µm) dans une zone de détection globale de 2.10 × XNUMX mm² ont été utilisées²⁵. Les puces ont été fabriquées dans une fonderie commerciale, puis post-traitées et emballées en interne (Fig. 1b). Des anneaux en polycarbonate transparent (GB Plex) de 4 cm de diamètre ont été collés sur les puces et les fils de liaison ont été encapsulés avec de l'époxy foncé biocompatible (EPO-TEK 353 ND). Le revêtement noir platine des électrodes a été déposé par électrolyse pour diminuer l'impédance des électrodes et améliorer les caractéristiques signal/bruit (Fig. 1c). Des versions commerciales de notre système HD-MEA développé sur mesure peuvent être achetées (modèle MaxOne) auprès de MaxWell Biosystems.

Porte-échantillon et chauffage de scène

Un réchauffeur d'échantillon thermoélectrique à base de Peltier, doté d'une sonde de température pour un retour en boucle fermée, a été contrôlé par un contrôleur de température fabriqué maison pour maintenir l'échantillon à 37 °C. Le chauffe-échantillon a été aligné avec le tampon de conduction thermique de la puce HD-MEA. Les puces ont ensuite été montées sur un porte-échantillon et verrouillées en position avec la goupille à ressort du support. Prusa I3 MK3S+ a été utilisé pour imprimer en 3D les porte-seringues frugaux pour la configuration de perfusion qui étaient fixés au porte-échantillon. L'ensemble de l'installation a été monté sur un support fait sur mesure x,y platine piézo via une plaque de base.

x,y scène piézo

Deux étages piézo linéaires (série Xeryon XLS-1) avec une résolution d'encodeur de 5 nm ont été fixés l'un à l'autre perpendiculairement (Fig. 1a). Les platines linéaires étaient contrôlées par un contrôleur multiaxes Xeryon XD-M connecté à une interface utilisateur basée sur LabVIEW. L'électrode supérieure gauche de la puce HD-MEA a été enregistrée comme origine du système de coordonnées et les coordonnées de l'électrode avec les neurones d'intérêt ont été extraites de l'interface utilisateur de MaxWell Biosystems. Ces coordonnées ont ensuite été transmises au contrôleur XD-M à l’aide de scripts personnalisés pour faciliter le positionnement des neurones sous le porte-à-faux de l’AFM.

Microscopie à fluorescence à longue distance de travail

Un microscope optique (Nikon SMZ 25) avec des objectifs à zoom réglables 15.75 × et un objectif 1 × (Nikon, MNH55100 P2-SHR PlanApo 1X ; ouverture numérique, 0.156) a été aligné sur la configuration mentionnée dans le texte principal. Un éclairage à diode électroluminescente (DEL) contrôlable par TTL (CoolLED PE 300^ultra) a été utilisé comme source de lumière pour l’imagerie sans filtre d’excitation/émission. Un séparateur de faisceau triple passe-bande (F66-412, AHF Analysentechnik) a été utilisé pour filtrer la lumière d'excitation réfléchie par la puce HD-MEA. Un grand appareil photo matriciel CMOS (Nikon DS-QI2) avec 4,908 3,264 × 7.3 7.3 pixels (taille des pixels, XNUMX × XNUMX µm²) a été monté sur le microscope à l'aide d'un objectif de projecteur monté 2.5 × f permettant un échantillonnage jusqu'à 45 ips avec un grossissement final de ~40× et une résolution de 0.46 µm par pixel.

AFM

Une tête AFM (Catalyst, Bruker) a été montée et alignée avec la configuration mentionnée dans le texte principal. Un scanner piézoélectrique de 15 µm sur la tête a été utilisé pour collecter toutes les courbes force-déplacement et force-temps, tandis qu'un piézoélectrique de 150 µm a été utilisé pour positionner le porte-à-faux sur le neurone. Les données ont été collectées et exportées vers des fichiers .txt à l'aide du logiciel AFM (Nanoscope v.9.2, Bruker). Les données ont été analysées et tracées avec des scripts Python. Des billes de silice d'un diamètre de 5 µm (Kisker Biotech) ont été collées à l'extrémité libre de microcantilever sans pointe (CSC-37 ou 38, Micromash HQ) à l'aide de colle ultraviolette (Dymax) et ont été durcies aux ultraviolets pendant 20 min. Les cantilevers perlés ont été nettoyés pendant 5 minutes à l'aide d'un nettoyeur plasma (Harrick Plasma), puis montés sur le support de sonde fluide avec une fenêtre saphir de 2 mm et calibrés à l'aide de la méthode du bruit thermique.⁴⁸.

AFM corrélatif, HD-MEA et microscopie optique

L'AFM, le HD-MEA et le microscope optique ont été alignés comme indiqué (Fig. 1a). La lumière de fluorescence des neurones des puces HD-MEA a été collectée à travers une fenêtre en saphir dans le support en porte-à-faux de l'AFM et transmise au microscope optique. Les images de fluorescence des neurones sur la puce HD-MEA ont été collectées séquentiellement dans les régions d'intérêt, assemblées et enregistrées sur l'interface utilisateur Maxwell MEA pour localiser les neurones sur la puce HD-MEA (Fig. 2a à d). La x,y Les coordonnées des neurones d'intérêt ont ensuite été transmises au x,y scène via des scripts LabVIEW, plaçant ainsi le porte-à-faux AFM aux positions souhaitées avec ~Précision de 5 nm. L’ensemble de l’installation a été installé sur une table isolée amortissante et placé dans une chambre insonorisée et à température contrôlée afin de réduire le bruit mécanique et la dérive thermique.

Synchronisation TTL

Les impulsions TTL du DS-Qi2 ont été extraites à l'aide d'un connecteur fabriqué maison avec une broche à quatre pôles de 3.5 pouces, une mini fiche d'un côté et un cavalier femelle 24 AWG (RND 255-00015, Distrelec) de l'autre côté. La broche 1 était la masse et la broche 4 (EXP_TMG) recevait 2.4 V au niveau HI (haut) en fonctionnement en direct selon le temps d'exposition défini. Une impulsion négative de 0 à 5 V a été extraite du canal de sortie 1 du panneau avant du contrôleur AFM (Bruker Nanoscope V) via un connecteur fabriqué maison avec une broche mâle BNC standard d'un côté et un cavalier femelle 24 AWG (RND 255). -00015, Distrelec) de l'autre côté. Les signaux, extraits de la caméra et de l'AFM, ont ensuite été acheminés vers les broches 2 et 8 d'un seul optocoupleur haute vitesse. Les signaux ont ensuite été envoyés au système d'acquisition de données HD-MEA via un réseau de portes programmable sur site, fournissant des horodatages précis des événements détectés par l'AFM et la microscopie optique sur les enregistrements de fichiers bruts de données HD-MEA collectées à 20 kHz.

Protocole et mesures de suivi de la rigidité

Le module d'Young apparent a été calculé à partir d'une moyenne de cinq courbes force-déplacement recueillies sur le soma neuronal. Nous avons ensuite attendu 30 secondes pour nous assurer qu’il n’y avait pas de changements mécaniques induits par la mesure dans les neurones et avons collecté à nouveau cinq courbes force-déplacement (Fig. 2a), que nous avons appelé un cycle de mesure et qui est représenté par un point (Fig. 2b). Nous avons répété ce cycle de mesure jusqu'à 5 min sur un neurone et sommes passés au neurone suivant du réseau. Soixante minutes après la première mesure sur le premier neurone, nous sommes revenus sur le même neurone et le cycle de mesure a été répété. Les mesures comprenaient un cycle de suivi à longue échelle de temps. Ce cycle de suivi à longue échelle a été répété trois fois (Fig. 2c). Pour les mesures de rigidité des neurites, nous avons d'abord enregistré l'activité électrophysiologique des neurones pendant 5 minutes, puis identifié deux neurites bien isolés par neurone et collecté des courbes force-déplacement sur ceux-ci. Les courbes force-déplacement ont été collectées à l'aide de microcantilevers CSC-38 (constante de ressort nominale, ~0.02 N·m^-1) comportant des billes de 5 µm de diamètre comme mentionné ci-dessus. Une force maximale de 700 pN sur les somas et de 400 pN sur les neurites a été utilisée pour collecter les courbes force-distance (Fig. 14a, b). Pour toutes les mesures, la vitesse de la pointe a été maintenue constante à 10 µm s^-1. Le point de contact a été déterminé à partir de la courbe force d'approche-déplacement comme le x intercepter à une valeur de force cinq fois supérieure à l’écart type du bruit de base, suivi d’une curation manuelle. La profondeur d'indentation a été calculée comme la valeur de déplacement au point de contact après avoir soustrait la déflexion en porte-à-faux et fixé la valeur de déplacement à la force maximale à zéro dans la courbe force-déplacement (Fig. 14c). La profondeur d'indentation pour la même force maximale donnée varierait d'un soma à l'autre en fonction de sa rigidité. Par conséquent, nous avons fixé une profondeur de coupure de 750 nm. Dans les courbes force-déplacement, toutes les valeurs de force pour lesquelles la valeur de déplacement correspondante dépassait la profondeur limite d'indentation ont été rejetées. Le module d'Young apparent a été calculé à partir de courbes auxquelles le modèle de Hertz pour un pénétrateur sphérique avec un demi-espace élastique⁴⁹ a été ajusté à l'aide de codes personnalisés en Python.

Les valeurs du module d'Young mesurées dans notre étude pour le soma des neurones se situent dans une plage comparable à celle des rapports précédents.^10,11. Cependant, le module d'Young des neurites est inférieur aux valeurs rapportées, alors qu'elles sont toujours d'un ordre de grandeur comparable. Ce biais pourrait résulter de notre choix de mesurer les deux neurites basaux les plus épais du neurone, qui sont généralement plus mous. Pour mesurer la rigidité des somas neuronaux lors des rafales et des IBI, nous avons collecté des courbes force-déplacement à une fréquence de 5 Hz. Ce processus a été répété plusieurs fois pour chaque soma et la rigidité moyenne du soma pendant les périodes d'éclatement et pendant les IBI a été calculée. Alors que les salves apparaissent généralement selon un schéma rythmique (Fig. 2h), il est difficile de prédire pour les neurones en culture le moment où un seul neurone subit un éclatement. Pour collecter au moins deux courbes force-déplacement pendant les périodes d'éclatement ou IBI, tout en minimisant le nombre de fois où la sonde entre en contact avec le neurone, nous avons indenté le neurone 5 fois.^-1.

Protocole de compression statique

Une perle de 5 µm de diamètre, collée sur un microcantilever AFM sans pointe (CSC-37 ; constante de ressort nominale, ~0.8 N·m^-1), était positionné au-dessus du soma. La perle a été abaissée sur le soma jusqu'à ce qu'une force de consigne requise pour appliquer 0.1 kPa ou 5 kPa soit atteinte et maintenue en contact pendant 60 s en utilisant un retour à hauteur constante avant de rétracter la perle (Fig. 5b). La courbe force-temps enregistrée à une fréquence d'échantillonnage de 500 kHz montre à la fois le déplacement vertical de la tête de l'AFM et la réponse en force du soma. La hauteur moyenne du soma des neurones corticaux du rat était ~8 µm (Fig. 11).

Imagerie fonctionnelle du calcium

Des capteurs de calcium génétiquement codés ont été exprimés dans les neurones à l'aide de virus adéno-associés (AAV). AAV1-EF1a-GCaMP6s (1.8 × 10¹³ génomes viraux ml^-1) ont été utilisés pour une multiplicité d'infections de 5.0 × 10⁴ pour exprimer les GCaMP6. Les neurones ont été infectés à DIV 3 ; l'expression était généralement observée à DIV 5–9.

Analyse par imagerie fonctionnelle du calcium de neurones stimulés mécaniquement

Une courbe d'intensité de fluorescence moyenne ΔI/I de la courbe GCaMP6s a été calculée comme le signal moyen sur toute l'image par rapport à la ligne de base de l'image. La détection des pics dans le signal a été réalisée en recherchant les maxima locaux dans une fenêtre de 3 s. Un événement a été marqué comme le début d’une réponse neuronale lorsque l’amplitude du signal calcique a atteint 10 % de la valeur maximale. Données de 2.5 s avant et 10 s après le début du pic de réponse (t = 0) a été tracé.

Enregistrements HD-MEA

L'interface utilisateur de MaxWell Biosystem (MaxLab Live v.22.13) a été utilisée pour enregistrer les données. L'image de fluorescence de la puce entière a été enregistrée sur l'interface utilisateur (Fig. 2c). Les neurones d'intérêt ont été identifiés à partir des pointes de calcium, et l'activité de pointe (potentiels d'action) a été obtenue à partir des tracés raster en direct sur l'interface utilisateur. Une fois qu’un neurone d’intérêt a été identifié, 512 électrodes autour de ce neurone dans une configuration rectangulaire ont été acheminées vers la lecture. Après avoir positionné le porte-à-faux de l'AFM sur le neurone, les canaux ont été décalés cinq fois pour compenser le bruit du laser infrarouge utilisé par l'AFM pour détecter la déviation du porte-à-faux avant de démarrer l'enregistrement. Un gain de 512 et un filtre passe-haut avec une coupure à 300 Hz ont été utilisés pour tous les enregistrements. Pour améliorer les performances des algorithmes de tri de pointes de la Fig. 5, les potentiels d'action neuronaux ont été enregistrés 2.5 minutes avant et après la stimulation mécanique.

Analyse des données HD-MEA

Toutes les données HD-MEA collectées ont été traitées via des scripts personnalisés basés sur Spikeinterface⁵⁰. En bref, les enregistrements extracellulaires ont été filtrés et triés par pointes à l'aide de Kilosort2, suivis d'une conservation manuelle de tous les enregistrements. Un seuil conservateur de violation de l’intervalle entre pointes de 0.5 et un seuil de rapport signal/bruit de 5.0 ont été utilisés pour la conservation. La similarité des modèles, des autocorrélogrammes et des corrélogrammes croisés ont été utilisés pour l'évaluation de la qualité des unités. Les caractéristiques de forme d'onde telles que la demi-largeur et la pente de repolarisation ont été extraites pour les unités triées par pointes pour les époques respectives avec des scripts Python en utilisant les fonctions de Spikeinterface (Fig. 12a–je). Les changements relatifs dans les caractéristiques de forme d'onde sur toutes les électrodes dans l'empreinte extracellulaire d'un neurone ont été obtenus en divisant la valeur de la caractéristique de forme d'onde moyenne de toutes les pointes pendant la compression mécanique par la caractéristique de forme d'onde moyenne de toutes les pointes avant la compression. La cadence de tir moyenne et l'intervalle entre les pointes ont été calculés à partir des trains de pointes extraits à l'aide de la boîte à outils d'analyse électrophysiologique Elephant 0.11.2.⁵¹. Les cadences de déclenchement moyennes pour les données de corrélation de rigidité ont été calculées en plaçant les pointes dans des bacs de 30 s pour correspondre aux points temporels des valeurs de rigidité. Les taux de déclenchement moyens pour le protocole de compression ont été calculés en plaçant les pointes dans trois groupes avant, pendant et après la compression.

Microscopie combinée AFM et confocale

L'imagerie confocale accélérée a été réalisée sur un microscope confocal à balayage laser inversé (Observer Z1, LSM 700; Zeiss) équipé d'un objectif à immersion dans l'eau 25 × / 0.8, 200 LCI PlanApo (Zeiss). Un AFM (CellHesion 0.1; JPK Instruments) a été monté sur le microscope confocal. Les protocoles de compression mécanique ont été exécutés à l'aide du logiciel JPK CellHesion. Pour la stimulation mécanique, l'AFM a été utilisé pour approcher le porte-à-faux avec la bille sur la cellule à des vitesses de 1, 10, 100 ou XNUMX μm s^-1 jusqu'à atteindre la force de consigne, puis se rétracte immédiatement à la même vitesse que celle utilisée pour l'approche. Pour les expériences déterminant la force seuil pour stimuler mécaniquement les neurones, la force de consigne appliquée a été augmentée progressivement de 50 à 400 nN par incréments de 50 nN et à intervalles de 20 s (Fig. 6). La force de consigne de la bille qui s'approchait a été augmentée progressivement jusqu'à ce qu'une réponse neuronale soit enregistrée. Après une stimulation réussie du neurone, le cantilever a été rétracté et un nouveau neurone a été sélectionné pour la stimulation.

analyses statistiques

Toutes les données montrant les propriétés de la forme d'onde ont été testées pour leur normalité avec le test de Shapiro-Wilk et Q-Q des parcelles. Tous les groupes de données n'étaient pas normalement distribués et étaient des groupes de données dépendants. Par conséquent, nous avons utilisé le test de Wilcoxon signé-rank. L’hypothèse nulle était qu’il n’y avait aucune différence dans les médianes entre les distributions comparées par paire. P les valeurs >0.05 ont été considérées comme non significatives. Les caractéristiques de la forme d'onde ont été extraites de la forme d'onde moyenne de chaque neurone obtenue à partir de n > 5,000 XNUMX pointes. Toutes les données montrant les taux de tir moyens ont été comparées au test de Wilcoxon signé-rank de n > 10,000 XNUMX pointes. Les groupes de données AFM ont été comparés à l'aide de la méthode bilatéral de Mann – Whitney U-tester. P les valeurs de chaque comparaison sont mentionnées dans les légendes des figures. La corrélation de Pearson a été utilisée pour déterminer les corrélations linéaires entre les valeurs de rigidité et de cadence de tir moyenne. Aucune méthode statistique n'a été utilisée pour prédéterminer la taille des échantillons. La collecte et l'analyse des données n'ont pas été effectuées indépendamment des conditions des expériences.

Résumé du rapport

De plus amples informations sur le design de la recherche sont disponibles dans Sommaire des rapports sur le portefeuille de la nature lié à cet article.

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