زراعة الخلايا

خطوط الماوس ESC (Rex1GFP-d2 وE14IVc¹³⁷) تم تربيتها في ظروف خالية من التغذية [مغلفة بالبلاستيك بنسبة 0.2٪ جيلاتين (Sigma، cat. G1890)] ويتم إعادة زراعتها كل 3-4 أيام بنسبة تقسيم تبلغ 1:10 بعد التفكك مع Accutase (GE Healthcare، cat. L11-007) ) أو 0.25% التربسين (تقنيات الحياة). تم استزراع الخلايا في وسط خالٍ من المصل يعتمد على N2B27 [DMEM/F12 وNeurobasal بنسبة 1:1، 0.1 مم β-ميركابتوإيثانول، 2 ملي مولار L-جلوتامين، 1:200 N2 و1:100 B27 (جميع الكواشف من Life Technologies). )] أو وسط KSR يحتوي على المصل [GMEM (Sigma، cat. G5154) مكمل بـ 10٪ KSR (Life Technologies)، 2٪ FBS (Sigma، cat. F7524)، 100 ملي مولار مركابتوإيثانول (Sigma، cat. M7522) ، 1 × أحماض أمينية غير أساسية MEM (Invitrogen، قطة 1140-036)، 2 ملي مولار L- جلوتامين، 1 ملم بيروفات صوديوم (كلاهما من Invitrogen)]، مكمل بمثبطين جزيء صغير (2i) PD (PD0325901، 1 ميكرومتر)، CH (CHIR99021، 3 ميكرومتر) من Axon (القطتين 1386 و1408) وLIF (100 وحدة/مل تم شراؤها من Qkine - Cambridge UK).

تم الحفاظ على iPSCs البشرية CS09iHD-109n5 (المشار إليها هنا باسم iPSC_Q109) وCS14iCTR-21n3 (المشار إليها هنا باسم iPSC_Q21) التي تم شراؤها من مركز Cedars-Sinai Biomanufacturing Center (لوس أنجلوس، كاليفورنيا)، على Matrigel المطلي مسبقًا بنسبة 0.5٪ (CORNING، قطة 356231). ) لوحات في وسط E8 مصنوعة في المنزل (وفقًا لتشن وآخرين، 2011¹³⁸) أو في mTeSR (StemCell Technologies، القط. 05850) عند 37 درجة مئوية، 5٪ O²، 5٪ CO². تم فصل iPSCs البشرية في كتل بـ 0.5 مم EDTA (Gibco، قطة AM99260G) وتم استبدالها بتخفيف 1: 6 كل 3-4 أيام باستخدام مثبط ROCK 10 ميكرومتر (Y27632-ثنائي هيدروكلوريد Axon Medchem، قطة 1683) لمدة 24 ساعة. تم تغيير المتوسطة كل يوم. وكانت جميع خطوط الخلايا سلبية الميكوبلازما.

التنميط الجيني لـ iPSC_Q21 وiPSC_Q109

تم عزل الحمض النووي الجيني من iPSC_Q21 وiPSC_Q109 باستخدام مجموعة DNeasy Blood and Tissue (Qiagen، cat. 69504) باتباع إرشادات الشركة المصنعة وتم قياسها بواسطة Nanodrop ND-1000. تم إجراء PCR باستخدام الاشعال المدرجة في الجدول التكميلي 1 ووصفها في مانجياريني وآخرون.²⁹، مصمم لتضخيم قناة polyQ في HTT exon 1. للحصول على تفاعل 25 ميكرولتر، استخدمنا 200 نانوغرام من الحمض النووي الجينومي، و0.25 ميكرولتر من Taq Phusion High fidelity (ThermoFisher، cat. F-530L)، 2.5 ميكرولتر من Buffer GC 5x + MgCl² (7.5 ملم)، 2 ميكرولتر من dNTPs (10 ملم) و 1.25 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO، 100٪). بعد 3 دقائق عند 94 درجة مئوية، أجرينا 35 دورة: 94 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، 1 درجة مئوية لمدة 63 ثانية، 45 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، تليها استطالة نهائية عند 72 درجة مئوية لمدة 1 دقائق. تم إجراء الرحلان الكهربي للهلام على هلام الاغاروز بنسبة 70%، مع تحميل 7 ميكروليتر من منتجات PCR باستخدام Purple Loading Dye 2.5x (NEB، cat. B20S). تم استخدام β-Actin كعنصر تحكم في التحميل. تم الحصول على النتائج رقميًا بواسطة VWR Imager CHEMI Premium.

توليد خطوط ESC معبرة عن HTT

تم إنشاء خلايا Q15 وQ128 عن طريق ترنسفكأيشن الحمض النووي للناقلات التي تحتوي على الطرف N لجين هنتنغتين البشري، مع تكرار 128 أو 15 CAG على التوالي (بإذن من البروفيسور إيلينا كاتانيو). تم إجراء الخطية بين عشية وضحاها من الحمض النووي البلازميد مع إنزيم التقييد PvuI. بالنسبة لترنسفكأيشن الحمض النووي، استخدمنا Lipofectamine 2000 (Life Technologies، cat. 11668-019) وقمنا بإجراء ترنسفكأيشن عكسي. بالنسبة لبئر واحد من لوحة مكونة من 6 بئر، استخدمنا 6 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن، و2 ميكروغرام من DNA البلازميد و300,000 خلية في 2 مل من الوسط. تم تغيير الوسيط بعد الحضانة طوال الليل. بدأ اختيار المضادات الحيوية (بوروميسين 1 ميكروغرام / مل) بعد 24 ساعة من ترنسفكأيشن.

توليد المجالس الاقتصادية والاجتماعية الخاصة بالماوس والتي تعبر بشكل ثابت عن الجينات محل الاهتمام

تم إنشاء الخلايا الجذعية السرطانية المستقرة المعدلة وراثيا التي تعبر عن المرشحين عن طريق نقل الخلايا المعبرة عن HTT باستخدام بلازميدات ناقلة PB (1 ميكروغرام من CAG-Mtf1 و CAG-Kdm2b و CAG-Kdm5b و CAG-Fbxo34) ، تم شراؤها من VectorBuilder (VectorBuilder Inc، Chicago، IL، الولايات المتحدة الأمريكية) ، مع ناقل التعبير PB transposase pBase (1 ميكروغرام). استخدمنا Lipofectamine 2000 وقمنا بإجراء ترنسفكأيشن عكسي كما هو موضح لتوليد خطوط HD. بدأ اختيار المضادات الحيوية (Hygromycin B، 150 ميكروغرام / مل؛ Invitrogen، قطة 10687010) بعد 24 ساعة من ترنسفكأيشن.

تمايز الشخصيات غير القابلة للعب

تم تمييز iPSC_Q21 وiPSC_Q109 إلى شخصيات غير قابلة للعب وفقًا لـ Li et al., 2011⁹² بروتوكول. تم فصل iPSCs عند التقاء 80٪ في خلايا مفردة باستخدام Accutase (Gibco، cat. A1110-501) ومطلي بـ 45,000 خلية / سم² في وسط E8 مع مثبط ROCK 10 ميكرومتر. بعد يوم واحد، تم استبدال الوسيط E1 بوسيط الحث N8B2 المكون من DMEM/F27 المتقدم (Gibco، القطة 12-12634): Neurobasal (Gibco، القطة 010-21103) (نسبة 049:1)، BSA 1 مجم/مل (جيبكو، قطة 50-15260)، جلوتاماكس 037% (جيبكو، قطة 1-35050)، بنسلين/ستربتوميسين 038% (جيبكو، قطة 1)، ملحق N15140122 2:1 (جيبكو، قطة 200-17502) ، ملحق B048 27: 1 (جيبكو، قطة 100-17504)، مكمل بجزيئات صغيرة بشرية LIF 044 نانوجرام/مل (Qkine، قطة Qk10)، SB036 431542 ميكرومتر (Axon Medchem، قطة 2)، CHIR1661 99021 ميكرومتر ( أكسون ميدتشيم، قطة 3)، مركب E 1386 ميكرومتر (سيجما ألدريش، قطة 0.1-209986-17). تم تغيير وسيط الحث N4B2 يوميًا لمدة 27 أيام. في اليوم السابع، تم تقسيم الشخصيات غير القابلة للعب عند التخفيف بنسبة 7:7 في وسط الصيانة N1B6 الذي يتكون من DMEM/F2 المتقدم (Gibco، قطة 27-12): Neurobasal (جيبكو، قطة 12634-010) (نسبة 21103:049) ، BSA 1 ملغم / مل (جيبكو، قطة 1-50)، جلوتاماكس 15260% (جيبكو، قطة 037-1)، بنسلين/ستربتوميسين 35050% (جيبكو، قطة 038)، ملحق N1 15140122:2 (جيبكو، قطة 1-200)، ملحق B17502 048:27 (جيبكو، قطة 1-100)، مكمل بجزيئات صغيرة بشرية LIF 17504 نانوغرام/مل (Qkine، قطة Qk044)، SB10 036 ميكرومتر (Axon Medchem، قطة 431542) ) ، CHIR2 1661 ميكرومتر (Axon Medchem، cat. 99021)، مكمل بـ EGF 3 ng / mL (R&D، cat. 1386-EG) و FGF20 236 ng / mL (Qkine، cat. Qk2، الزرد المؤتلف FGF20). تم الحفاظ على الشخصيات غير القابلة للعب لمدة 002 مقاطع. تم جمع بيانات مورفولوجيا h-iPSCs و NPCs رقميًا باستخدام المجهر Zeiss Axio Vert A2 FL-LED.

توليد الشخصيات غير القابلة للعب التي تعبر بشكل عابر عن الجينات محل الاهتمام

بالنسبة لترنسفكأيشن الحمض النووي ، تم فصل 250,000 من الخلايا غير القابلة للعب كخلايا مفردة باستخدام Accutase (Gibco، cat. A1110-501) وتم نقلها باستخدام بنيات PB (1 ميكروغرام) باستخدام FuGENE HD Transfection (Promega، cat. E2311)، باتباع بروتوكول ترنسفكأيشن العكسي . بالنسبة لبئر واحد من لوحة مكونة من 12 بئرًا، استخدمنا 3.9 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن، و1 ميكروغرام من DNA البلازميد و250,000 خلية في 1 مل من وسط صيانة N2B27 مع 10 ميكرومتر Y27632 [ROCKi، مثبط كيناز (ROCK) المرتبط بـ Rho، أكسون ميدتشيم القط. 1683]. تم تغيير الوسيط بعد الحضانة طوال الليل. بعد 48 ساعة من ترنسفكأيشن، عولجت الخلايا بالروتينون 30 ميكرومتر لمدة 24 ساعة ثم تم تحليلها كما هو مبين في الشكل XNUMX. 8f.

فحص الانتشار

تم تكييف الماوس ESCs لممر واحد في وسط KSR + 2iL في وجود Puromycin 6 ميكروغرام / مل. تم تقييم انتشار المجالس الاقتصادية والاجتماعية عن طريق طلاء 15,000 خلية في لوحة 24 بئر (7,500 خلية / سم²) في وسط KSR + 2iL في وجود بوروميسين 6 ميكروغرام / مل. تم فصل الخلايا بنسبة 0.25٪ من التربسين (تقنيات الحياة) وتم حسابها كل 24 ساعة لمدة 4 أيام.

تم قياس تكاثر iPSCs عن طريق طلاء 40,000 خلية مفردة على 0.5٪ Matrigel (CORNING، cat. 356231) 12 لوحة جيدًا (11,428 خلية / سم XNUMX)²) في وسط E8 مع مثبط ROCK 10 ميكرومتر (Y27632-ثنائي هيدروكلوريد، Axon Medchem، قطة 1683) لمدة 24 ساعة. تم تغيير المتوسطة كل يوم. تم فصل الخلايا مع Accutase (GE Healthcare، cat. L11-007) وتم حسابها كل 24 ساعة لمدة 4 أيام.

تم قياس تكاثر NPCs عن طريق طلاء 100,000 خلية على 0.5٪ Matrigel (CORNING، cat. 356231) 12 لوحة جيدًا (28,571 خلية / سم XNUMX)²) في وسط صيانة N2B27 مع مثبط ROCK 10 ميكرومتر (Y27632-ثنائي هيدروكلوريد Axon Medchem، قطة 1683) لمدة 24 ساعة. تم فصل الخلايا مع Accutase (GE Healthcare، cat. L11-007) وتم حسابها كل 24 ساعة لمدة 4 أيام.

علاج الضغوطات وتلطيخ البنفسج الكريستالي (CV).

للتجارب في التين. 2b، تم طلاء 5,000 فأرة ESCs في لوحة مكونة من 24 بئرًا (2,500 خلية / سم²) في وسط KSR + 2iL في وجود مثبطات (و Puromycin 6 ميكروغرام / مل) لمدة 48 ساعة وسجل عن طريق القياس الكمي لعدد الخلايا الباقية عن طريق تلطيخ السيرة الذاتية [محلول السيرة الذاتية: 0.05٪ وزن / حجم Crystal Violet (Sigma) ، 1٪ من محلول الفورمالديهايد 37٪ (سيجما)، 1٪ ميثانول، 10٪ PBS] وتم إجراء تقدير كمي لمتوسط ​​الكثافة باستخدام برنامج فيجي (الإصدار 2.0.0).

بالنسبة إلى طفرات PB تليها علاجات الضغط، كانت الخلايا مطلية بكثافة 2,500 خلية / سم² في بوروميسين 6 ميكروغرام / مل وتم اختياره لمدة 5 أيام بحضور MG132 (Sigma-Aldrich، cat. C2211) أو Tamoxifen (Sigma-Aldrich، cat. T2859).

للتجارب في الشكل. 4g، تم طلاء 5,000 خلية في صفيحة 24 بئرًا في وسط KSR + 2iL مع بوروميسين 3 ميكروغرام / مل. تمت إضافة الضغوطات (MG132 12.5 نانومتر أو تاموكسيفين 13.4 ميكرومتر) بعد 12 ساعة. تم إجراء تسجيل الخلايا الباقية كما هو موضح أعلاه.

للتجارب في الشكل التكميلي. 4d، تم طلاء 2,500 خلية في طبق مكون من 48 بئرًا في وسط KSR + 2iL. الضغوطات [روتينون (سيجما ألدريتش، قطة. R8875)، كومين (سيجما ألدريتش، قطة. 247502)، 5-أزاسيتيدين (سيجما ألدريتش، قطة. A1287)، MG132 (سيجما ألدريتش، قطة. C2211)، بافيلوميسين ( تمت إضافة Sigma-Aldrich، cat. B1793)، Staurosporine (Sigma-Aldrich، cat. S6942)، Tamoxifen (Sigma-Aldrich، cat. T2859)] بعد 12 ساعة عند التركيزات المشار إليها. بعد 48 ساعة، كانت الخلايا الباقية ملطخة بمحلول السيرة الذاتية، وتم إجراء تسجيل الخلايا الباقية كما هو موضح أعلاه.

Electroporation لل نظام PB في المجالس الاقتصادية والاجتماعية

تم إجراء الطفرات بوساطة PB بواسطة Electroporation للفحص على نطاق الجينوم. تتكامل نواقل PB بشكل ثابت في الجينوم بعد الإدراج العشوائي في مواقع TTAA. تم استخدام ناقل PB pGG134 (كما هو موضح في الشكل XNUMX). 2a) تم تحسينه لشاشات اكتساب الوظيفة⁵⁴: يتكون من محسّن/مروج MSCV متبوعًا بموقع مانحة لصق من exon 1 of فوكسف2 الجين، الذي يسمح بالإفراط في تنشيط الجينات القريبة. يحتوي PB 5'-ITR أيضًا على نشاط مروج اتجاهي ضعيف، أي أن هذا البناء يمكنه تنشيط الجينات في أي اتجاه. يحتوي المتجه أيضًا على شريط ثانٍ، بما في ذلك المروج التأسيسي متبوعًا بجينات مقاومة DsRed وHygromycin، والتي تم استخدامها لتحديد الخلايا ذات تكامل المتجهات المستقر.

لقد قمنا بتحسين الظروف من أجل تحقيق عدد قليل من أحداث التكامل، عن طريق ضبط نسبة ناقل PB مقابل transposase pBase. بالنسبة لإجراء الفحص، تم إجراء الطفرات باستخدام الكمية الأمثل البالغة 0.5 ميكروغرام pGG134 و20 ميكروغرام pBase.

للكهرباء واحدة، 10⁷ تم خلط الخلايا و20.5 ميكروغرام من الحمض النووي ووضعها في كفيت كهربائي (Biorad Gene Pulser Cuvette، قطة 165-2088). تم إلكتروبورات الخلايا عن طريق وضع الكوفيت في حامل Electroporation لل Biorad GenePulser (القط 165-2076). الإعدادات المستخدمة: 250 فولت، 500 ميكرو فهرنهايت، يجب أن يكون ثابت الوقت بين 5.6 و7.5. تم انتشال الخلايا Electroporated بلطف من الترعة ومطلي. بدأ اختيار المضادات الحيوية بعد 24 ساعة من التثقيب الكهربائي.

استخراج الحمض النووي الجينومي وSplinkerette-PCR

تم حصاد الخلايا واحتضانها طوال الليل عند 56 درجة مئوية مع محلول تحلل [10 مللي مولار Tris-HCl، درجة الحموضة 7.5؛ 10 ملم يدتا؛ 10 ملي مول كلوريد الصوديوم؛ 0.5% وزن/حجم ساركوسيل، مكمل ببروتيناز K (سيجما، قطة. P2308) إلى تركيز نهائي قدره 1 مجم/مل]. من أجل الحصول على رواسب الحمض النووي، تمت إضافة 2 مل من خليط كلوريد الصوديوم والإيثانول في اليوم التالي (30 ميكرولتر من 5 مولار كلوريد الصوديوم ممزوجًا مع 20 مل من الإيثانول المطلق البارد). تم الطرد المركزي للمستخلصات الخلوية لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية لإزالة الجزء القابل للذوبان. تم شطف gDNA المترسب ثلاث مرات عن طريق تقطير 2 مل من 70٪ من الإيثانول وتم إعادة تعليقه أخيرًا في ماء بدرجة حرارة 70 درجة مئوية.

تم تكييف إجراء Splinkerette-PCR لرسم خرائط تكامل PB من Potter وLuo ¹³⁹ وتتكون من الخطوات التالية: أ) تم هضم 2 ميكروغرام من الحمض النووي الجينومي باستخدام 10 U BstYI (10,000 وحدة / مل، NEB) بحجم 30 ميكرولتر. تم تحضين التفاعل عند 60 درجة مئوية طوال الليل، وفي اليوم التالي تم تعطيل الإنزيم عند 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. تم إنشاء محولات Splinkerette-PCR عن طريق التلدين بـ 150 pmol من الاشعال AdaptorA و B (الجدول التكميلي 1) في الحجم النهائي من 100 ميكرولتر (10x NEB Buffer 2). تم تغيير طبيعة Oligos عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم تبريدها؛ ب) تم إجراء الربط بحجم إجمالي قدره 6 ميكرولتر بما في ذلك مزيج ربط 2x (تاكارا)، و2.5 ميكرولتر من gDNA المهضوم و0.5 ميكرولتر من المحولات الصلبة لـ Splinkerette-PCR. تم تحضين تفاعل الربط عند 16 درجة مئوية خلال الليل، وفي اليوم التالي عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لتعطيل الإنزيم. تم تضمين خطوة تنقية قبل الخطوة C، باستخدام QIaquick PCR Purification Kit، باتباع إرشادات الشركة المصنعة. بالنسبة لتضخيمات PCR، استخدمنا Phusion HF DNA Pol (NEB) في 5x Phusion GC Buffer الموصى بها في حالة القوالب الغنية بـ GC أو تلك ذات الهياكل الثانوية. شمل مزيج PCR 5x GC Buffer، و10 ملي مولار dNTPs، وDMSO، وPhusion Pol؛ ج) تم تضخيم الجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل بـ 15 ميكرولتر من الحمض النووي المرتبط (أو 50% من منتج الربط لكل تفاعل لوصلات النقل/المضيف PB5' وPB3')، و0.5 ميكرومتر لكل جهاز تمهيدي (Adaptor-PCR1 وPB5' أو PB3' -ITR PCR1)، مزيج PCR 6.5 ميكرولتر، الحجم النهائي 25 ميكرولتر. برنامج Splinkerette-PCR1: 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين؛ دورتان 2 درجة مئوية لمدة 95 ثانية، 20 درجة مئوية لمدة 65 ثانية، 30 درجة مئوية لمدة دقيقتين؛ ثم 68 دورة عند 2 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و60 درجة مئوية لمدة دقيقتين؛ ثم 30 درجة مئوية لمدة 68 دقائق؛ د) بالنسبة للجولة الثانية من PCR، استخدمنا 2 ميكرولتر من التخفيف 68:10 من منتج PCR5، 1 ميكرومتر لكل جهاز تمهيدي (Adapter-PCR500 وPB1' أو PB0.5'-ITR PCR2)، مزيج 5 ميكرولتر من PCR، الحجم النهائي 3 ميكرولتر . برنامج Splinkerette-PCR2: 6.5 درجة مئوية لمدة دقيقتين؛ دورتان 25 درجة مئوية لمدة 2 ثانية، 95 درجة مئوية لمدة 2 ثانية، 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين؛ ثم 20 دورات عند 65 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و68 درجة مئوية لمدة 2 ثانية، و5 درجة مئوية لمدة دقيقتين؛ ثم 95 دورة عند 30 درجة مئوية لمدة 60 ثانية، و30 درجة مئوية لمدة 68 ثانية، و2 درجة مئوية لمدة دقيقتين؛ ثم 25 درجة مئوية لمدة 95 دقائق؛ هـ) تمت معالجة منتجات PCR30 باستخدام فوسفاتيز القطب الجنوبي ونوكلياز خارجي I (كلاهما من NEB) وتم تسلسلهما باستخدام بادئات PB58'- أو PB30'-ITR PCR68. يتم سرد الاشعال وتسلسلات المحول في الجدول التكميلي 1.

تحليل تسلسل الجيل القادم لمواقع التكامل الجيني

تم استخراج الحمض النووي الجينومي من مجموعات كاملة من الطفرات باستخدام مجموعة Gentra Puregene Cell Kit. تم إجراء إعداد المكتبة وتسلسلها كما هو موضح سابقًا¹⁴⁰. يسمح خط أنابيب المعلوماتية الحيوية المفصل بتعيين كل قراءة على حدة إلى موضع الجينوم وربط كل موقع تكامل بجين على بعد 20 كيلو بايت من المسافة. تم بعد ذلك تنظيم البيانات في شبكة الجينات عالية الدقة المتفاعلة عن طريق برنامج Cytoscape (الإصدار 3.8.2).¹⁴¹.

تلطيخ يوديد البروبيديوم (PI).

تم إجراء تلطيخ PI على المجالس الاقتصادية والاجتماعية ذات الماوس الفردي المباشر وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة (Ebioscience، cat. 88-8007-72). بعد الغسيل في برنامج تلفزيوني، 10⁵ تمت إعادة تعليق الخلايا الحية في 200 ميكرولتر من 1x Binding Buffer و5 ميكرولتر من PI Staining Solution (القط 00-6990). تم إجراء تحليل التدفق الخلوي باستخدام BD FACSCanto^TM II مقياس الكريات خلال ساعة واحدة، وتخزين العينات عند درجة حرارة 1-2 درجة مئوية في الظلام. تم تحليل البيانات باستخدام BD FACSDiva^TM (الإصدار 9.0) وبرنامج FlowJo (10.8.1). تتوفر استراتيجية النابضة التمثيلية في الشكل التكميلي XNUMX. 10a.

فحص قياس ROS

تم الكشف عن إنتاج ROS عن طريق تلطيخ الخلايا الجذعية السرطانية للفأر الحي وخلايا NPCs البشرية باستخدام ثنائي أسيتات ثنائي كلورو ثنائي هيدروفلوريسئين (H₂DCFDA؛ تقنيات الحياة، القط. D399)، وتنفيذ الخطوات التالية: أ) تم إعادة تشكيل مؤشر ROS حديثًا من أجل صنع محلول مخزون مركّز (10 مم)؛ ب) 3-5×10⁵ تم حصاد الخلايا، ج) غسلها مرة واحدة باستخدام 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني ود) إعادة تعليقها في 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على المسبار لتوفير تركيز عمل نهائي قدره 0.5 ميكرومتر من الصبغة؛ ه) تم تحضين الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في الظلام؛ و) بعد إزالة محلول التلوين، تم غسل العينات ز) مرتين في برنامج تلفزيوني. تم جمع العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام BD FACSCanto^TM تم إجراء مقياس الكريات II أو BIO-RAD S3e Cell Sorter والتحليل باستخدام BD FACSDiva^TM (الإصدار 9.0)، ProSort^TM (الإصدار 1.6) وبرنامج FlowJo (10.8.1). تتوفر استراتيجية النابضة التمثيلية في الشكل التكميلي XNUMX. 10ب-ج.

تلطيخ Annexin V

تم تلوين NPCs الحية، التي تم نقلها عابرًا بالجين محل الاهتمام وتم علاجها باستخدام Rotenone 30 ميكرومتر لمدة 24 ساعة، باستخدام Annexin V وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة (Ebioscience، cat. 88-8007-72). تم غسل الخلايا مرة واحدة في برنامج تلفزيوني، ثم مرة واحدة في 1x Binding Buffer (القط 00-0055). 5 × 10⁵ تمت إعادة تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من 1x Binding Buffer واحتضانها بـ 5 ميكرولتر من Annexin V المترافق مع الفلوروكروم (القط 17-8007) لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة الغرفة. تم بعد ذلك غسل الخلايا في 500 ميكرولتر من 1x Binding Buffer. أخيرًا، تم إعادة تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من 1x Binding Buffer. تم إجراء تحليل التدفق الخلوي باستخدام فارز الخلايا BIO-RAD S3e خلال ساعة واحدة، وتخزين العينات عند درجة حرارة 1-2 درجة مئوية في الظلام. تم تحليل البيانات باستخدام ProSort^TM (الإصدار 1.6) وبرنامج FlowJo (10.8.1). تتوفر استراتيجية النابضة التمثيلية في الشكل التكميلي XNUMX. 10c.

غرب النشاف

تم غسل الخلايا في برنامج تلفزيوني بارد وحصادها في محلول تحلل (50 ملي هيبس درجة الحموضة 7.8، 200 ملي كلوريد الصوديوم، 5 ملي مولار EDTA، 1٪ NP40، 5٪ جلسرين)، مكمل حديثًا بـ 1 ملي مولار DTT، مثبط الأنزيم البروتيني (روش، قطة 39802300). ) ومثبط الفوسفاتيز (Sigma-Aldrich، cat. P5726). تم تعريض العينات للموجات فوق الصوتية في جهاز سونيكاتور (Diagenode Bioruptor) وطردها عند 15,871 قدم مكعب لمدة 10 دقائق لتحضير المادة الطافية. تم تحديد تركيز البروتين عن طريق القياس الكمي برادفورد. للتجارب في التين. 1b, 2g, 4d والشكل التكميلي. 1d، تم تجزئة البروتين الكلي (10 ميكروغرام) على 4-12٪ من هلام Nupage MOPS أكريلاميد (Life Technologies، cat. BG04125BOX / BG00105BOX) وتم نقله كهربيًا على غشاء PVDF (Millipore، cat. IPFL00010) في محلول نقل (50 مم تريس) -حمض الهيدروكلوريك، 40 ملي جليكاين، 20٪ ميثانول، 0.04٪ SDS). تم بعد ذلك تشبع الأغشية بمسحوق حليب جاف خالي الدسم بنسبة 5٪ (BioRad؛ 170-6405-MSDS) في TBST (8 جم كلوريد الصوديوم، 2.4 جم تريس-حمض الهيدروكلوريك، 0.1٪ توين20/لتر، الرقم الهيدروجيني 7.5) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. واحتضانها طوال الليل عند 1 درجات مئوية باستخدام الجسم المضاد الأولي لـ HTT (استنساخ 4HU-1C4) أو الجسم المضاد الأولي لـ GAPDH (استنساخ 8C6) (الجدول التكميلي 2). ثم تم تحضين الأغشية بأجسام مضادة ثانوية مترافقة مع بيروكسيداز، مخفف في حليب 1٪ في TBST. تم استخدام كاشف Pico SuperSignal West الكيميائي (Thermo Scientific، cat. 34078) لاحتضان الأغشية وتم الحصول على الصور رقميًا بواسطة ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare). يتم توفير المواد الهلامية والقيم العددية غير المقصوصة في ملف البيانات المصدر.

تم التضحية بالفئران عن طريق خلع عنق الرحم وتم تجانس الأنسجة في محلول تحلل يحتوي على 20 ملي مولار تريس-حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4، و1٪ Nonidet P-40، و1 ملي EDTA، و20 ملي مولار NaF، و2 ملي مولتر Na.₃VO₄ و 1: 1000 خليط مثبط الأنزيم البروتيني (سيجما الدريخ) و سونيكاتيد. للتجربة في الشكل التكميلي. 1b، تم تحميل 50 ميكروغرام من محللة البروتين الكلي للماوس WT، والماوس R6/2، وخلايا Q15 وخلايا Q128 في هلام تكديس الأكريلاميد بنسبة 5-11٪ يدويًا واحتضانها بالأجسام المضادة التالية: مضاد HTT (استنساخ EM48) ومضاد -GAPDH (الجدول التكميلي 2). للتجارب في الشكل التكميلي. 8 أ، د، هـ و ز، تم تحصين 40 ميكروغرام من المحللة البروتينية الكلية بالأجسام المضادة التالية: مضاد GFP، مضاد ACTIN (استنساخ 8H10D10)، مضاد HTT (استنساخ EM48)، مضاد TUBULIN (استنساخ B-5-1-2) (جدول إضافي) 2). تمت معالجة الأغشية كما هو موضح أعلاه. تم الحصول على الصور رقميًا بواسطة VWR Imager CHEMI Premium أو ChemiDoc XRS+ (الطراز رقم: Universal Hood II) باستخدام برنامج Image Lab، BioRad (الإصدار 6.1). تم إجراء القياس الكمي باستخدام Fiji 2.9.0 مع طرح الخلفية والتطبيع في التحكم في التحميل (GAPDH أو ACTIN أو TUBULIN). يتم توفير المواد الهلامية غير المقصوصة في ملفات البيانات المصدر.

المناعي

تم إجراء التألق المناعي للكشف عن MTF1 في الخلايا الجذعية السرطانية بالماوس على خلايا مطلية بالليفونيكتين (Merck، cat. FC010) ساترة زجاجية مغلفة. تم إصلاح الخلايا في 4٪ من الفورمالديهايد (Sigma-Aldrich، cat. F8775) في PBS لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة الغرفة، وتم غسلها في PBS، وتم نفاذها لمدة 10 دقائق في PBS + 0.1٪ Triton X-100 (PBST) في درجة حرارة الغرفة وتم حظرها. في PBST + 3٪ من مصل الحصان (HS؛ Gibco، cat. 16050-122) لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تم تحضين الخلايا طوال الليل عند 4 درجات مئوية باستخدام الأجسام المضادة الأولية (للاطلاع على تفاصيل الأجسام المضادة الأولية والثانوية، انظر الجدول التكميلي XNUMX). 2) في PBST + 3% من النظام المنسق. بعد الغسيل باستخدام PBST، تم تحضين الخلايا بالأجسام المضادة الثانوية (Alexa، Life Technologies) لمدة 45 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة. كانت النوى ملطخة بـ DAPI (4 ′، 6-diamidino-2-phenylindole؛ Sigma-Aldrich، cat. F6057). تم الحصول على الصور باستخدام مجاهر متحد البؤر Leica SP5. تم إجراء تحليل الصور باستخدام فيجي 2.9.0. تم إجراء القياس الكمي للكثافة النووية والسيتوبلازمية باستخدام برنامج CellProfiler (الإصدار 4.1.3). باختصار، تم الكشف عن النوى عن طريق تلطيخ DAPI. تم تعريف السيتوبلازم بشكل تعسفي عن طريق توسيع النوى شعاعيًا بمقدار 10 بكسل. تم حساب ورسم نسبة الكثافة النووية المتكاملة لإشارة MTF1 على الكثافة الخلوية المتكاملة لإشارة MTF1 (النواة + السيتوبلازم).

تم إجراء تحليل التألق المناعي على iPSCs البشرية والشخصيات الوطنية على 1% ساترة زجاجية مغلفة بـ Matrigel في الآبار. تم إصلاح الخلايا في 4٪ من الفورمالديهايد (Sigma-Aldrich، cat. F8775) في PBS لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة الغرفة، وتم غسلها في PBS، وتم نفاذها لمدة ساعة واحدة في PBST عند درجة حرارة الغرفة وتم حظرها في PBST + 1٪ من H5S (Gibco، قطة 16050-122) لمدة 5 ساعات في درجة حرارة الغرفة. تم تحضين الخلايا طوال الليل عند 4 درجات مئوية باستخدام الأجسام المضادة الأولية (للاطلاع على تفاصيل الأجسام المضادة الأولية والثانوية، انظر الجدول التكميلي XNUMX). 2) في PBST + 3% من النظام المنسق. بعد الغسيل باستخدام برنامج تلفزيوني، تم تحضين الخلايا بالأجسام المضادة الثانوية (Alexa، Life Technologies) لمدة 45 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة. كانت النوى ملطخة بـ DAPI (4 ′، 6-diamidino-2-phenylindole؛ Sigma-Aldrich، cat. F6057). تم الحصول على الصور باستخدام مجاهر Zeiss LSM900 Airyscan 2 متحد البؤر. تم إجراء تحليل الصور باستخدام فيجي 2.9.0.

عزل الحمض النووي الريبي (RNA) والنسخ العكسي وPCR الكمي

بالنسبة للمحللة الخلوية، تم عزل الحمض النووي الريبي (RNA) باستخدام Total RNA Purification Kit (Norgen Biotek، القطة 37500) وتم تصنيع الحمض النووي التكميلي (cDNA) من 500 نانوغرام باستخدام النسخ العكسي M-MLV (Invitrogen، القطة 28025-013)، RNaseOUT (40). وحدات/ميليلتر)، الاشعال العشوائي (200 نانومتر)، dNTPs (10 ملم)، المخزن المؤقت الأول ستراند 5x، DTT (0.1 متر). بالنسبة ليرقات الزرد، تم عزل الحمض النووي الريبي الكلي مع الاستفادة من استخراج الفينول كلوروفورم. تم عزل إجمالي الحمض النووي الريبي (RNA) من مجموعات مكونة من 10 حيوانات باستخدام كاشف TRIzol (تقنيات الحياة، القطة 15596026)، باتباع إرشادات الشركة المصنعة لإجراءات استخلاص التريزول-كلوروفورم-إيثانول القياسية. تم استخدام الجليكوجين الخالي من RNase على النحو الذي اقترحه البروتوكول، لزيادة إنتاج خطوة هطول الأمطار RNA. تم نسخ 2 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي (RNA) إلى [كدنا] باستخدام Superscript III Reverse Transcriptase (Invitrogen، cat. 18080044) ومزيج من الاشعال oligo (dT) 18 (500 ميكروغرام / مل) ؛ مزيج dNTP (10 ملم)؛ دي تي تي (0.1 م)؛ 5x عازلة أولية؛ RNaseOUT (40 وحدة/ميكروليتر).

بالنسبة لـ PCR في الوقت الفعلي، تم استخدام SYBR Green Master mix (Bioline، cat. BIO-94020). تم تفصيل الاشعال في الجدول التكميلي 3. تم إجراء التكرارات الفنية لجميع PCR الكمي. بالنسبة للمجالس الاقتصادية والاجتماعية الخاصة بالماوس، تم استخدام iPSCs البشرية وNPCs وGapdh وGAPDH كعنصر تحكم داخلي لتطبيع التعبير. يعني Ct الزرد com.gadh, eef1a1l1, com.tuba1b و b2m تم استخدامه كعنصر تحكم التدبير المنزلي الداخلي للتطبيع، وذلك بسبب التباين الموضح عند النظر إلى مستويات التعبير لتلك الجينات. تم الحصول على بيانات qPCR باستخدام الإصدار QuantStudio ™ 6&7 Flex Software 1.0 و1.3.

تسلسل الحمض النووي الريبي: إعداد المكتبة

تم قياس كمية الحمض النووي الريبي (RNA) الإجمالي باستخدام اختبار Qubit 4.0 الفلوري (Thermo Fisher Scientific). تم إعداد المكتبات من 125 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي (RNA) باستخدام خدمة تسلسل الأبحاث NEGEDIA Digital mRNA-seq (Negedia srl)¹⁴⁰ والتي تضمنت إعداد المكتبة وتقييم الجودة والتسلسل على نظام التسلسل NovaSeq 6000 باستخدام استراتيجية أحادية النهاية مكونة من 100 دورة (Illumina Inc.).

سير عمل المعلوماتية الحيوية

تم تحليل البيانات الأولية بواسطة خط أنابيب Next Generation Diagnostics srl المملوك لشركة NEGEDIA Digital mRNA-seq، والذي يتضمن خطوة تنظيف عن طريق تصفية الجودة والتشذيب، والمواءمة مع الجينوم المرجعي والعد حسب الجينات^142,143. تم فرز الجينات بإزالة تلك التي لديها عدد إجمالي أقل من 5 في 3 عينات على الأقل من أصل 30. بعد تطبيق هذا المرشح، حددنا 11,851 جينًا معبرًا تم أخذها في الاعتبار لمزيد من التحليلات.

تم إجراء تحليل التعبير التفاضلي في بيئة R (الإصدار 4.1.0) باستخدام Bioconductor (الإصدار 3.14) الذي يستغل حزمة DESeq2 R. (الإصدار 1.34.0)¹⁴⁴ و edgeR (الإصدار 3.36.0)¹⁴⁵. يقوم DESeq2 بتقدير عوامل الحجم، وتقدير التشتت لكل جين ويناسب نموذجًا خطيًا معممًا سلبيًا ذي الحدين مع إحصائيات والد ثنائية الذيل. الأهمية البيولوجية لـ DEGs بين Q128 و Q15 (الشكل XNUMX أ). 1g) من DEGs بين Q128_Mtf1 و Q128 (الشكل التكميلي SXNUMX). 5b) والجينات التي أنقذتها MTF1 (تين. 5c) تم استكشافها من خلال تحليل إثراء مصطلح Gene Ontology (GO) باستخدام برنامج Enrichr (الإصدار 3.0) بما في ذلك فئات العمليات البيولوجية (BP) (2021) والوظيفة الجزيئية (MF) (2021).

لإجراء إثراء تكاثر الخلايا (GO:0008283 و¹⁴⁶) وموت الخلايا المبرمج (R-HSA-109581 و WP1351) التواقيع الجينية في خطوط الخلايا Q128 و Q15 التي تزيد من التعبير MTF1، استخدمنا برنامج تحليل إثراء مجموعة الجينات (GSEA) (الإصدار 4.3.2)¹⁴⁷. تم إنشاء قوائم مجموعة الجينات المصنفة مسبقًا بناءً على السجل₂ قيم التغيير الطي (FC) التي تم الحصول عليها من خلال تحليل التعبير التفاضلي بين Q128_Mtf1 و Q128 و Q15_Mtf1 و Q15.

تم إجراء تحليل إثراء الحافز باستخدام أداة تحليل الحافز من مجموعة أدوات الجينوم التنظيمية (https://reg-gen.readthedocs.io). تم الحصول على Mtf1 MRE من قاعدة بيانات Jaspar (الإصدار التاسع، http://jaspar.genereg.net/)¹⁴⁸. تم استخدام الأمر "مطابقة rgt-motifana Analysis" للبحث عن مواقع الربط في منطقة المروج لجميع الجينات محل الاهتمام؛ بعد ذلك، تم استخدام "تخصيب التحليل الجزيئي rgt" لإجراء اختبار فيشر الدقيق لتقييم ما إذا كانت نسبة مواقع الارتباط في مجموعة الجينات محل الاهتمام أعلى من المتوقع عن طريق الصدفة.

تم تصور نسخة بيولوجية تمثيلية واحدة لبيانات تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA) وMtf1 MRE كمسارات في عارض الجينوم المتكامل (IGV v. 2.16.0) كما هو موضح في الشكل XNUMX. 5h.

تم إنتاج قطع البراكين والمؤامرات المتناثرة باستخدام السجل₂ FC و -log₁₀ p-قيمة استغلال وظيفة ggscatter من حزمة ggpubr R (الإصدار 0.4.0.5). تم إنشاء خرائط التمثيل اللوني باستخدام قيم CPM مع وظيفة pheatmap من حزمة pheatmap R (الإصدار 1.0.12).

محاذاة Mtf1 orthologues

• MTF1 تم إجراء محاذاة التسلسل باستخدام برنامج Clustal Omega (الإصدار 1.2.4، https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)¹⁴⁹. تم حساب الهوية بين التسلسلات باستخدام برنامج Sequence Manipulation Suite (https://www.bioinformatics.org/sms2/ident_sim.html).

تحليل المعادن

بعد 48 ساعة من العلاج بالتكييف، 10⁷ تم جمع خلايا Q15 وQ128، وطردها في أنابيب إيبندورف، وتمت إزالة الطاف وتخزين كريات الخلية عند -80 درجة مئوية. مباشرة قبل التحليل، تم إذابة الخلايا وإعادة تعليقها في HNO المركز₃ (68%)، يضاف 1 مل لكل عينة. بعد الذوبان الكامل، أضفنا 2 مل من الماء عالى النقاء وقمنا بتمعدن العينة بالكامل عن طريق تسخين الميكروويف، باستخدام مفاعل ميكروويف عالي الضغط عالي الكفاءة (Ultrawave، Milestone، Bergamo، إيطاليا). تم تطبيق نفس الإجراء على وسط الثقافة، قبل وبعد علاج التكييف. تم الحصول على منحنيات المعايرة لكميات المعادن من خلال إعداد ستة محاليل قياسية بتركيزات مختلفة (0.005-0.010-0.025-0.050-0.100-0.200 جزء في المليون)، مع الاستفادة من المعايير المعتمدة متعددة العناصر والعنصر الواحد (Agilent). تم بعد ذلك ترشيح جميع العينات من خلال مرشح حقنة 0.20 ميكرومتر. تم إجراء تحليل المعادن، مع ذرات وتأين العينات التي تم الحصول عليها في بلازما الأرجون، بواسطة البلازما المقترنة حثيًا - قياس طيف الانبعاث البصري (ICP-OES، mod 5110، Agilent).

جيل من نموذج Zebrafish HD

تم إنشاء الزرد عالي الدقة عن طريق الحقن المجهري في أجنة مرحلة الخلية الواحدة من الرنا المرسال الذي يشفر الإكسون الأول للإنسان HTT بما في ذلك 74Q أو 16Q، مدمج في الإطار لتسلسل تشفير eGFP. تم استنساخ Q74eGFP وQ16eGFP في البلازميد pCS2+ من أجل السماح بالنسخ في المختبر. تم أيضًا إنشاء البلازميدات pCS2_Mtf1 وpCS2_mCherry للحصول عليها MTF1 و مشيري mRNAs المستخدمة للحقن في أجنة الزرد HD.

بالنسبة إلى الحمض النووي الريبي (RNA) في النسخ المختبري، تم تحويل 2.5 ميكروغرام من pCS2_Q74eGFP وpCS2_Q16eGFP وpCS2_Mtf1 وpCS2_mCherry إلى خطية عن طريق الهضم طوال الليل عند 37 درجة مئوية باستخدام HF-Not I (New England Biolabs، cat. R3189S). تم بعد ذلك تركيز حجم الهضم بواسطة مجموعة DNA Clean & Concentrator (Zymo Research، cat. D4003) واستخدامه في تفاعل النسخ المغطى (mMESSAGE mMACHINETM SP6 Transcription Kit، Thermo Fisher Scientific، cat. AM1340) بواسطة بوليميريز SP6 RNA. بعد إزالة قالب الحمض النووي عن طريق علاج DNase (Thermo Fisher Scientific، cat. AM2238) لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية، تمت تنقية الحمض النووي الريبي (RNA) عن طريق استخراج الفينول كلوروفورم (كما تمت مناقشته في فقرة "عزل الحمض النووي الريبي (RNA) والنسخ العكسي وPCR الكمي"). تم قياس كمية الحمض النووي الريبي (RNA) بواسطة Nanodrop ND-1000 ثم تم تخفيفه وفقًا للحاجة في مزيج من 10٪ Danieau buffer [8 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.7 ملي كلوريد كلوريد، 0.4 ملي مولار MgSO₄، 0.6 ملم كا (NO₃)₂، 2.5 ملي هيبيس، درجة الحموضة 7.6]، 10٪ فينول أحمر (ميرك، قطة 1072410025) ومياه خالية من RNase.

من أجل تحديد جرعة الحقن التي تسببت في أعلى معدل للتشوهات مع أدنى مستوى للوفاة، قمنا بحقن جرعات متزايدة من Q74eGFP mRNA تتراوح من 150 إلى 1000 بيكوغرام / جنين وسجلنا ظاهريًا 24 جنينًا من HPF. بمجرد تحديد جرعة قدرها 250 بيكوغرام / جنين، تحت المجهر الضوئي، تم حقن الأجنة بـ mRNAs المكتوبة في المختبر. تم بعد ذلك نقل الأجنة المحقونة بشكل دقيق إلى مياه الأسماك واحتضانها عند درجة حرارة 28 درجة مئوية. تم التعرف على البويضات غير المخصبة والتخلص منها بعد 4 ساعات من الحقن المجهري. تم dechorionated 24 الضفادع الصغيرة HPF باستخدام إبر مخصصة تحت المجهر الضوئي.

تلطيخ جبل كامل

تم تخدير الأجنة المحقونة باستخدام التريكين وتجميدها في 1.5٪ ميثيل سلولوز أو 2٪ أغاروز منخفض الذوبان وتحليلها باستخدام مجهر مضان Leica M165FC. تم الحصول على صور الزرد متحد البؤر باستخدام مجهر متحد البؤر من نيكون C2 H600L.

بالنسبة لملح أكريدين أورانج هيمي (كلوريد الزنك) في تلطيخ الجسم الحي (ميرك، قطة A6014)، تم نزع 24 أجنة من HPF، ونقلها إلى طبق من 6 بئر واحتضانها في حوالي 2 مل من أكريدين أورانج (20 ميكروغرام / مل) لكل بئر في ماء السمك لمدة 15 دقيقة عند 28 درجة مئوية. تمت بعد ذلك إزالة محلول أكريدين وغسل الأجنة ثلاث مرات باستخدام 1 مل من ماء السمك. قبل أن يتم ملاحظتها على شريحة زجاجية بواسطة المجهر الفلوري، تم تخدير الضفادع الصغيرة بواسطة تريكين.

بالنسبة لفحص TUNEL، تم استخدام ApopTag Fluorescein In Situ Apoptosis Detection Kit (Merck، cat. S7110) وcollagenase (Merck، cat. C9891). تم وضع 7 أجنة - 30 ساعة بعد الحقن المجهري لكل حالة في إيبندورف، وتم تخديرها باستخدام تريكين وتثبيتها في بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) عند 4 درجات مئوية خلال الليل. بعد ذلك، تمت إزالة PFA وغسل العينات باستخدام برنامج تلفزيوني (3 مرات، 10 دقائق لكل منهما)، أثناء الرج. تم تجفيف الأجنة من خلال سلسلة من محاليل الميثانول تتراوح من 10٪ إلى 100٪ وتجميدها عند -20 درجة مئوية طوال الليل. بعد ذلك، تم ترطيب الأجنة بسلسلة من محاليل الميثانول 70-50-30% وغسلها باستخدام PBS مع Tween-20 لمدة 10 دقائق، أثناء الرج. بعد ذلك، تم تطبيق الكولاجيناز لمدة 8 دقائق أثناء الرج وتم غسل الفائض بواسطة PBS بخطوات الغسيل Tween-20 (3 مرات، 5 دقائق لكل منهما). تم تحضين العينات لمدة ساعة واحدة في المخزن المؤقت للموازنة أثناء الرج، ثم لمدة ساعتين عند 1 درجة مئوية في قوة العمل TdT. تم إيقاف التفاعل عن طريق غسل العينات مرتين في المخزن المؤقت Stop/Wash لقوة العمل. بعد ذلك، كانت هناك خطوة حظر مدتها ساعة واحدة باستخدام PBS مع Tween-2 أثناء الاهتزاز، ثم تم تحضين الأجنة طوال الليل في محلول مترافق مضاد للديجوكسيجينين بقوة العمل عند درجة حرارة 37 درجات مئوية في الظلام. في صباح اليوم التالي، تمت إزالة محلول الجسم المضاد، وتم غسل العينات باستخدام برنامج تلفزيوني (1 مرات، 20 دقائق لكل منهما) وتحليلها بواسطة مجهر متحد البؤر. تم فحص الهياكل الأمامية ليرقات الزرد في 4 كومة يبلغ حجم كل منها 4 ميكرومتر، وتمتد على عمقها بالكامل. قمنا بتحديد كمية أجزاء المنطقة الإيجابية الفلورية على المساحة الإجمالية (باستثناء منطقة الصفار). بالنسبة لتحليلات القياس الكمي، تم الحصول على جميع الصور بنفس معلمات التعرض ومعالجتها باستخدام برنامج فيجي (الإصدار 10). تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام الماضي (الإصدار 70) والمنشور (الإصدار 3.475).

حقن ناقلات AAV-PHP.eB والتنميط الظاهري للماوس وجمع الأنسجة

تم إنتاج جزيئات فيروسية AAV-PHP.eB ومعايرتها في مختبر بروكلي كما هو موضح سابقًا⁷⁵. تم تعديل هذا الناقل الفيروسي للتعبير عن الجين المرشح تحت سيطرة مروج Ef-1ɑ MTF1 أو إما eGFP كعنصر تحكم. تم إجراء الحقن الوعائي في أداة تقييد تضع الذيل في أخدود ساخن. تم مسح الذيل بالكحول ثم حقنه في الوريد. تم اختيارهم بصورة عشوائية الفئران WT وR6/2 في مجموعات وحقنها في الوريد الذيل عند عمر 4.2 أسبوع. بعد الحقن، تم وزن جميع الفئران مرتين في الأسبوع. تم إجراء التنميط الظاهري، دون مراعاة النمط الوراثي والعلاج، مرتين في الأسبوع. تم تقييم التوازن والتنسيق الحركي بواسطة اختبار الروتارود ومهمة السلم الأفقي. تم عزل الحمض النووي الكلي من الأنسجة الحيوانية (القشرة والجسم المخطط) باستخدام مجموعة Qiagen DNeasy للدم والأنسجة (QIAGEN، قطة 9504).

تربية الحيوان

تم إجراء جميع تجارب الزرد في مرفق الأسماك بقسم الأحياء بجامعة بادوفا. تم حفظ يرقات الزرد لمدة ثلاثة أيام على الأكثر في أطباق بيتري مع ماء السمك (60 مجم من Instant Ocean، قطة. SS15-10، لكل لتر من الماء المقطر) عند درجة حموضة محايدة عند 28 درجة مئوية، وفقًا للإجراءات القياسية (http://ZFIN.org).

تم إنشاء مستعمرات الماوس في IRCCS Neuromed. تربية أزواج من خط R6/2 من إناث الفئران المعدلة وراثيا [اسم السلالة: B6CBA-tgN (HDexon1) 62Gpb/1 J] مع ~تم شراء 160 ± 10 توسعات تكرار CAG من مختبرات جاكسون. تم إيواء الفئران في ظل ظروف قياسية (22 ± 1 درجة مئوية، 60٪ رطوبة نسبية، 12 ساعة من الضوء / الظلام، 3-4 فئران / قفص، مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء). تم عبور ذكور الفئران R6/2 (5-6 أسابيع من العمر) مع فئران B6CBA WT الأنثوية (5-6 أسابيع من العمر) لصيانة المستعمرة؛ تم استخدام الفئران WT وR6/2 الناتجة في جميع التجارب التي أجريت في هذه الدراسة. وترد في الجدول التكميلي قائمة كاملة بالفئران المستخدمة في هذه الدراسة، مع الإشارة إلى العمر والجنس والعلاجات والقياسات 4. تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل لجنة أخلاقيات مجلس مراجعة رعاية الحيوان العصبية IRCCS ومن قبل Istituto Superiore di Sanità (رقم تصريح ISS: 548/2022-PR) وتم إجراؤها وفقًا لتوجيهات 2010/63/EU للتجارب على الحيوانات.

اختبارات السلوك الحركي

تم إجراء جميع اختبارات السلوك خلال مرحلة الضوء من دورة الضوء/الظلام. تم اختبار الفئران قبل وبعد العلاج في النقاط الزمنية المحددة. قبل التدريب والاختبار، خضعت الفئران لفترة من التعود على غرفة الاختبار والمعدات. تلقت جميع الفئران تدريبًا لمدة يومين متتاليين على كل أداة ومهمة قبل إجراء قياسات السلوك الحركي. تم اختبار الفئران بسرعة ثابتة (0.1 إطار التعاون الإقليمي) على جهاز روتارود لمدة دقيقة واحدة. تم اختبار كل فأر في ثلاث تجارب متتالية مدة كل منها دقيقة واحدة، مع راحة لمدة دقيقة واحدة بين التجارب. تم حساب متوسط ​​الوقت الذي يقضيه في الروتارود في كل تجربة من التجارب الثلاث لإعطاء الوقت الإجمالي لكل فأر. في مهمة السلم الأفقي، سارت الفئران بشكل عفوي على طول سلم أفقي مع تباعد متغير وغير منتظم بين الدرجات. في كل جلسة اختبار، تم تقييم أداء الماوس باستخدام نظام تسجيل الإقبال المعمول به¹⁵⁰، والذي يسمح بإجراء تقييم نوعي وكمي لوضع الأطراف الأمامية والخلفية على درجات السلم. تم إجراء جميع الاختبارات الحركية بواسطة نفس المجرب الذي كان أعمى عن النمط الوراثي للفأر والمجموعة التجريبية طوال فترة التحليل بأكملها.

تحليل التشابك

يتم تحديد درجة التشابك خلال 30 ثانية. على وجه الخصوص، تم تعليق الفئران من ذيولها من ارتفاع 50 سم وتم تعريف استجابة الأطراف على أنها سحب أي طرف إلى الجذع لأكثر من ثانيتين. تم استخدام الدرجات التالية: 2 (غياب التشابك)، 0 (انسحاب أي طرف واحد)، 0.5 (انسحاب أي طرفين)، 1 (انسحاب أي ثلاثة أطراف)، 1.5 (انسحاب جميع الأطراف الأربعة).

ثنائي هيدرو إيثيديوم (DHE)

تم التضحية بالفئران WT وR6/2 عن طريق خلع عنق الرحم. تمت إزالة العقول وتشذيبها عن طريق إزالة البصلات الشمية والحبل الشوكي. تمت معالجة الجزء المتبقي من الدماغ ودمجه في شمع البارافين، وتم قطع مقاطع إكليلية بحجم 10 ميكرومتر على مشراح RM 2245 (Leica Microsystems) وتم طرحه في حمام مائي بدرجة حرارة 40 درجة مئوية يحتوي على ماء مقطر. تم نقل المقاطع إلى شرائح زجاجية مناسبة للكيمياء المناعية وتركها تجف طوال الليل عند درجة حرارة الغرفة. تمت إزالة الكافيين من العينات في الزيلين لمدة 30 دقيقة، ثم نقلها إلى كحول 100% لمدة 10 دقائق ثم مرة واحدة خلال 95% و70% و50% كحول على التوالي لمدة 10 دقائق لكل منها، وتم غسلها في برنامج تلفزيوني مرتين. تم اكتشاف إنتاج توليد الأكسيد الفائق في الموقع عن طريق التألق باستخدام DHE (Sigma-Aldrich، cat. D7008). تم تحضين العينات باستخدام DHE (2 ميكرومتر) في غرفة مرطبة محمية بالضوء عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تم شطف الشرائح باستخدام برنامج تلفزيوني مرتين ومراقبتها تحت المجهر. لكل تلطيخ، تم استخدام أربعة فئران لكل مجموعة تجريبية وتم الحصول على ثلاثة أقسام إكليلية لكل حيوان باستخدام مجهر Nikon ECLIPSE Ni وتم تحليلها بواسطة برنامج NIS-Elements Image Software (الإصدار 4.40، Nikon) وبرنامج Fiji 2.9.0.

mHTT المجاميع المناعية

تم التضحية بالفئران WT وR6/2 عن طريق خلع عنق الرحم. تمت إزالة العقول وتشذيبها عن طريق إزالة البصلات الشمية والحبل الشوكي. تمت معالجة الجزء المتبقي من الدماغ ودمجه في شمع البارافين، وتم قطع مقاطع إكليلية بحجم 10 ميكرومتر على مشراح RM 2245 (Leica Microsystems) وتم طرحه في حمام مائي بدرجة حرارة 40 درجة مئوية يحتوي على ماء مقطر. تم نقل المقاطع إلى شرائح زجاجية مناسبة للكيمياء المناعية وتركها تجف طوال الليل عند درجة حرارة الغرفة. تمت إزالة الكافيين من العينات في الزيلين لمدة 30 دقيقة، ثم نقلها إلى كحول 100% لمدة 10 دقائق ثم مرة واحدة خلال 95% و70% و50% كحول على التوالي لمدة 10 دقائق لكل منها، وتم غسلها في برنامج تلفزيوني مرتين. لكشف الحاتمة المستضدية، تم إجراء استرجاع المستضد باستخدام طريقة عازلة السترات (احتضان مع عازلة السترات 10 ملم، ودرجة الحموضة 6.0 عند 95-100 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ثم السماح للشرائح لتبرد لمدة 15 دقيقة). تم غسل الشرائح مرتين باستخدام PBS، وتم نفاذها في TBS-Triton 0.1٪ لمدة 10 دقائق، ثم تم تحضينها في غرفة مرطبة في درجة حرارة الغرفة مع مانع العازلة (مصل الحصان 10٪ في PBS) لمدة ساعة واحدة. تمت إزالة المخزن المؤقت للحظر وتم تحضين الشرائح في غرفة مرطبة عند 1 درجات مئوية خلال الليل باستخدام جسم مضاد لـ HTT للماوس (استنساخ EM4، لمزيد من التفاصيل، انظر الجدول التكميلي 2). بعد الغسيل ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني، تم تحضين الخلايا بالأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعة واحدة في غرفة مرطبة في درجة حرارة الغرفة، ومحمية من الضوء. كانت النوى ملطخة بـ DAPI (1 ′، 4-diamidino-6-phenylindole؛ Sigma-Aldrich، cat. F2). تم استخدام أربعة فئران لكل مجموعة تجريبية وتم الحصول على ثلاثة أقسام إكليلية لكل حيوان باستخدام مجهر Nikon ECLIPSE Ni وتم تحليلها بواسطة برنامج NIS-Elements Image Software (الإصدار 6057، Nikon) وبرنامج Fiji 4.40.

الإحصاء والتكاثر

لم يتم استخدام أي طريقة إحصائية لتحديد حجم العينة مسبقًا، ولكن أحجام العينات لدينا مماثلة لتلك المستخدمة عادة في مجال بحثنا. ولم يتم استبعاد أية بيانات من التحليلات. كان من المفترض أن يكون توزيع البيانات طبيعيًا ولكن لم يتم اختبار ذلك رسميًا. P-قيم التجارب التي تنطوي على تدابير متكررة (الشكل XNUMX). 1c، تين. 4f، تين. 7b (اليسار)، 7c (يسار) و 7g، تين. 8د،والشكل التكميلي 1eالشكل التكميلي 4 أ ، جالشكل التكميلي 8cالشكل التكميلي 9c) باستخدام قياس ANOVA المتكرر ثنائي الاتجاه مع تصحيح Bonferroni. لإجراء تجارب على خطوط الخلايا، قمنا بشكل عشوائي بتخصيص جزء من كل مجموعة من الخلايا لتكرارات بيولوجية مختلفة. لتحليل البيانات المناعية والتدفق الخلوي، قمنا بتحليل الحقول العشوائية أو جزء عشوائي من الخلايا. ولم تكن أنواع أخرى من التجارب عشوائية. لم يتم إجراء جمع البيانات وتحليلها بشكل أعمى لظروف التجارب، ولكن تم إجراء تحليلات البيانات باستخدام معلمات وبرامج متطابقة. تم إجراء تحليل السلوكيات الحركية للماوس بشكل أعمى. تم إجراء تمثيل البيانات والتحليلات الإحصائية باستخدام برنامج R (الإصدار 4.0.0 والإصدار 4.1.0) وPAST (الإصدار 4.03)، ما لم ينص على خلاف ذلك. يتم تعريف كافة الأشرطة وأشرطة الخطأ ومؤامرات الصندوق في وسائل إيضاح الأشكال. عدد التكرارات البيولوجية والتجارب المستقلة، كلاهما> 2، موضح في أساطير الأشكال. يشار إلى الاختبارات الإحصائية المستخدمة في أساطير الشكل. تم إجراء جميع تجارب qPCR بثلاث مكررات تقنية. تم الحصول على النتائج التجريبية الرئيسية بواسطة عاملين مستقلين.

ملخص التقارير

مزيد من المعلومات حول تصميم البحوث متاح في ملخص تقارير حافظة الطبيعة مرتبطة بهذه المادة.

• محتوى مدعوم من تحسين محركات البحث وتوزيع العلاقات العامة. تضخيم اليوم.
• PlatoData.Network Vertical Generative Ai. تمكين نفسك. الوصول هنا.
• أفلاطونايستريم. ذكاء Web3. تضخيم المعرفة. الوصول هنا.
• أفلاطون السيارات / المركبات الكهربائية ، كربون، كلينتك ، الطاقة، بيئة، شمسي، إدارة المخلفات. الوصول هنا.
• BlockOffsets. تحديث ملكية الأوفست البيئية. الوصول هنا.
• المصدر https://www.nature.com/articles/s41467-023-39552-9