Ethische Aussage

Diese Studie wurde in voller Übereinstimmung mit den CONSORT-Richtlinien 2010 der World Medical Association Declaration of Helsinki durchgeführt. Das Studienprotokoll wurde von der Ethikkommission des angeschlossenen Huai'an-Krankenhauses der Medizinischen Universität Xuzhou genehmigt (institutionelle Genehmigungsnummer: HEYLL2020325). Es wurde im chinesischen Register für klinische Studien registriert (Registrierungsnummer: ChiCTR2000033420, http://www.chictr.org.cn/, Datum der Erstregistrierung: 31). Vor den Behandlungen wurde jedem Probanden eine schriftliche Einverständniserklärung vorgelegt.

Teilnehmer

Die Patienten wurden nacheinander rekrutiert und an die Abteilung für Rheumatologie, Stomatologie und Ophthalmologie des angegliederten Huai'an-Krankenhauses der Medizinischen Universität Xuzhou überwiesen. Bei geeigneten Patienten wurde gemäß den Diagnosekriterien des American College of Rheumatology (ACR) für das Sjögren-Syndrom ein pSS diagnostiziert. Mindestens zwei Syndrome mit den folgenden drei objektiven Merkmalen erfüllen die Kriterien: (1) bei Patienten wird pSS neu diagnostiziert und sie haben keine vorherigen Behandlungen erhalten; (2) Positives Serum-Anti-SSA (Ro) und/oder Anti-SSB (La); (3) Labiale Speicheldrüsenbiopsie mit fokaler lymphatischer Infiltration mit einem Fokusscore ≥ 1 Fokus/4 mm²; (4) Keratoconjunctivitis sicca mit einem Augenfärbungswert ≥ 3.

Die Ausschlusskriterien für alle Patienten waren: (1) Sie verwenden derzeit keine täglichen Augentropfen gegen Glaukom und haben sich in den letzten 5 Jahren keiner Hornhautoperation oder kosmetischen Augenlidoperation unterzogen; (2) eine der folgenden Erkrankungen: Vorgeschichte einer Strahlenbehandlung im Kopf- und Halsbereich, Hepatitis-C-Infektion, erworbenes Immunschwächesyndrom, Sarkoidose, Amyloidose, Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit, IgG4-bedingte Erkrankung; (3) andere systemische Erkrankungen, die das Fortschreiten des pSS beeinflussen könnten, wie etwa systemischer Lupus erythematodes und rheumatoide Arthritis; (4) eine Vorgeschichte der chronisch obstruktiven Sialadenitis; (5) Schwangerschafts- oder Stillstatus.

Die Patienten wurden befragt, um Informationen zu ihren soziodemografischen Merkmalen, Lebensstilfaktoren, Medikamenteneinhaltung und Selbstpflegewissen bei Studieneintritt bereitzustellen. Beim ersten Screening wurden auch klinische Beurteilungen der Krankheitsaktivität durchgeführt.

Randomisierung und Maskierung

Die Patienten wurden über einen computergenerierten Randomisierungsplan zwei Gruppen zugeordnet. Der ADSC-Gruppe wurden ADSCs injiziert, während der Placebo-Gruppe eine 0.9 %ige Kochsalzlösung verabreicht wurde. Die zugeteilten Codes wurden verdeckt in signierten und versiegelten Umschlägen aufbewahrt. Ein externer Prüfer führte die Randomisierung durch. Prüfer, Patienten und Prüfärzte wurden zur Gruppenzuordnung maskiert. Nach der Durchführung der Behandlungen und der Analyse der Daten wurde eine Verblindung festgestellt.

Analyse der Stichprobengröße

Die Stichprobengrößenanalyse mit G Power Version 3.1.9.2 wurde mit der Walters-Methode unter Berücksichtigung zweier Probandengruppen ermittelt, eine Effektgröße von 0.30 und eine Standardabweichung von 1.7 aus einer früheren randomisierten kontrollierten klinischen Studie. Unter der Annahme einer normalen Stichprobenverteilung legen wir eine Potenz von 0.8 und einen Fehler von fest α = 0.05. Rechnet man 10 % mit der Abbrecherentschädigung während der Probezeit hinzu, ergibt sich eine Erhöhung von 20 %. Die endgültige Stichprobe umfasste 26 Probanden in jeder Gruppe, so dass eine Trennschärfe von 0.8 erhalten wurde.

Die Vorbereitung von ADSCs

Das Medikament in dieser Studie war eine Lösung von ADSCs. Fettgewebe wurde mittels Fettabsaugung am Bauch eines gesunden Spenders entnommen. Sie werden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und mit 0.075 % Kollagenase von Fettaspiraten befreit. Diese Stammzellen wurden dann in Dimethylsulfoxid und menschliches Blutplättchenlysat und 1 % Antibiotika bei Kulturbedingungen von 37 °C und 5 % CO verpackt₂. Die Oberflächenmarker von CD73, CD90 und CD105 wurden durch Durchflusszytometrie-Analyse identifiziert und waren negativ für die Expression von CD14, CD11b, CD45, CD19, CD79 und HLA-DR. Vor der Verwendung wurden eine Tumorigenitätsstudie, ein Sterilitätstest und ein negativer Mykoplasmentest durchgeführt.

Verfahren

Die endgültige therapeutische Arzneimittellösung bestand aus 5 Millionen Zellen pro Milliliter Lösung. Nach der Desinfektion der Oberflächenprojektion der bilateralen Ohrspeicheldrüsen mit Iodophor und dem sterilen Abdecken wurde die Injektionsstelle mit 1 % Lidocain anästhesiert. Eine Dosis von 1 ml ADSCs-Lösung wurde in 5 ml 0.9 %iger Kochsalzlösung verdünnt. Die endgültige Stammzelllösung wurde mit 0.05 ml ADSCs und einer gemischten Kochsalzlösung (5 × 10) in die bilateralen Drüsen injiziert⁴ Zellen) pro Kilogramm Patientengewicht mit einer 5-ml-Spritze und einer 0.45-mm-Nadel unter Ultraschallkontrolle. Die Dosierung und das Intervall der ADSC-Injektionen richteten sich nach unseren früheren Untersuchungen. Den Patienten in der Placebo-Gruppe wurde 0.9 %ige Kochsalzlösung im oben genannten Verhältnis injiziert. Vor der Injektion sollte ein Rückfluss gegen das Blut zur Spritze erfolgen. Nach 15-minütiger Ruhephase durften die Patienten den Raum verlassen. Die zweite Injektion wurde in der zweiten und vierten Woche unter ähnlichen Bedingungen in die beidseitigen Drüsen durchgeführt. Alle Probanden in diesem Versuch wurden mit Hygieneanweisungen und ohne jegliche medizinische Behandlung gestärkt. In dieser Studie wurden die Patienten zu vier Nachbeobachtungszeitpunkten klinisch untersucht: vor dem Eingriff, 1 Monat, 3 Monate und 6 Monate nach der dritten Injektion. Während der Nachsorge konnten die Patienten jederzeit aus der Studie aussteigen. Patienten, die mehr als zwei Mal keine Compliance-Rate erreichten, mussten nach Genehmigung durch den Hauptprüfarzt die Studie abbrechen.

Outcome Maßnahmen

Sialometrie

Die Patienten wurden gebeten, sich zwischen 8:00 und 10:00 Uhr im selben Raum mit konstanter Temperatur und Luftfeuchtigkeit aufzuhalten, um tageszeitliche Schwankungen zu minimieren. Auf Essen/Kauen, Trinken und Zähneputzen wurde 90 Minuten vor jedem Termin verzichtet. Nach einer Ruhezeit von 10 Minuten wurde unstimulierter Vollspeichel (UWS) über einen Zeitraum von 30 Minuten alle 5 Sekunden in einem sterilen und vorgewogenen Plastikbehälter gesammelt. Stimulierter Vollspeichel (SWS) wurde gesammelt, indem die Patienten gebeten wurden, ein Stück sterilisierten Silikonkautschukschlauch (4*8 mm) zu kauen und den gesamten Speichel in der gleichen Häufigkeit und Dauer wie UWS in einen anderen Behälter zu spucken. UWS und SWS wurden durch das Ergebnis der Neugewichtung jedes Behälters nach der Sammlung abzüglich des Gewichts des leeren Behälters bestimmt¹⁴.

Schirmer teste ich

Wir haben den Schirmer-I-Test zur Messung des Tränenflusses (LF) ohne vorherige topische Anästhesie zur Messung der Tränensekretion eingeführt. Ein Whatman-Spezialfilterpapierstreifen von 20 mm x 5 mm (Cytiva®, Shanghai, China) wurde im seitlichen Drittel des unteren beidseitigen Augenlids platziert. Die Länge des befeuchteten Teils des Streifens wurde in der fünften Minute gemessen¹⁵.

ESSDAI und ESSPRI¹⁶

Die Krankheitsaktivität wurde anhand des Sjögren-Syndrom-Krankheitsaktivitätsindex (ESSDAI) der European League Against Rheumatism bewertet. Diese Fragebögen wurden von den Patienten zu Studienbeginn und bei den Nachuntersuchungen ausgefüllt. Der ESSDAI umfasst 12 Bereiche, darunter Haut, Atmung, Niere, Gelenke, Muskeln, peripheres Nervensystem, Zentralnervensystem, Hämatologie, Drüsen, Konstitution, Lymphadenopathie und Immunologie, mit einer Gesamtpunktzahl zwischen 0 und 3 Punkten.

Der SS Patient Reported Index (ESSPRI) der European Alliance of Associations for Rheumatology ist ein vom Patienten auszufüllender Fragebogen zur Beurteilung der Krankheitssymptome auf einer 10-Punkte-Skala für Schmerzen, Müdigkeit und Trockenheit. Die Patienten mussten auf dem VAS-Lineal die maximale Skala angeben, die sie in den letzten drei Tagen erlebt hatten. Die Werte auf dem Lineal betrugen mindestens 3 cm mit 10 visuellen Analogskalen und zeigten Trockenheit, Schmerzen und Müdigkeit an.

Immunologische Indizes

Den Patienten wurden zwischen 6:00 und 8:00 Uhr vor der Verabreichung der ADSC-Injektion und bei jeder Nachuntersuchung venöse Blutproben entnommen. Serumproben wurden bei –20 °C transportiert und bis zur Analyse bei –80 °C in einem Gefrierschrank aufbewahrt. Immunologische Indizes, einschließlich IgA, IgG, IgM, Komplement 3 (C3), Komplement 4 (C4) und Erythrozytensedimentationsrate (ESR), wurden mit einem Durchflusszytometer (Beckman Coulter®, Fullerton, CA) analysiert.

Sicherheitsbewertungen

Zur Bewertung der Sicherheit und toxischen Wirkungen wurden zu Studienbeginn und bei den Nachuntersuchungen klinische Laborwerte, Vitalfunktionen, eine körperliche Untersuchung und eine 12-Kanal-Elektrokardiographie aufgezeichnet. Ein behandlungsbedingtes unerwünschtes Ereignis (UE) wurde als jedes unerwünschte Symptom definiert, das von der ersten Medikamentendosis bis zum Ende der Studie auftrat. Nach Einschätzung des Prüfarztes standen diese möglicherweise, wahrscheinlich oder definitiv mit der Studienmedikation in Zusammenhang.

statistische Analyse

In dieser Studie wurden Daten mit der Software SPSS v20.0 (IBM Corp, Armonk, NY, USA) statistisch analysiert und mit GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) visualisiert. Die demografischen und gesundheitlichen Statusinformationen zu Studienbeginn wurden unter Verwendung von Mittelwerten (Standardabweichung, SD) für kontinuierliche Variablen und Häufigkeiten (Prozentsätzen) für kategoriale Variablen zusammengefasst. Die Daten wurden zunächst mit dem Kolmogorov-Smirnov-Test auf Normalität untersucht. Die Daten, die Normalität erreichten, wurden mit parametrischen Methoden analysiert, während die anderen nichtparametrische Methoden verwendeten. Unterschiede in kontinuierlichen Variablen zwischen Gruppen wurden mit dem T-Test oder dem MannWhitney-U-Test getestet, während Unterschiede in kategorialen Variablen mit Chi-Quadrat-Tests oder exakten Fisher-Tests getestet wurden. In unserer Studie wurde der ungepaarte t-Test angewendet, um die immunologischen Indizes UWS, SWS, LF, ESSDAI und ESSPRI zu testen, um einen signifikanten Unterschied zwischen Ausgangswert und Follow-up zu bestimmen. Der gepaarte T-Test wurde verwendet, um signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen an jedem Datenpunkt zu analysieren. Alle gemeldeten p-Werte stammten aus zweiseitigen Tests und wurden mit einem Signifikanzniveau von 0.05 verglichen (α = 0.05).

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• Quelle: https://www.nature.com/articles/s41598-023-40802-5