الأخلاقيات

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية على الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية بجامعة تشونام الوطنية بموجب بروتوكول CNU IACUC-H-2021-51. تم إجراء صيانة مرافق البحوث الحيوانية والإجراءات التجريبية وفقًا للمبادئ التوجيهية لقانون رعاية الحيوان الذي أقرته وزارة الزراعة والغذاء والشؤون الريفية الكورية.

البناء البلازميد

تم وصف بناء وإنتاج FlaB من نظام التعبير بدائيات النواة (pFlaB) سابقًا [16]. باختصار، الضمة الشديدة فلاجلين ب (شحم) تم استنساخ الجين في ناقل pTYB12. بعد ذلك، تم تحويل بلازميد التعبير الناتج إلى E. كولاي ER2566 (نيو إنجلاند بيولابس، بيفرلي، ماساتشوستس) عن طريق الكهربي. انتشرت البكتيريا على صفيحة LB التي تحتوي على المضاد الحيوي الأمبيسيلين. بعد ذلك، قمنا بتربية البكتيريا وأضفنا المحفز 0.5 ملي مولار IPTG (آيزوبروبيل-β-D-ثيوجالاكتوبرانوسيد) عند 0.6-0.8 OD600 من الثقافة في 20 درجة مئوية لمدة 18-20 ساعة. بعد ذلك، قمنا بتكوير البكتيريا وإعادة تعليقها في محلول تحلل (20 ملي مولار Tris-Cl [الرقم الهيدروجيني 7.5]، 500 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA [الرقم الهيدروجيني 8.0]، 0.1% Triton X-100، 0.1% توين 20، 20 م). فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل) وصوتنة (Vibra Cell VCX500؛ Sonics & Materials، Inc.، Newtown، CT) على سرير جليدي. بعد الطرد المركزي عند 35,000 × g لمدة 30 دقيقة، تم خلط الطاف مع حبة راتنج الكيتين وإزالة البروتين غير المحدد عن طريق إسقاطه ببطء عند 4 درجات مئوية حتى الانتهاء من الحجم وغسله باستخدام محلول الغسيل (20 ملي مولار Tris-Cl [الرقم الهيدروجيني 7.5]، 500 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار EDTA [الرقم الهيدروجيني 8.0]). أخيرًا، تمت تصفية البروتين باستخدام محلول الشطف (20 ملي مولار Tris-Cl [7.5 درجة حموضة]، 500 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار EDTA [درجة الحموضة 8.0]، 50 ملي مولار 1,4،XNUMX-ديثيوثريتول) وتم تأكيد نقاء pFlaB بواسطة SDS- صفحة. للتعبير حقيقي النواة FlaB (eFlaB)، كودون مُحسّن شحم تم تصنيع التسلسل الجيني بواسطة شركة بايونير، كوريا الجنوبية. ال شحم تم تضخيم الجين بواسطة تفاعل PCR باستخدام التمهيدي الأمامي، 5'-CCCأجكتجككجتكاكجتجااكاككا-3' تحتوي على هند III (أجكت) الموقع والتمهيدي العكسي، 5'-ATAGTTTAجي سي جي جي سي سي جي سيGCCCAGCAGGGAGAGGCGC-3' تحتوي على لا (جي سي جي جي سي سي جي سي) موقع. المضخمة شحم تم هضم ناقلات التعبير حقيقية النواة pSectag2B (Invitrogen، V900-20) بواسطة إنزيمات التقييد هند III و لا عند 37 درجة مئوية خلال الليل. ثم قمنا بربط شحم مع ناقل pSectag2B بواسطة T4 DNA ligase (الإنزيمات، M001S) في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. تم تحويل البلازميد المرتبط إلى كولاي TOP10 الخلايا المختصة وتنتشر على طبق أجار LB يحتوي على الأمبيسيلين (الجدول التكميلي XNUMX). 1). تم تأكيد التسلسل بواسطة نظام التسلسل عبر الإنترنت Macrogen (http://dna.macrogen.com/kor/).

ترنسفكأيشن الحمض النووي وتنقية البروتين وتوصيفه

خط خلايا الثدييات Expi293^TM تم الحصول عليها من Thermofisher العلمية. تم إجراء ترنسفكأيشن الحمض النووي باستخدام ExpiFectamine باتباع بروتوكول الشركة المصنعة (Thermofisher، A14635). باختصار، Expi293^TM تم تربيتها الخلايا عند 37 درجة مئوية، 8٪ CO₂، وسرعة اهتزاز الحاضنة 125 دورة في الدقيقة (إيبندورف، S41I230011) حتى ثلاثة مقاطع أو أكثر قبل ترنسفكأيشن. في يوم ترنسفكأيشن (اليوم 1)، 3 × 10⁶ إكسبى 293^TM تم زرع خلايا / مل وتم نقلها باستخدام البلازميدات pSectag2B المنقى التي تحتوي على شحم الجين. في اليوم الثاني، تمت إضافة المُحسِّن I والمُحسِّن II وزراعتهما حتى اليوم الرابع. في اليوم الرابع، قمنا بنقل وسط الاستزراع إلى زجاجات الحصاد وطردنا بمعدل 2 × g عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. تم جمع الطاف وخلطه مع محلول تحلل 10x (500 ملي مولار NaH₂PO₄، 1.5 مول كلوريد الصوديوم، و 100 ملي مول إيميدازول، الرقم الهيدروجيني = 8) بنسبة 9:1. تمت إضافة الخليط إلى عمود Niken المتوازن الذي يحتوي على 3 مل من حبة agarose Ni-NTA (Qiagen، 30230)، مقابل 30 مل من خليط البروتين، عند 4 درجات مئوية. لإزالة البروتينات غير المحددة، تم غسل العمود باستخدام محلول الغسيل I (50 ملي مولار NaH₂PO₄، 300 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 10 ملي مول إيميدازول، الرقم الهيدروجيني = 8) وعازلة الغسيل II (50 ملي مولار NaH₂PO₄، 300 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 20 ملي إيميدازول، الرقم الهيدروجيني = 8). تم شطف البروتين باستخدام محلول شطف (50 ملي مولار NaH₂PO₄، 300 ملي مول كلوريد الصوديوم و 250 ملي مول إيميدازول، الرقم الهيدروجيني = 8) في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. تم تغيير المخزن المؤقت إلى محلول ملحي بالفوسفات (PBS) باستخدام أنابيب مرشح الطرد المركزي (Merck، UFC801024). تم تأكيد نقاء بروتين eFlaB المؤتلف عن طريق الفصل الكهربي لهلام دوديسيل كبريتات بولي أكريلاميد الصوديوم (SDS-PAGE) وتحليل لطخة غربية لاحقة باستخدام الأجسام المضادة لـ FlaB المتولدة في الفئران باستخدام مساعد Freund الكامل (Sigma، CAS9007-81-2) والمترافق مع HRP. الأجسام المضادة الثانوية متعددة النسيلة المضادة للفأر (داكو، P0260).

مقايسة مراسل NF-κB المعتمدة على TLR5

لقياس النشاط المحفز NF-κB لـ eFlaB مع مجموعة واسعة من تركيزات البروتين (الشكل XNUMX أ). 1c و 2c)، استخدمنا HEK-Blue^TM خلايا hTLR5 (InvivoGen، hκb-htlr-5) مع HEK-Blue^TM أنظمة فحص الكشف (InvivoGen، hb-det2) باتباع بروتوكول الشركة المصنعة. حسبنا المفوضية الأوروبية₅₀ باستخدام قيم OD620 نانومتر ثلاث نسخ لكل تركيز من البروتين. لتحديد النشاط البيولوجي لمتغيرات eFlaB deglycosylated (الشكل التكميلي SXNUMX). 3b) ، أجرينا في المختبر اختبار مراسل NF-κB luciferase باستخدام خلايا HEK293T. تم الحفاظ على خلايا HEK293T في وسط DMEM (Gibco^TM، 11995-065) يشتمل على 10% FBS، 100 وحدة/مل من المضادات الحيوية (جيبكو^TM، 15140122) عند 37 درجة مئوية، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂. تم استخدام ما لا يقل عن 3 مقاطع من الخلايا لفحص مراسل NF-κB. تم زرع الخلايا في 2 × 10⁵/ جيد في 24 لوحة جيدًا (SPL Life Sciences، كوريا، 30024) لمدة 24 ساعة وتم نقلها باستخدام مراسل البلازميد pNFκB-Luc (100 نانوغرام/بئر)، وp3x Flag-hTLR5 (100 نانوغرام/بئر)، و50 نانوغرام/ بئر pCMV-β-Gal باستخدام 5 ميكرولتر/بئر من Effectene (Qiagen، ألمانيا، 301427) طوال الليل. تمت معالجة الخلايا المنقولة باستخدام pFlaB أو eFlaB أو eFlaB المتحور بتركيز متكافئ واحتضانها لمدة 24 ساعة. تمت إزالة الوسائط من الثقافات والخلايا المعالجة باستخدام محلول تحلل الخلايا (Promega، Madison، WI USA، E153A). من lysates الخلية، تم قياس أنشطة وسيفيراز بواسطة مقياس الإضاءة (Berthold، Lumat-Plus LB96V).

إزالة التحلل من eFlaB عن طريق علاج الإنزيم

تمت إزالة الغليكوزيل من eFlaB بواسطة إنزيم Peptide N-glycosidase F (PNGase F) (Promega، Madison، WI USA، V483A) باستخدام نموذج غير متغير بعد بروتوكول الشركة المصنعة. باختصار، تمت إضافة PNGase F (10 U/μl) إلى eFlaB (15 ميكروغرام) وحضنت عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.

التنبؤ بموقع N-Glycosylation

لقد توقعنا مواقع N-glycosylation لـ FlaB باستخدام NetNGlyc-1.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0) ، وهي أداة معلوماتية حيوية تحدد تسلسل توافق N-glycosylation Asn-Xaa-Ser/Thr.

الطفرات موقع الموجه

الطفرات الموجهة للموقع eflaB تم تنفيذه وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة (Enzynomics, Inc.، Daejeon، Republic of Korea، EZ004M). باختصار، تحتوي على البلازميد pSectag2B eflaB تم استخدام الجين كقالب لتفاعل PCR مع بادئات محددة (الجدول التكميلي XNUMX). 2) مصمم للتحول من "AAC" أو "AAT" (Asparagine، N) إلى "GCC" أو "GCT" (Alanine، A). المتحورة eflaB تم تأكيد التسلسل بواسطة نظام Macrogen للتسلسل عبر الإنترنت (http://dna.macrogen.com/kor/).

الهطول المناعي المشترك (Co-IP)

باختصار، قمنا بنقل خلايا HEK293T باستخدام البلازميد p3XFlag-hTLR5 لمدة 24 ساعة. تم إفساد الخلايا باستخدام RIPA العازلة التي تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني، بعد أن قمنا بإصدار صوتنة ثم طردنا مركزيًا لجمع المادة الطافية. البروتينات، pFlaB، eFlaB، eFlaB^{N83/101/139أ}و إي فلاب^{N83/101/139/273/330A}، تم خلطها مع طاف، بالتناوب عند 4 درجات مئوية خلال الليل (المجمع I). في الوقت نفسه، قمنا بخلط بروتين A/G plus-agarose (Santa Cruz Biotechnology، sc-2003) مع جسم مضاد لعلامة مكافحة العلم (Abcam، ab1162؛ تخفيف 1:40) وقمنا بتدويره عند 4 درجات مئوية طوال الليل ( المجمع الثاني). بعد ذلك، قمنا بغسل المركب II باستخدام محلول IP مؤقت (1% TritonX-100، 25 مللي مولار Tris pH 7.5، 10% جلسرين، 150 مللي مولار كلوريد الصوديوم، 1 مللي مولار DTT، 1 مللي مولار EDTA، ومثبط الأنزيم البروتيني) 5 مرات. بعد ذلك، قمنا بخلط المركب I مع II وقمنا بتدويره عند 4 درجات مئوية لمدة 6 ساعات. أخيرًا، قمنا بغسل المجمع باستخدام محلول IP المؤقت خمس مرات لإزالة بروتينات الربط غير المحددة. بعد الغسيل، أضفنا 50 ميكرولتر من 1x SDS عازلة التحميل وقمنا بغليها لمدة 10 دقائق. تم تحليل SDS-PAGE ولطخة غربية أخرى. لقد استخدمنا جسمين مختلفين من الأجسام المضادة، مضاد الفأر المضاد لـFlaB (التخفيف 1:2,000)، ومضاد Myc-HRP (Novex®، 46-0709؛ التخفيف 1:2,000)، لفحص اللطخة الغربية للكشف عن متغيرات pFlaB وeFlaB، على التوالي. ، نظرًا لأن بروتينات eFlaB منخفضة الكشف عن مضادات FlaB بسبب الغليكوزيل على eFlaB منذ أن تم التعبير عن متغيرات eFlaB جنبًا إلى جنب مع Myc-tag ، والتي تم اكتشافها جيدًا بواسطة anti-Myc (الشكل XNUMX ب). 2d).

Concanavalin عمود لتحليل البروتينات N-glycosylated

لقد فحصنا ما إذا كانت eFlaBs الغليكوزيلاتي فقط هي التي ترتبط بـ concanavalin A (ConA) باستخدام مجموعة ConA Glycoprotein Isolation Kit (Thermo Scientific، USA، 89804) باتباع بروتوكول الشركة المصنعة. باختصار، قمنا بإدخال ملاط ​​راتنجات ConA lectin في عمود الدوران وأجهزة الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 1 × g لشطف الراتنج ثلاث مرات مع عازلة ملزمة / الغسيل. تم تخفيف البروتينات في محلول ربط / غسيل 200 ميكروغرام في 500 ميكرولتر، وتم خلطها مع الراتنج في العمود، وتم تدويرها عند درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. تم بعد ذلك الطرد المركزي للعمود لمدة دقيقة واحدة عند 1 × g لإزالة البروتين غير المنضم. تم غسل الراتينج الموجود في العمود باستخدام محلول ربط/غسيل عدة مرات، وتم إضافة 100 ميكرولتر من محلول الشطف المنظم، ثم تدوير العمود لمدة 5 دقائق عند درجة حرارة الغرفة. تم الطرد المركزي للعمود مرة أخرى لمدة دقيقة واحدة عند 1 × g لحصاد البروتينات المحذوفة. تم تحليل البروتينات غير المرتبطة والمحذوفة (المرتبطة بـ ConA) بواسطة SDS-PAGE.

التحصين داخل الأنف

تم تكييف فئران BALB / c البالغة من العمر سبعة أسابيع (ORIENT، Seongnam-si، Gyeonggi-do، Korea) في منشأتنا لمدة أسبوع واحد قبل متابعة التجارب. تم حقن الفئران تحت الجلد بمزيج من Zoletil® 50 (شركة Virbac، كاروس، فرنسا) وRompun^TM (شركة إلانكو لصحة الحيوان الكورية المحدودة). بعد تخدير الفئران، قمنا بإعطائها عن طريق الأنف باستخدام PBS، ومستضد H1N1 المقسم فقط (sH1N1) (Green Cross، Hwasun، كوريا)، sH1N1+pFlaB، sH1N1+eFlaB، sH1N1+eFlaB^N83A، sH1N1+eFlaB^N83/101A، sH1N1+eFlaB^{N83/101/139أ}، sH1N1+eFlaB^{N83/101/139/273A}وsH1N1+eFlaB^{N83/101/139/273/330A}. تم تخفيف مستضدات اللقاح في برنامج تلفزيوني إلى الحجم النهائي البالغ 20 ميكرولتر / فأر، وهو ما يتوافق مع جرعة sH1N1 0.2 ميكروغرام / فأر وpFlaB أو eFlaB 4 ميكروغرام / فأر. تم تحصين الفئران ثلاث مرات بفاصل أسبوعين، وبعد أسبوعين من التحصين النهائي تم أخذ الأمصال لفحصها.

مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)

تم قياس استجابات الأجسام المضادة الخاصة بـ sH1N1 وpFlaB وeFlaB بواسطة ELISA باستخدام مصل الفئران الذي تم جمعه بعد أسبوعين من التحصين النهائي عن طريق النزيف المداري الرجعي. كانت ألواح ELISA (مختبرات كورنينج، 3690) مغلفة بـ sH1N1 (4 ميكروجرام/مل)، أو pFlaB، أو eFlaB (1 ميكروجرام/مل) في PBS عند 4 درجات مئوية خلال الليل وتم حظرها باستخدام المخزن المؤقت [1 مم من EDTA (JUNSEI، 17385S0401) و 0.5% من جيش صرب البوسنة (سيجما، A2153-50G) في برنامج تلفزيوني-T] لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (RT). تم تخفيف المصل بشكل متسلسل في عرقلة المخزن المؤقت وإضافة 40 ميكرولتر / بئر وحضنت عند درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. تم غسل الألواح 2 مرات وأضيف الجسم المضاد IgG الثانوي المضاد للفأر المصاحب لـ HRP (Southern Biotech، 5-1036؛ التخفيف 05: 1) عند درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد الغسيل 2,000 مرات، تم تطوير الإشارة عن طريق إضافة ركيزة رباعي ميثيل بنزيدين (TMB) 1'5' (BD OptEIA, 3,3) وإيقاف التفاعل بإضافة 5,5 NH₂SO₄. تم قياس الامتصاص عند 450 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة ميكروية (Molecular Devices Corp.، Menlo Park، CA). تم حساب عيار الجسم المضاد كقيمة Log2 المتبادلة لتخفيف المصل والتي أسفرت عن قيم امتصاص أعلى بمقدار ضعفين من البئر الفارغ.

ملخص التقارير

مزيد من المعلومات حول تصميم البحوث متاح في ملخص أبحاث أبحاث الطبيعة مرتبطة بهذه المادة.

• محتوى مدعوم من تحسين محركات البحث وتوزيع العلاقات العامة. تضخيم اليوم.
• PlatoData.Network Vertical Generative Ai. تمكين نفسك. الوصول هنا.
• أفلاطونايستريم. ذكاء Web3. تضخيم المعرفة. الوصول هنا.
• أفلاطون كربون، كلينتك ، الطاقة، بيئة، شمسي، إدارة المخلفات. الوصول هنا.
• أفلاطون هيلث. التكنولوجيا الحيوية وذكاء التجارب السريرية. الوصول هنا.
• المصدر https://www.nature.com/articles/s41541-023-00738-3