شعار زيفيرنت

يكشف التحفيز الميكانيكي والمراقبة الفيزيولوجية الكهربية عند الدقة تحت الخلوية عن التحسس الميكانيكي التفاضلي للخلايا العصبية داخل الشبكات - تقنية النانو الطبيعية

التاريخ:

إعداد ثقافة الخلايا العصبية الأولية

تمت الموافقة على البروتوكولات التجريبية التي تتضمن حصاد الأنسجة الحيوانية من قبل المكتب البيطري في كانتون بازل شتات وفقًا للقوانين الفيدرالية السويسرية بشأن رعاية الحيوان وتم تنفيذها وفقًا للمبادئ التوجيهية المعتمدة. تم تعقيم رقائق HD-MEA أو الأغطية الزجاجية في 70٪ من الإيثانول لمدة 60 دقيقة وغسلها بالماء منزوع الأيونات المعقم تحت تدفق الهواء الصفحي. تمت بعد ذلك معالجة مجموعة الأقطاب الكهربائية أو الأغطية بـ 10 ميكرولتر من 0.05٪ (حجم / حجم) بولي (إيثيلينيمين) (سيجما ألدريتش) في محلول بورات (Thermo Fisher Scientific) لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وغسلها بالماء منزوع الأيونات، ثم تمت معالجتها عن طريق الحضانة مع 8 ميكرولتر من 0.02 ملغ-1 laminin (Sigma-Aldrich) في وسط neurobasal (NB) (Gibco) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تم تشريح أجنة الفئران E-18 Wistar في HBSS المثلج (Gibco) لحصاد قشورها، والتي تم فصلها بعد ذلك في 0.25٪ من التربسين – EDTA (Gibco). تم مسح الخلايا القشرية المنفصلة بلطف وتصفيتها من خلال منخل 0.45 ميكرومتر للحصول على خلايا مفردة. تم تقدير كثافة الخلايا، و10 ميكرولتر من 3,000 خلية ميكرولتر-1 تم مطلي الحل على مجموعة القطب. تم السماح للخلايا بالالتصاق بالمصفوفات عن طريق احتضان الرقائق عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة قبل إضافة 2 مل من وسط الطلاء NB. تم تحضير وسط الطلاء NB بإضافة 50 مل من مصل الحصان (HyClone) و 1.25 مل من الجلوتاماكس (Invitrogen) و 10 مل B-27 (Invitrogen) إلى 450 مل من Neurobasal (Gibco). تم حفظ رقائق HD-MEA داخل حاضنة زراعة الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربون2. بعد 3 أيام، تم استزراع الخلايا في وسط طلاء NB خالي من المصل حتى DIV 20 عن طريق تبادل 50% من وسائط الاستزراع مع وسط طلاء NB جديد مرة واحدة كل 3 أيام. جميع التجارب، باستثناء البيانات الموضحة في الشكل. 1iأجريت بين DIV 14 و 16 لأن الخلايا أظهرت خواص ميكانيكية مختلفة أثناء النمو11. تجارب البيانات الموضحة في الشكل. 1i تم جمعها بين DIV 22 و 24، عندما أظهرت الشبكات العصبية نشاط انفجار متزامن.

إعداد شريحة المخيخ

تم قطع رأس الفئران البرية (يوم ما بعد الولادة 14 C57BL/6Rj، Janvier Labs) تحت تخدير الأيزوفلورين؛ تمت إزالة أدمغتهم وغمرها في فقاعات كربوجين باردة مثلجة (95٪ O2 + 5% ثاني أكسيد الكربون2) محلول السائل النخاعي الاصطناعي (aCSF). شرائح من المخيخ السهمي ~تم الحصول على 350 ميكرومتر باستخدام الاهتزاز (VT1200S، لايكا). تم الحفاظ على جميع الشرائح في درجة حرارة الغرفة في aCSF حتى الاستخدام. يتكون aCSF من 125 ملي كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي مول كلوريد الصوديوم، 2 ملي مول كلوريد الصوديوم2و 1 mM MgCl2، 25 ملي جلوكوز، 1.25 ملي مولار NaH2PO4 و 25 ملي NaHCO3. تمت بعد ذلك معالجة مجموعة الأقطاب الكهربائية الخاصة برقائق HD-MEA بـ 10 ميكرولتر من 0.05% (حجم/حجم) بولي (إيثيلينيمين) (سيجما-ألدريش) في محلول بورات (Thermo Fisher Scientific) لمدة 40 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة وغسلها بمادة منزوعة الأيونات. الماء، تليها حضانة مع 8 ميكرولتر من 0.02 ملغ-1 laminin (Sigma-Aldrich) في وسط Neurobasal (Gibco) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تم إخراج اللامينين الزائد بعد الحضانة، وتم السماح للصفيف حتى يجف. تم بعد ذلك وضع شريحة المخيخ بلطف على مصفوفة الإلكترود باستخدام طرف ماصة مقطوع لتجنب الأضرار الناجمة عن قوى القص أثناء عملية السحب (الشكل التكميلي XNUMX). 13). تم وضع قيثارة مصنوعة خصيصًا بحجم 2 مم على شريحة الأنسجة لشل حركة شريحة الأنسجة. تم بعد ذلك غمر شرائح الأنسجة في aCSF عن طريق إضافة قطرة قطرة بلطف. تم بعد ذلك السماح لشريحة الأنسجة المجمدة المغمورة في aCSF بالالتصاق بمصفوفة القطب الكهربائي لمدة 30 دقيقة. قبل التسجيل مباشرة، تمت إزالة القيثارة، وتم تركيب رأس AFM على شريحة HD-MEA. كان perfused الأنسجة بشكل مستمر مع aCSF فقاعات كربوجين للحفاظ على بقاء الخلية والنشاط.

إعداد HD-MEA

رقائق HD-MEA المعتمدة على أشباه الموصلات من أكسيد المعدن التكميلي (CMOS) والتي تتميز بـ 26,400 قطب كهربائي (17.5 ميكرومتر) ضمن منطقة استشعار إجمالية تبلغ 3.85 × 2.10 مم2 استخدمت25. تم تصنيع الرقائق في مسبك تجاري وتم معالجتها وتعبئتها في المنزل (الشكل التكميلي 1). 1b). تم لصق حلقات البولي كربونات الشفافة (GB Plex) التي يبلغ قطرها 4 سم على الرقائق، وتم تغليف روابط الأسلاك بإيبوكسي داكن متوافق حيويًا (EPO-TEK 353 ND). تم ترسيب الطلاء البلاتيني الأسود للأقطاب الكهربائية لتقليل مقاومة القطب وتحسين خصائص الإشارة إلى الضوضاء (الشكل التكميلي SXNUMX). 1c). يمكن شراء الإصدارات التجارية لنظام HD-MEA المطور خصيصًا (نموذج MaxOne) من MaxWell Biosystems.

حامل العينة وسخان المسرح

تم التحكم في سخان العينة المعتمد على بلتيير الكهروحراري، مع مسبار درجة الحرارة لردود الفعل ذات الحلقة المغلقة، بواسطة وحدة تحكم في درجة الحرارة مدمجة في المنزل للحفاظ على العينة عند 37 درجة مئوية. تمت محاذاة سخان العينة مع وسادة التوصيل الحراري الموجودة على شريحة HD-MEA. تم بعد ذلك تركيب الرقائق على حامل العينة وتثبيتها في موضعها باستخدام دبوس الحامل المحمّل بنابض. تم استخدام Prusa I3 MK3S + للطباعة ثلاثية الأبعاد لحاملي الحقنة المقتصدة لإعداد التروية التي تم إرفاقها بحامل العينة. تم تركيب الإعداد بأكمله على حسب الطلب x,y مرحلة بيزو عبر لوحة القاعدة.

x,y مرحلة بيزو

تم ربط مرحلتين بيزو خطيتين (سلسلة Xeryon XLS-1) بدقة تشفير تبلغ 5 نانومتر مع بعضها البعض بشكل عمودي (الشكل التكميلي SXNUMX). 1a). تم التحكم في المراحل الخطية بواسطة وحدة تحكم متعددة المحاور Xeryon XD-M متصلة بواجهة مستخدم تعتمد على LabVIEW. تم تسجيل القطب الأيسر العلوي لشريحة HD-MEA كأصل نظام الإحداثيات، وتم استخراج إحداثيات القطب مع الخلايا العصبية محل الاهتمام من واجهة مستخدم MaxWell Biosystems. تم بعد ذلك تغذية هذه الإحداثيات إلى وحدة التحكم XD-M باستخدام نصوص برمجية مخصصة لتسهيل تحديد موضع الخلايا العصبية تحت ناتئ AFM.

العمل المجهري لمسافة طويلة مضان

تمت محاذاة المجهر الضوئي (Nikon SMZ 25) مع عدسات تكبير قابلة للتعديل مقاس 15.75 × وهدف 1 × (Nikon، MNH55100 P2-SHR PlanApo 1X؛ الفتحة الرقمية، 0.156) مع الإعداد كما هو مذكور في النص الرئيسي. إضاءة الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) التي يمكن التحكم فيها بواسطة TTL (CoolLED PE 300فائقة) تم استخدامه كمصدر للضوء للتصوير الخالي من مرشح الإثارة / الانبعاثات. تم استخدام مقسم شعاع تمرير النطاق الثلاثي (F66-412، AHF Analysentechnik) لتصفية ضوء الإثارة المنعكس من شريحة HD-MEA. كاميرا بمصفوفة CMOS كبيرة (Nikon DS-QI2) بدقة 4,908 × 3,264 بكسل (حجم البكسل، 7.3 × 7.3 ميكرومتر)2) تم تركيبه على المجهر باستخدام عدسة بروجيكتور مثبتة على f مقاس 2.5 × مما يسمح بأخذ عينات تصل إلى 45 إطارًا في الثانية مع التكبير النهائي بمقدار ~40× ودقة 0.46 ميكرومتر لكل بكسل.

AFM

تم تركيب رأس AFM (Catalyst، Bruker) ومواءمته مع الإعداد كما هو مذكور في النص الرئيسي. تم استخدام ماسح ضوئي بيزو 15 ميكرومتر على الرأس لجمع كل منحنيات القوة والإزاحة والقوة والوقت، في حين تم استخدام بيزو 150 ميكرومتر لوضع الكابولي على الخلية العصبية. تم جمع البيانات وتصديرها إلى ملفات .txt باستخدام برنامج AFM (Nanscope v.9.2، Bruker). تم تحليل البيانات ورسمها باستخدام نصوص بايثون. تم لصق حبات السيليكا التي يبلغ قطرها 5 ميكرومتر (Kisker Biotech) على الطرف الحر من الميكروكانتيليفرز (CSC-37 أو 38، Micromash HQ) باستخدام الغراء فوق البنفسجي (Dymax) وتم علاجها بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 دقيقة. تم تنظيف الكابولي المطرز لمدة 5 دقائق باستخدام منظف البلازما (Harrick Plasma)، ثم تم تركيبه على حامل مسبار السائل مع نافذة ياقوتية مقاس 2 مم، وتم معايرته باستخدام طريقة الضوضاء الحرارية48.

الارتباط AFM، HD-MEA والمجهر الضوئي

تمت محاذاة AFM وHD-MEA والمجهر الضوئي كما هو موضح (الشكل 1 أ). 1a). تم جمع ضوء الإسفار من الخلايا العصبية على رقائق HD-MEA من خلال نافذة الياقوت في حامل الكابولي AFM وتمريره إلى المجهر الضوئي. تم جمع صورة مضان الخلايا العصبية الموجودة على شريحة HD-MEA بشكل تسلسلي في المناطق ذات الاهتمام، وتم خياطتها وتسجيلها على واجهة مستخدم Maxwell MEA لتوطين الخلايا العصبية على شريحة HD-MEA (الشكل التكميلي S1). 2 أ - د). ال x,y ثم تم تغذية إحداثيات الخلايا العصبية ذات الاهتمام إلى x,y المرحلة عبر البرامج النصية LabVIEW، وبالتالي وضع ناتئ AFM في المواضع المطلوبة مع ~دقة 5 نانومتر. تم تركيب المجموعة بأكملها على طاولة معزولة للتخميد ووضعها في غرفة محمية من الضوضاء ويتم التحكم في درجة حرارتها لتقليل الضوضاء الميكانيكية والانجراف الحراري.

مزامنة TTL

تم استخراج نبضات TTL من DS-Qi2 باستخدام موصل محلي الصنع مزود بدبوس رباعي الأقطاب مقاس 3.5 بوصة وقابس صغير على جانب واحد ووصلة توصيل أنثى 24 AWG (RND 255-00015، Distrelec) على الجانب الآخر. كان الدبوس 1 هو الأرض واستقبل الدبوس 4 (EXP_TMG) 2.4 فولت على مستوى HI (مرتفع) عند التشغيل المباشر وفقًا لوقت التعرض المحدد. تم استخراج نبض سلبي قدره 0-5 فولت من قناة إخراج اللوحة الأمامية 1 لوحدة تحكم AFM (Bruker Nanscope V) من خلال موصل محلي الصنع مزود بدبوس ذكر BNC قياسي على جانب واحد ووصلة أنثى 24 AWG (RND 255) -00015, Distrelec) على الجانب الآخر. تم بعد ذلك توجيه الإشارات، المستخرجة من كل من الكاميرا وAFM، إلى الدبوس 2 و8 من جهاز optocoupler واحد عالي السرعة. تم بعد ذلك إرسال الإشارات إلى نظام الحصول على البيانات HD-MEA عبر مصفوفة بوابة قابلة للبرمجة ميدانيًا، مما يوفر طوابع زمنية دقيقة للأحداث التي اكتشفها AFM والمجهر الضوئي على تسجيلات الملفات الأولية لبيانات HD-MEA المجمعة عند 20 كيلو هرتز.

بروتوكول وقياسات تتبع الصلابة

تم حساب معامل يونغ الظاهر من متوسط ​​خمسة منحنيات قوة-إزاحة تم جمعها على السوما العصبي. انتظرنا بعد ذلك لمدة 30 ثانية للتأكد من عدم وجود تغييرات ميكانيكية ناجمة عن القياس في الخلايا العصبية وجمعنا خمسة منحنيات إزاحة القوة مرة أخرى (الشكل XNUMX أ). 2a) ، والتي وصفناها بدورة قياس واحدة والتي يتم تمثيلها بنقطة واحدة (الشكل 1 أ). 2b). كررنا دورة القياس هذه لمدة تصل إلى 5 دقائق على الخلية العصبية وانتقلنا إلى الخلية العصبية التالية في الشبكة. وبعد ستين دقيقة من القياس الأول للخلية العصبية الأولى، عدنا إلى نفس الخلية العصبية، وتم تكرار دورة القياس. تتألف القياسات من دورة تتبع طويلة المدى. تكررت دورة التتبع طويلة المدى هذه ثلاث مرات (الشكل XNUMX أ). 2c). بالنسبة لقياسات صلابة الخلايا العصبية، سجلنا أولاً النشاط الفيزيولوجي الكهربي للخلايا العصبية لمدة 5 دقائق ثم حددنا اثنين من الخلايا العصبية المعزولة جيدًا لكل خلية عصبية وقمنا بتجميع منحنيات إزاحة القوة عليها. تم جمع منحنيات القوة والإزاحة باستخدام microcantilevers CSC-38 (ثابت الزنبرك الاسمي، ~0.02 ن م-1) تتميز بحبات قطرها 5 ميكرومتر كما هو مذكور أعلاه. تم استخدام قوة قصوى تبلغ 700 نيوتن متر على السوما و 400 نيوتن متر على الخلايا العصبية لجمع منحنيات القوة والمسافة (الشكل التكميلي SXNUMX). 14 أ ، ب). بالنسبة لجميع القياسات، ظلت سرعة الطرف ثابتة عند 10 ميكرومتر في الثانية-1. تم تحديد نقطة الاتصال من منحنى قوة الإقتراب والإزاحة مثل x اعتراض بقيمة القوة، والتي كانت أعلى بخمس مرات من الانحراف المعياري للضوضاء الأساسية، تليها التنظيم اليدوي. تم حساب عمق المسافة البادئة كقيمة الإزاحة عند نقطة الاتصال بعد طرح انحراف الكابولي وتعيين قيمة الإزاحة عند القوة القصوى إلى الصفر في منحنى إزاحة القوة (الشكل التكميلي 1). 14c). يختلف عمق المسافة البادئة لنفس القوة القصوى من سوما إلى سوما اعتمادًا على صلابتها. ولذلك، قمنا بتعيين قطع عمق المسافة البادئة من 750 نانومتر. في منحنيات القوة والإزاحة، تم تجاهل جميع قيم القوة التي تجاوزت قيمة الإزاحة المقابلة لها عمق المسافة البادئة. تم حساب معامل يونغ الظاهر من هذه المنحنيات التي يستخدمها نموذج هيرتز لإيندينتر كروي مع نصف مساحة مرنة49 تم تركيبه باستخدام رموز مخصصة في بايثون.

قيم معامل يونغ المقاسة في دراستنا لسوما الخلايا العصبية تقع في نطاق مماثل مع التقارير السابقة10,11. ومع ذلك، فإن معامل يونج للخلايا العصبية أقل من القيم المبلغ عنها، في حين أنها لا تزال على مستوى مماثل من حيث الحجم. قد ينجم هذا التحيز عن اختيارنا لقياس اثنين من الخلايا العصبية القاعدية الأكثر سمكًا في الخلية العصبية، والتي عادة ما تكون أكثر ليونة. لقياس صلابة الخلايا العصبية أثناء الاندفاع والـ IBIs، قمنا بجمع منحنيات القوة والإزاحة على تردد 5 هرتز. تم تكرار هذه العملية عدة مرات لكل سوما، وتم حساب متوسط ​​صلابة السوما أثناء فترات الانفجار وأثناء IBIs. بينما تظهر الدفقات عادةً بنمط إيقاعي (الشكل XNUMX). 2h) ، من الصعب التنبؤ بالخلايا العصبية المستنبتة عندما تتعرض خلية عصبية واحدة للانفجار. لجمع منحنيين على الأقل لإزاحة القوة خلال فترات الانفجار أو IBIs، مع تقليل عدد المرات التي يتلامس فيها المسبار مع الخلية العصبية، قمنا بوضع مسافة بادئة للخلية العصبية 5 مرات-1.

بروتوكول الضغط الثابت

حبة قطرها 5 ميكرومتر، ملتصقة بوحدة AFM الدقيقة بدون أطراف (CSC-37؛ ثابت الزنبرك الاسمي، ~0.8 ن م-1)، تم وضعه فوق السوما. تم إنزال الخرزة على السوما حتى تم الوصول إلى قوة الضبط المطلوبة لتطبيق 0.1 كيلو باسكال أو 5 كيلو باسكال وظلت على اتصال لمدة 60 ثانية باستخدام ردود الفعل ذات الارتفاع الثابت قبل سحب الخرزة (الشكل XNUMX أ). 5b). يُظهر منحنى القوة والوقت المسجل بمعدل أخذ عينات قدره 500 كيلو هرتز كلاً من الإزاحة الرأسية لرأس AFM واستجابة قوة السوما. كان متوسط ​​ارتفاع سوما الخلايا العصبية القشرية الفئران ~8 ميكرون (الشكل التكميلي XNUMX). 11a).

تصوير الكالسيوم الوظيفي

تم التعبير عن أجهزة استشعار الكالسيوم المشفرة وراثيا في الخلايا العصبية باستخدام الفيروسات المرتبطة بالغدد (AAVs). AAV1-EF1a-GCaMP6s (1.8 × 1013 الجينومات الفيروسية مل-1) تم استخدامها في عدد كبير من الإصابات 5.0 × 104 للتعبير عن GCaMP6s. أصيبت الخلايا العصبية في DIV 3؛ عادة ما يتم رؤية التعبير في DIV 5-9.

تحليل تصوير الكالسيوم الوظيفي للخلايا العصبية المحفزة ميكانيكيا

متوسط ​​منحنى كثافة مضان ΔI/I تم حساب منحنى GCaMP6s كإشارة متوسطة على الصورة بأكملها بالنسبة إلى خط الأساس للصورة. تم إجراء اكتشاف الذروة في الإشارة من خلال إيجاد الحد الأقصى المحلي ضمن نافذة مدتها 3 ثوانٍ. تم وضع علامة على الحدث باعتباره بداية استجابة الخلايا العصبية عندما وصل اتساع إشارة الكالسيوم إلى 10% من قيمة الذروة. البيانات من 2.5 ثانية قبل و10 ثوانٍ بعد بداية ذروة الاستجابة (t = 0) تم رسمها.

تسجيلات HD-MEA

تم استخدام واجهة مستخدم MaxWell Biosystem (MaxLab Live v.22.13) لتسجيل البيانات. تم تسجيل صورة مضان الشريحة الكاملة على واجهة المستخدم (الشكل التكميلي SXNUMX). 2c). تم التعرف على الخلايا العصبية ذات الاهتمام من طفرات الكالسيوم، وتم الحصول على نشاط الارتفاع (إمكانات العمل) من المؤامرات النقطية الحية على واجهة المستخدم. وبمجرد تحديد الخلية العصبية محل الاهتمام، تم توجيه 512 قطبًا كهربائيًا حول هذه الخلية العصبية في شكل مستطيل إلى القراءة. بعد وضع ناتئ AFM على الخلايا العصبية، تمت إزاحة القنوات خمس مرات لتعويض الضوضاء الصادرة عن ليزر الأشعة تحت الحمراء الذي يستخدمه AFM للكشف عن انحراف الكابولي قبل بدء التسجيل. تم استخدام كسب قدره 512 ومرشح تمرير عالي مع قطع عند 300 هرتز لجميع التسجيلات. لتحسين أداء خوارزميات الفرز السنبلي في الشكل XNUMX. 5تم تسجيل إمكانات عمل الخلايا العصبية لمدة 2.5 دقيقة قبل وبعد التحفيز الميكانيكي.

تحليل بيانات HD-MEA

تمت معالجة جميع بيانات HD-MEA المجمعة عبر نصوص برمجية مخصصة تعتمد على Spikeinterface50. باختصار، تمت تصفية التسجيلات خارج الخلية وفرزها باستخدام Kilosort2، متبوعة بالتنظيم اليدوي لجميع التسجيلات. تم استخدام عتبة انتهاك الفاصل الزمني المحافظ البالغة 0.5 وعتبة نسبة الإشارة إلى الضوضاء البالغة 5.0 للتنظيم. تم استخدام تشابه القالب، والارتباطات التلقائية، والارتباطات المتبادلة لتقييم جودة الوحدة. تم استخراج ميزات Waveform مثل نصف العرض ومنحدر إعادة الاستقطاب للوحدات ذات الترتيب المرتفع للعصور المعنية باستخدام نصوص Python باستخدام وظائف من Spikeinterface (الشكل التكميلي XNUMX). 12 أ - ط). تم الحصول على التغييرات النسبية في ميزات الشكل الموجي على جميع الأقطاب الكهربائية داخل البصمة خارج الخلية للخلية العصبية عن طريق قسمة قيمة ميزة الشكل الموجي المتوسط ​​لجميع المسامير أثناء الضغط الميكانيكي على ميزة الشكل الموجي المتوسط ​​لجميع المسامير قبل الضغط. تم حساب متوسط ​​معدل إطلاق النار والفاصل الزمني بين الارتفاعات من قطارات السنبلة المستخرجة باستخدام مجموعة أدوات تحليل الفيزيولوجيا الكهربية للفيل 0.11.251. تم حساب متوسط ​​معدلات إطلاق النار لبيانات ارتباط الصلابة عن طريق وضع المسامير في صناديق 30 ثانية لتتناسب مع النقاط الزمنية لقيم الصلابة. تم حساب متوسط ​​معدلات إطلاق النار لبروتوكول الضغط عن طريق وضع المسامير في ثلاث صناديق قبل وأثناء وبعد الضغط.

الجمع بين AFM والمجهر متحد البؤر

تم إجراء تصوير متحد البؤر بفاصل زمني على مجهر متحد البؤر مقلوب للمسح بالليزر (Observer Z1، LSM 700؛ Zeiss) مزود بهدف غمر بالماء 25 × / 0.8 LCI PlanApo (Zeiss). تم تركيب AFM (CellHesion 200؛ JPK Instruments) على المجهر متحد البؤر. تم تنفيذ بروتوكولات الضغط الميكانيكية باستخدام برنامج JPK CellHesion. من أجل التحفيز الميكانيكي، تم استخدام AFM للاقتراب من الكابولي بالخرز على الخلية بسرعات 0.1 أو 1 أو 10 أو 100 ميكرومتر في الثانية.-1 حتى الوصول إلى قوة نقطة الضبط، وبعد ذلك، يتراجع على الفور بنفس السرعة المستخدمة في الاقتراب. بالنسبة للتجارب التي تحدد قوة العتبة لتحفيز الخلايا العصبية ميكانيكيًا، تمت زيادة قوة نقطة الضبط المطبقة تدريجيًا من 50 إلى 400 نانومتر بزيادات قدرها 50 نانومتر وفترات زمنية قدرها 20 ثانية (الشكل التكميلي SXNUMX). 6). تمت زيادة قوة نقطة الضبط للخرزة التي تقترب بشكل تدريجي حتى تم تسجيل الاستجابة العصبية. بعد التحفيز الناجح للخلايا العصبية، تم سحب الكابولي، وتم اختيار خلية عصبية جديدة للتحفيز.

تحليل احصائي

تم اختبار جميع البيانات التي تظهر خصائص الشكل الموجي للتأكد من صحتها باستخدام اختبار شابيرو ويلك Q-Q المؤامرات. لم يتم توزيع جميع مجموعات البيانات بشكل طبيعي وكانت مجموعات بيانات تابعة. ولذلك، قمنا باستخدام اختبار رتبة موقعة ويلكوكسون. كانت الفرضية الصفرية هي أنه لا يوجد فرق في المتوسطات بين التوزيعات المقارنة الزوجية. P القيم > 0.05 اعتبرت غير هامة. تم استخراج ميزات الشكل الموجي من الشكل الموجي المتوسط ​​لكل خلية عصبية تم الحصول عليها منها n > 5,000 المسامير. تمت مقارنة جميع البيانات التي توضح معدلات إطلاق النار المتوسطة مع اختبار رتبة موقعة ويلكوكسون من n > 10,000 شوكة. وتمت مقارنة مجموعات بيانات AFM باستخدام مان ويتني ثنائي الذيل Uالاختبار. P تم ذكر القيم لكل مقارنة في وسائل إيضاح الشكل. تم استخدام ارتباط بيرسون لتحديد الارتباطات الخطية في الصلابة ومتوسط ​​قيم معدل إطلاق النار. لم يتم استخدام أي طرق إحصائية لتحديد أحجام العينات مسبقًا. لم يتم إجراء جمع البيانات وتحليلها بشكل أعمى لظروف التجارب.

ملخص التقارير

مزيد من المعلومات حول تصميم البحوث متاح في ملخص تقارير حافظة الطبيعة مرتبطة بهذه المادة.

بقعة_صورة

أحدث المعلومات الاستخباراتية

بقعة_صورة

الدردشة معنا

أهلاً! كيف يمكنني مساعدك؟