بيان أخلاقي

تم إجراء الدراسات على الحيوانات وفقًا للتوصيات الواردة في دليل رعاية واستخدام حيوانات المختبر التابعة للمعاهد الوطنية للصحة. تمت الموافقة على البروتوكولات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية في كلية الطب بجامعة واشنطن (رقم الضمان A3381-01).

الإحصاء والتكاثر

لم يتم استخدام أي طريقة إحصائية لتحديد حجم العينة مسبقًا. تم استخدام الخبرة السابقة في تقنيات القياس ونطاقاتها الديناميكية لتحديد أحجام العينات. تجارب واسعة النطاق (على سبيل المثال، التين. 2 و 4) لم يتم تكرارها في تجربة منفصلة في مجملها، ولكن تم تكرار الظروف العليا بشكل مستقل في تجارب منفصلة مع نتائج مطابقة. تم تكرار التجارب الأخرى عمومًا في تجربة منفصلة مرة واحدة على الأقل، وكانت النتائج مطابقة للبيانات الواردة في هذا العمل. لم تكن التجارب عشوائية لأنه لم يتم إجراء أي دراسات على الحيوانات أو تجارب سريرية لتقييم التدخل الطبي. لم يتعمد الباحثون التخصيص أثناء التجارب وتقييم النتائج لأنه لم يتم إجراء أي دراسات على الحيوانات أو تجارب سريرية. تكرار واحد لعينة التحكم في البيانات المتعلقة بالشكل XNUMX. 4 تم استبعاده من التحليل بسبب خطأ في التعامل مع السائل. يتم تضمين النسخة المتماثلة في بيانات المصدر ويتم شرحها على أنها مستبعدة.

اعتبرت العينات مختلفة عن الخلفية إذا ظهرت p <0.05 في اختبار t على الوجهين وكانت قيمته تتجاوز حد الاكتشاف (متوسط ​​الخلفية ± 3x الانحراف المعياري لقياس الخلفية). إجراء معدل الاكتشاف الكاذب لبنجاميني وهوشبيرج⁵⁰ تم استخدامه لتصحيح الاختبارات المتعددة. تم إجراء التحليلات الإحصائية في بيثون. تم إجراء اختبارات t على الوجهين (عينة ثنائية الذيل، يفترض تباينًا متساويًا) باستخدام حزمة scipy وتم تنفيذ إجراء FDR باستخدام حزمة statsmodels مع معدل خطأ عائلي قدره 5٪. لفحص الأجسام المضادة، تم استخدام العينات التالية كمقياس للخلفية، واستخدمت البيانات المجمعة في اختبار t. التجميع: لا يوجد DNA وخرز يتحكم فيه فقط. ربط S6P: لا يوجد DNA أو خرز يتحكم فيه فقط. ربط RBD: لا يوجد DNA أو خرز يتحكم فيه فقط. مسابقة ACE2: لا يوجد DNA وαHER2.

تم حساب معاملات ارتباط بيرسون باستخدام GraphPad Prism 9.

تطبيقات الكمبيوتر

تم تحليل تسلسلات BCR أحادية الخلية باستخدام Cell Ranger v3.1.0. تم تحليل بيانات AlphaLISA باستخدام Prism 9.5.1. تمت معالجة الصور باستخدام ImageJ2 v2.9.0/1.53t. تمت معالجة بيانات قارئ اللوحة باستخدام Python 3.8.8. لم يكن كود بايثون لتحليل بيانات قارئ اللوحة محوريًا في البحث ولم يتم إيداعه.

تصميم تسلسل الأجسام المضادة sdFab

تم تجميع sdFabs بناءً على نسخة معدلة من البروتوكولات المنشورة مسبقًا^16,17,18. يمكن العثور على أمثلة لخرائط البلازميد الخاصة بـ sdFabs ذات السلسلة الثقيلة والخفيفة aHER2 في بيانات المصدر. تم جمع تسلسلات الأجسام المضادة من الأدبيات وتم تصنيف سلاسلها الخفيفة على أنها إما كابا أو لامدا عبر البقايا الطرفية للجزء J في مجال VL. تم بعد ذلك دمج نطاقي VH وVL مع سلاسلهما الثابتة البشرية الثقيلة (Uniprot P0DOX5) أو الضوء الثابت البشري (kappa CL Uniprot P01834 أو lambda 1 CL Uniprot P0CG04). في النهاية N لنطاقي VH وVL، اخترنا تضمين علامة تعبير معدلة استنادًا إلى أول 5 بقايا من E. كولاي جين الكلورامفينيكول أسيتيل ترانسفيراز متبوعًا بموقع انقسام الأنزيم البروتيني لفيروس حفر التبغ (TEV) (تسلسل البروتين: MEKKIENLYFQS، تسلسل الحمض النووي: atggagaaaaaaaatcgaaaacctgtacttccagagc)⁷⁹ على عكس علامة SKIK المنشورة مسبقًا⁸⁰. تم دمج السلسلة الثقيلة في الوحدة الفرعية LZA heterodimer (AQLEKELQALEKENAQLEWELQALEKELAQK) وعلامة strep II أو علامة super FLAG (sFLAG)⁸¹. تم دمج السلسلة الخفيفة في الوحدة الفرعية LZB heterodimer (AQLKKKLQALKKKNAQLKWKLQALKKKLAQK). الأجسام المضادة في الشاشة في الشكل. 2 تم تصميمها بعلامة strep II على سلسلتها الثقيلة. تسلسل الأجسام المضادة من الشاشات في التين. 3 و 4 تم تصميمها بعلامة sFLAG على سلسلتها الثقيلة. الأجسام المضادة في الشاشة في الشكل. 2 والأجسام المضادة EUA في الشكل XNUMX. 3 تم تصميمها مع فئة السلسلة الخفيفة الأصلية (كابا أو لامدا). الأجسام المضادة في الشاشة في الشكل. 4 وتم تصميم تسلسلات الأجسام المضادة المعادلة على نطاق واسع باستخدام سلسلة كابا الخفيفة، بغض النظر عن فئة السلسلة الخفيفة الأصلية. تم تفصيل أمثلة الأنواع الثلاثة لتسلسلات الأجسام المضادة أدناه، مع تمييز ميزات التسلسل المهمة بين قوسين مربعين [ ].

sdFab strepII ثابت السلسلة الثقيلة الموسومة:

[mekkienlyfqs] [vh_sequence] ] GSSA [WSHPQFEK].

sdFab ثابت السلسلة الثقيلة super FLAG (sFLAG) الموسومة:

[MEKKIENLYFQS][VH_Sequence][ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC]GGGGS[AQLEKELQALEKENAQLEWELQALEKELAQK]GSSA[DYKDEDLL ].

sdFab سلسلة خفيفة كابا:

[MEKKIENLYFQS][VL_Sequence][RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]GGGGS[AQLKKKLQALKKKNAQLKWKLQALKKKLAQK].

سلسلة خفيفة sdFab لامدا 1:

[MEKKIENLYFQS][VL_Sequence][GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS]GGGGS[AQLKKKLQALKKKNAQLKWKLQALKKKLAQK].

تجميع الحمض النووي وتوليد قالب التعبير الخطي (LET).

تم تحسين ترميز البروتينات التي سيتم تصنيعها عبر CFPS باستخدام أداة تحسين كودون IDT وتم طلبها كحمض نووي خطي مزدوج الجديلة يحتوي على مجموعة جيبسون المطلوبة المتدلية من IDT أو GenScript. تم طلب sfGFP الذي يحتوي على مجموعتي pJL1 Gibson المتدليتين. تم طلب الجسم المضاد VH DNA باستخدام pJL1 5 ′ وثابت IgG1 البشري ذو السلسلة الثقيلة 5 ′ Gibson. تم طلب الجسم المضاد VL DNA باستخدام pJL1 5 ′ وسلسلة Ig الخفيفة البشرية kappa أو lambda 1 Gibson. تمت إعادة تعليق الحمض النووي بتركيز 50 نانوغرام / ميكرولتر واستخدم بدون تضخيم.

تم طلب مكونات DNA الخطية الإضافية لتجميع Gibson (العمود الفقري pJL1، ثابت السلسلة الثقيلة sdFab strepII، ثابت kappa لسلسلة الضوء sdFab، ثابت سلسلة sdFab الخفيفة lambda 1) على شكل gblocks من IDT. تم تضخيم هذه المكونات باستخدام PCR باستخدام Q5 Hot Start DNApolymerase (NEB، M0493L) باتباع إرشادات الشركة المصنعة. تمت تنقية الحمض النووي المضخم باستخدام مجموعة DNA Clean and Concentrate (Zymo Research، D4006) وتم تخفيفه إلى تركيز 50 نانوغرام / ميكرولتر. يتم سرد تسلسلات المكونات المستخدمة أدناه، مع الإشارة إلى تسلسلات تجميع جيبسون بواسطة نص صغير تحته خط والبادئات الخاصة بـ amplicon معين مدرجة أسفل تسلسل الحمض النووي.

تراكبات تجميع جيبسون:

pJL1 5' جيبسون: tttgtttaactttaagaaggagatatacat.

pJL1 3' جيبسون: gtcgaccggctgctaacaaagcccgaaagg.

ثابت السلسلة الثقيلة IgG1 البشري 5′ جيبسون: gcgtcaacaaaaaggtccttcagttttcccattagcccct.

سلسلة ضوء Ig البشرية كابا 5' جيبسون: cgcacggtcgcggcgccgtctgtctttattttcctcct.

سلسلة ضوء Ig البشرية لامدا 5' جيبسون: gcccaacccaaagcaaacccaactgtcactttgttcccg.

العمود الفقري البلازميد الخطي pJL1 (Addgene plasmid # 69496):

gtcgaccggctgctaacaaagcccgaaaggآجكتجاجتجكتجكتجككككجكتجاجكاتاكتاكتاجكاتاككككتجججككتكتااكجتكتتتتتجكتجااجككااتكتجاتاجاااااكتكتكجاجكاتكااتجااكتجكاتتاتكاكاتاتكاتتتتجاااجككجتتكتجتاتجاجاااااكتكاككجاجكاجتتككاتاجاتجكاجاتككتج تاتكجتكتجكجاتككجاكتكجتككاكاتكاتاتاكااككتاتاتتتككككتكجتكاااااتاجتاتكااجتاجاجااتكككاتجاجتجاكجاكتجااتككجتجاجااتجكاااااجكتتاتجكاتكتتككاجاكتتجتكاكاجككاجككاتاكجكتكجتكاتكاكاتكاككتجكاتكااككجتاتكاتكاتكجتجاتجككتجاجكجاجاكجااتاككج أتكجكتجتتاااجكااتاكاكاجاتكجاتكجاتككاكجكجكاججاكاكتجككجكجكاتكاكتجااتكاجاجاتاتتكتكتااككتججااتجكتجتتتكككجججاتكجكاجتجتجتاجتااككاتجكاتكاتكاجاجتاكجاتاااااتجكتجاتجتكججاجاججكاتااتككجتكاجككاجتتاجتكتجاككاتكتكاتكتجتاك أتكاتجكاكجكتاككتتتجكاتجتتتكاجاكاكتكتججكجاتكججكتكككاتاكاتكجاتاجاجاتجتكجكاككتجاتجككجاكاتتاتاككجاكككاتاتاتاتاكككاتاتاتاتكاجكاتكاتجتجتجااتتاتككجكتكجاجكاجاكجتكتككجتجااتاتجكتكاتاكاككككتجتاتاكتتتاتجتاجكاجاجاتتتتتتتكاتجا تجاتاتاتتتتتكتجتجكاجتاكاتكاجاجاتتجاجاكاكاكجتجاجاتكااجاتكتكتتتتتتكتتتكتجكجتاتكتجكتجكتجكاااااكاااااااااااااككككجكتاككاجكجتجتجتتتتجكجاتكااجاجكتاككاكتكتتتككجاجتاكتجكتكاجاجكاجاجكجاكاتاككااتكتجتكتكتكتاجتجتاجككجتاجتاج جيككككاكتككاجااككتجتاجكاككجككتاكاتاككتكجكتكتجكتاتاككتجتاتككاجتجكتجكككاجتجكاتاجتكجتجتتكتاككججتتججاكتكااجاكجاتاجتاككججاتااجكجكاجكجتكجججكتجاكجججتكجتجكاكاكاجكككاجكتججاجكجاكجاككتاككجاكتجاجاتاككتاكاجكجتجاجكتاتجاجااجكجك. كاكجكتكككجاجججاجااجكججاكاجتاتككجتاجكجكاججتكججاكاججاجاكجكاكجاجججاجتكتككاجججاااكجككتجتاتكتتاتاجتككتجتكججتكتكجكككتكتجاكتجاجكجتكجاتتتتجاتجكتكجتكاجكتاججااااااااكجككاجكاكجكجاتكككجااتاتاكجاكتكاكت. أتاججاجاككاكاكجتتككتكتاجاجاتاتtttgtttaactttaagaaggagatatacat.

pJL1_F: gtcgaccggctgcta.

pJL1_R: atgtatatctccttcttaaagttaaacaaaattattcta.

تم وضع علامة strepII الثابتة ذات السلسلة الثقيلة sdFab على:

gcgtcaacaaaaaggtccttcagttttcccattagcccctتكتكتاجتكاكتاجتجكجتاكتجككجكتكتججتجتتجتجتااجاتاكتكككاجاككججتاكجتكتكجتجااككتكتجتجكاكتجاكاتكججكجتاكاتاكاتكتكككجاجتتتجكاجتتكتكججاكتجتتكتكتتكتكتجتجتاكاجتكككتاجكتكتكككتججتاكاكاجاككتاكاتجتاتجتاتك. ATAAGCCGAGTAATACTAAGGTGGATAAAAAGTGGAACCGAAGTCTTGTGGTGGTGGCGGTCAGCTCAACTGGAGAAGGAGTTACAGGCACTGGAAAAAGAGAATGCTCAACTTGAGTGGGAATTACAGGCGTTAGAAAAAGAACTGCCCAGAAGGTTCTAGCGCATGGTCACATCCCCAGTTCGAAAAATAAgtcgaccggctgctaacaaagcccgaaagg.

تم وضع علامة Super FLAG الخطية ذات السلسلة الثقيلة الثابتة sdFab على:

gcgtcaacaaaaaggtccttcagttttcccattagcccctتكتكتاجتكاكتاجتجكجتاكتجككجكتكتججتجتتجتجتااجاتاكتكككاجاككججتاكجتكتكجتجااككتكتجتجكاكتجاكاتكججكجتاكاتاكاتكتكككجاجتتتجكاجتتكتكججاكتجتتكتكتتكتكتجتجتاكاجتكككتاجكتكتكككتججتاكاكاجاككتاكاتجتاتجتاتك. ATAAGCCGAGTAATACTAAGGTGGATAAAAAGTGGAACCGAAGTCTTGTGGTGGTGGCGGTCAGCTCAACTGGAGAAGGAGTTACAGGCACTGGAAAAAGAGAATGCTCAACTTGAGTGGGAATTACAGGCGTTAGAAAAAGAACTGCCCAGAAGGGGCCAGTCCAGCAGCTCCTGCGCCTGGCGGGACTACAAAGATGAAGACCTTTTAAgtcgaccggctgctaacaaagcccgaaagg.

IgGC_F: GCGTCAACAAAAGGTCCTTCAGTTTTTC.

pJL1_3′Gib_R: CCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGC.

ثابت سلسلة الضوء sdFab الخطي:

cgcacggtcgcggcgccgtctgtctttattttcctcctتكجتاتجاكاجكتتاآتكتججاكاجكتكتجتجتاتجتتتاتااكاكتتتاككككجتجاججكااجتكاتججااجتاجاكاجكاككتجكااجكجااتتكجكاججاجتكاجتاككجاكاججاتككااجاتاجتاكتاكتككتاككتاجتكاكاتاككتجتكااججكجاكتاتجاااااكاتاججتاتاتجككتجكجاجتا أكتكاتكاججكتاتكاتككككاجتتاكاااااتكتتكاككجتجاجاتجكجكجكججاجتاجكجكجاجتاجكتااااااااااااااااتجكااجكككتتاااااااااااااااااتجككاكتتااتجاجكتجكاجككتتاااااااجااتجكجكاجاجتاgtcgaccggctgctaacaaagcccgaaagg.

kLC_F: تكجكجكجكجتكتج.

pJL1_3′Gib_R: CCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGC.

السلسلة الخفيفة sdFab الخطية لامدا 1 ثابتة:

gcccaacccaaagcaaacccaactgtcactttgttcccgككتكاجكجاججااكتكاجكتاجكتاتاجكككجتجتتتجككتجاتكتكاجكتتتاتتكككجتجككجتاكاجتجكتججاجتكجكاجاتجتتكجككجتكااجكجكجتجاجااكتاكااجككاتكجااكاجتكاجاكاتاتاتجكجكاتكاجتاكتجاكككتاكككاجاكاجتجاجتكاكاككجتكجتاكاجتجتكاجتاكاكاكاك جاججاجتاكاجتجاااجاككجتجككككاكتجااتجتتكاجكجتججتجكتكاجكجاجتتااااجااااككتجكاججكتتجاجااااااااااااااتجكتكاتتااجتجااتجكاجكجتجاجاجااكتجككاجاجتاgtcgaccggctgctaacaaagcccgaaagg.

lLC_F: GGCCAACCCAAAGCAAACC.

pJL1_3′Gib_R: CCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGC.

sfGFP الخطي (نفس تسلسل الحمض النووي مثل Addgene Plasmid # 102634). لاحظ أن تسلسل sfGFP تم تعديله بشكل كبير ويحتوي على طفرات من Bundy et al.⁸².

tttgtttaactttaagaaggagatatacatأتجاجكااججتجاجاكتجتتاككجكجتجتجككجاتكتجتجتجاكتجاتجكجاتجتجاكجتكاكاااااتكاكجتجكجتجتجتجااججتجااجكجاتجككجاتجكاكتجاكجتجااتتاتكتجككككججاكتجكككككجكاكتجكككككجكاكتجككككجككتجككجتككجتجككجاكجكتجاكككتجاككتاتجكجتتكاجتتتتاجتكجكتاتكججاتكاك أتجاااكجتكاكجاتتكتتاآتكتجكاتجككجااجكتاتجتجكاجتاكجاتاجكتتااجاتجاتجكااتاتااكجكجككجتجتجااتتتجاجكجاتاتككتجتجاككجكاتجاكتجااكجككجاتتتتااجاتجكاتاتاككتججككاتاتاكتجااتاكاكتتااتاجككاتاتجتتاتاتاتاكجكججاتااكا جاااااتجكاتكااااجكجااتتتاكجتكجككاتاتاكجتجااجاتجكاجتجكاجكتجكجاتكاتاتكاكجااتاكككجاتجتجتجاتجتككجتجكتجكتجككجاتاتكاتاتكتجاجكاكجكاجاكجتكتجتكتاجاتكجاكجاااااجككاكجكجاككاكاتجتكتجكاكجاكاتاتجتجااتكجكاججتاتاكجتجاجككات كجكجاجتكجاااتاgtcgaccggctgctaacaaagcccgaaagg.

تم استخدام مجموعة جيبسون لتجميع الحمض النووي لإطار القراءة المفتوح للبروتين مع العمود الفقري pJL1 بعد البروتوكول المنشور مع إضافة 3.125 ميكروغرام / مل من ET SSB (NEB، رقم المنتج M2401S)^83,84. تم دمج 20 نانوغرام من العمود الفقري pJL1 الخطي المنقى و 20 نانوغرام من الحمض النووي الثابت الخطي sdFab VH أو VL و 20 نانوغرام من إدراج إطار القراءة المفتوح للبروتين في تفاعلات تجميع جيبسون 2 ميكرولتر واحتضانها عند 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تم تخفيف تفاعلات التجميع غير النقية في 40 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز (Fisher Scientific، AM9937) وتم استخدام 1 ميكرولتر من التفاعل المخفف كقالب لـ PCR لإنشاء قوالب التعبير الخطي (LETs) لـ CFPS. تم تضخيم قوالب التعبير الخطي عبر PCR باستخدام الاشعال pJL1_LET_F (ctgagatacctacagcgtgagc) و pJL1_LET_R (cgtcactcatggtgatttctcacttg) في تفاعل PCR 50 ميكرولتر باستخدام بوليميريز DNA Q5 Hot Start (NEB، M0493L) باتباع إرشادات الشركة المصنعة.

تسلسل الحمض النووي لل P. بيراليس luciferase الذي يحتوي على علامة strepII c-terminal (fLuc، Uniprot Q27758) المستخدمة كعنصر تحكم سلبي موجود أدناه وتم استنساخه في ناقل pJL1.

.

تحضير مستخلص الخلية لتخليق البروتين الخالي من الخلايا

E. كولاي اوريغامي^TM تم إعداد مقتطفات B (DE3) (Novagen، 70837) باستخدام نسخة معدلة من البروتوكولات المعمول بها^85,86. باختصار، 150 مل اوريغامي^TM تم تلقيح ثقافة البادئ B (DE3) في LB من مخزون الجلسرين وتم تربيتها في دورق محير سعة 250 مل عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. تم تحضير 2xYTP بدون الجلوكوز بنسبة 75% من الحجم النهائي وتعقيمه باستخدام الأوتوكلاف. تم تحضير محلول الجلوكوز 4x وتعقيمه بشكل منفصل، ثم إضافته إلى الوسط مباشرة قبل الاستخدام. تم استخدام الثقافات البادئة لتطعيم 1 لتر من وسائط 2xYTPG (16 جم / لتر تريبتون، 10 جم / لتر خلاصة الخميرة، 5 جم / لتر كلوريد الصوديوم، 7 جم / لتر فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة، 3 جم / لتر فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة، 18 جم/لتر جلوكوز) في دورق اهتزاز كامل يربك Tunair سعة 2.5 لتر عند OD600 أولي قدره 0.08. تم استزراع الخلايا عند 37 درجة مئوية عند 220 دورة في الدقيقة في حاضنة تهتز. نمت الثقافات حتى OD600 0.4-0.6، وعند هذه النقطة تم تحفيز التعبير عن بوليميريز T7 RNA بإضافة IPTG إلى تركيز نهائي قدره 0.5 مم. تم حصاد الخلايا عند OD600 2.5 عن طريق الطرد المركزي عند 12,000 × g لمدة 1 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تم غسل كريات الخلية ثلاث مرات باستخدام 25 مل من محلول S30 لكل ثقافة 50 مل (10 ملي مولار من خلات تريس 8.2 و 14 ملي مولار من أسيتات المغنيسيوم و 60 ملي مولار من خلات البوتاسيوم). تمت إعادة تعليق الكريات في 1 مل من محلول S30 لكل جرام من كتلة الخلية. تم تعليق الخلايا باستخدام تمرير واحد على جهاز الخالط Avestin EmulsiFlex-B15 عند ضغط تحلل يبلغ 24,000 رطل لكل بوصة مربعة. تم فصل حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي عند 18,000 × g لمدة 20 دقيقة، ويتم جمع المحللة الموضحة، وتجميدها في النيتروجين السائل، وتخزينها عند -80 درجة مئوية.

تفاعلات تخليق البروتين الخالية من الخلايا

تتألف تفاعلات CFPS من الكواشف التالية: 8 ملي مولار من غلوتامات المغنيسيوم، 10 ملم من غلوتامات الأمونيوم، 130 ملم من غلوتامات البوتاسيوم، 1.2 ملم من ATP، 0.5 ملم من كل CTP، GTP، وUTP. 0.03 ملغم/مل حمض الفولينيك، 0.17 ملغم/مل E. كولاي MRE600 tRNA (Roche 10109541001)، 100 مم NAD، 50 مم CoA، 4 مم حمض الأكساليك، 1 مم بوتريسين، 1 مم سبيرميدين، 57 مم HEPES درجة الحموضة 7.2، 2 مم من كل حمض أميني، 33.3 مم PEP، 20٪ v / v E. كولاي استخراج، وتركيزات متفاوتة من قالب الحمض النووي، والباقي من الماء. وقد تم وصف إعداد هذه الكواشف بالتفصيل في مكان آخر⁸⁷. بالنسبة لقوالب الحمض النووي، تم استخدام البلازميدات بتركيز 8 نانومتر، واستخدمت منتجات PCR الخطية غير النقية بنسبة 6.66% (حجم/حجم). للتعبير عن الأجسام المضادة، تمت إضافة كل قالب إلى تركيز نهائي قدره 6.66% (حجم/حجم). بالنسبة للجسم المضاد وتعبير sdFab، تمت إضافة 4 مم من الجلوتاثيون المؤكسد، و1 مم من الجلوتاثيون المخفض، و14 ميكرومتر من DsbC المنقى، و50 ميكرومتر FkpA أيضًا إلى التفاعلات. بالإضافة إلى ذلك، بالنسبة لأكسدة تفاعلات CFPS، تمت معالجة مستخلصات الخلايا بـ 500 ميكرومتر من اليود أسيتاميد (IAM) في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة قبل استخدامها في CFPS.⁸⁸. تم تجميع جميع مكونات التفاعل على الجليد وتم تشغيلها إما كتفاعلات 12 ميكرولتر في أنابيب دقيقة سعة 1.5 مل أو تفاعلات 2 ميكرولتر في 384 لوحة جيدة (BioRad، HSP3801). بالنسبة لتفاعلات 2 ميكرولتر، تم نقل المكونات إلى اللوحة باستخدام معالج السائل الصوتي Echo 525. تم الاستغناء عن مزيج يحتوي على جميع مكونات CFPS باستثناء الحمض النووي من لوحات 384PP Plus (Labcyte، PPL-0200) باستخدام إعداد BP. تم الاستغناء عن الحمض النووي (منتجات PCR غير النقية) من لوحة 384LDV Plus (Labcyte، LPL-0200) باستخدام إعداد GP. تم السماح للتفاعلات بالمضي قدمًا عند 30 درجة مئوية لمدة 20 ساعة.

القياس الكمي لتفاعلات تخليق البروتين الخالي من الخلايا

لقياس مضان sfGFP، تم إعداد منحنى قياسي باستخدام الأساليب المبلغ عنها مسبقًا⁸⁶. تمت إضافة الليوسين المشع إلى CFPS بتركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر من L- [14C (U)] - ليوسين (Perkin Elmer NEC279E250UC، 11.1GBq / mMole)، يليه ترسيب البروتينات المعبر عنها وحساب التلألؤ.⁸⁹. لقياس مضان sfGFP، تم تخفيف 2 ميكرولتر من تفاعل CFPS في 48 ميكرولتر من الماء في لوحة Black Costar 96 Well Half Area Plate. تم قياس الإسفار باستخدام BioTek Synergy^TM قارئ لوحة H1 مع أطوال موجية للإثارة والانبعاث تبلغ 485 و528 على التوالي. كانت أعداد التلألؤ والفلورة مناسبة لتحديد المنحنى القياسي للاستخدام مع العينات غير المشعة.

لتصور تجميع الأجسام المضادة، تم تصنيف البروتينات خلال CFPS باستخدام FluoroTect^TM (بروميجا، L5001). FluoroTect^TM تم تضمينه في تفاعل CFPS عند 3.33% حجم/حجم. بعد تخليق البروتين، تمت إضافة RNAseA (Omega Bio-Tek، AC118) إلى 0.1 مجم / مل وتم تحضين العينة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. تم دمج 3 ميكرولتر من خليط CFPS وRNAseA مع مخزن تحميل مؤقت 4x (LiCor، 928-40004) وتم تغيير طبيعة العينات لاحقًا عند 70 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، ثم تم فصلها عبر SDS-PAGE وتم تصويرها باستخدام LI-COR Odyssey Fc. تصوير على قناة 600. تم إجراء قياس الكثافة باستخدام برنامج ImageJ.

تعبير وتنقية DsbC و FkpA

تم إجراء تعبير البروتين وتنقيته وإزالة علاماته بشكل مشابه لما تم الإبلاغ عنه سابقًا⁷⁷. تم طلب DsbC (Uniprot P0AEG6، البقايا 21–236) وFkpA (Uniprot P45523، البقايا 26–270) كـ gBlocks من IDT تحتوي على محطة c، TEV قابل للانقسام علامته (GSENLYFQSGSHHHHHHHHHH) وتم استنساخه في pET28a. تتوفر خرائط البلازميد لكل من DsbC وFkpA في بيانات المصدر. تم تحويل البلازميدات إلى BL21 Star^TM DE3، مطلي على أجار LB، ومثقف بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية. تم تلقيح 1 لتر من Overnight Express TB (Fisher Scientific، 71491-4) عن طريق كشط جميع المستعمرات على لوحة التحويل وزراعتها عند 37 درجة مئوية في قوارير Tunair سعة 2.5 لتر (IBI Scientific، SS-8003) عند 220 دورة في الدقيقة طوال الليل. تم حصاد الخلايا وإعادة تعليقها بنسبة 1 جم من كتلة الخلية إلى 4 مل من محلول إعادة التعليق (50 ملي مولار HEPES درجة الحموضة 7.5، 500 ملي مول كلوريد الصوديوم، مثبط الأنزيم البروتيني 1X HALT بدون EDTA (Fisher Scientific، 78429)، 1 مجم / مل ليسوزيم، 62.5 يو / مل تعليق خلية البنزوناز (Sigma-Aldrich، E1014-25KU)) وتم تفكيكه باستخدام جهاز الخالط Avestin B15 بسرعة 24,000 رطل لكل بوصة مربعة. تم نسج المحللة بمقدار 14,000 × g لمدة 10 دقائق وتم تحضين المادة الطافية الموضحة باستخدام Ni-NTA Agarose (Qiagen، 30230) لمدة 60 دقيقة على شاكر طرفي. تم نسج الراتينج بمقدار 2500 لتر × g لمدة دقيقتين، تمت إزالة المادة الطافية، وتم إعادة تعليقها في محلول الغسيل (2 مم HEPES pH 50، 7.5 مم كلوريد الصوديوم، 500 مم إيميدازول)، محملة على عمود تدفق الجاذبية، ثم تم غسلها بعد ذلك بكميات راتينج 50X من عازلة الغسيل. تمت شطف البروتين باستخدام محلول الشطف (20 ملي مولار HEPES درجة الحموضة 50، 7.5 ملم كلوريد الصوديوم، 500 ملم إيميدازول) وتم استبداله إلى 500 ملم HEPES درجة الحموضة 50، 7.4 ملم كلوريد الصوديوم باستخدام أعمدة تحلية PD-150 (Cytvia، 10-17-0851) وفقًا لـ تعليمات الشركة المصنعة.

تمت إزالة علاماته عن طريق الانقسام بواسطة ProTEV Plus (Promega، V6102). قبل الانقسام، تمت إضافة 10% v/v الجلسرين إلى البروتين. تمت إضافة ProTEV Plus إلى تركيز 0.5 U / ميكروغرام من البروتين المنقى وأضيف DTT إلى تركيز 1 مم. وأجريت تفاعلات الانقسام عند 30 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. تمت إزالة علامته وProTEV Plus عن طريق الحضانة باستخدام Ni-NTA Agarose لمدة ساعة واحدة عند 1 درجات مئوية وجمع المادة الطافية. تم تركيز البروتينات لاحقًا إلى> 4 مجم / مل (Millipore، UFC1). تم التحقق من صحة إزالة علامته عبر SDS-PAGE ومجموعة الكشف AlphaScreen Histidine (Nickel Chelate) (Perkin Elmer، 800396C).

تفاعلات ألفاليزا

تم إجراء تفاعلات AlphaLISA في 50 ملي HEPES pH 7.4 و 150 ملي كلوريد الصوديوم و 1 ملغ / مل BSA و 0.00015 فولت / حجم TritonX-100 (يشار إليه فيما يلي باسم Alpha buffer). تم توزيع جميع المكونات باستخدام معالج سائل Echo 525 من صفيحة ميكروية 384-Well Polypropyne 2.0 Plus (Labcyte، PPL-0200) باستخدام نوع السائل 384PP_Plus_GPSA. تم تحضير جميع مكونات تفاعلات AlphaLISA كمخزون 4x وإضافتها بمقدار 0.5 ميكرولتر إلى تفاعل 2 ميكرولتر النهائي لتحقيق التركيز المطلوب. تم إجراء جميع تفاعلات AlphaLISA باستخدام تفاعلات CFPS المخففة إلى تركيز نهائي قدره 0.025 فولت / حجم. تم الجمع بين حبات AlphaLISA لإعداد مخزون 4X في المخزن المؤقت Alpha مباشرة قبل الاستخدام وإضافته إلى البروتينات للحصول على تركيز 0.08 ملغم / مل من الخرز المانح و0.02 ملغم / مل من الخرز المتقبل في التفاعل النهائي. تم تحضين جميع التفاعلات بخرز AlphaLISA لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل القياس. تم إجراء قياسات AlphaLISA على قارئ لوحة Tecan Infinite M1 Pro باستخدام مرشح AlphaLISA مع وقت إثارة قدره 1000 مللي ثانية، ووقت تكامل قدره 100 مللي ثانية، ووقت تسوية قدره 300 مللي ثانية. قبل القياس، سمح للوحات بالتوازن داخل الجهاز لمدة 20 دقائق. بالنسبة للقياسات التي تتضمن sdFabs، تم تجنب حبات البروتين A AlphaLISA نظرًا لقدرة البروتين A على ربط المجموعة الفرعية البشرية VH10 Fabs⁹⁰.

تم تحديد تأثير كواشف CFPS على AlphaLISA عن طريق تخفيف الكواشف المحددة بشكل تسلسلي في المخزن المؤقت Alpha ودمجها مع شروط AlphaLISA المحددة. تم استخدام مجموعة TrueHits (Perkin Elmer، AL900) لتقييم تأثير كواشف CFPS على كيمياء اكتشاف ألفا. تم خلط كواشف CFPS مع الخرز المانح والمتقبل واحتضانها لمدة ساعتين قبل القياس. تم استخدام RBD (Sino Biological، 2-V40592H) وFC البشري الموسوم بـ ACE08 البشري (GenScript، Z2) لتقييم تأثير كواشف CFPS على كيميائيات الالتقاط. تم تخفيف RBD وACE03484 في محلول ألفا، وتم خلطهما بتركيز تفاعل نهائي قدره 2 نانومتر لكل منهما، بالإضافة إلى كواشف CFPS، وتم السماح باحتضانهما لمدة ساعة واحدة. تمت بعد ذلك إضافة حبات الجهات المانحة والمتقبلة والسماح لها باحتضانها لمدة ساعة أخرى قبل القياس. تم استخدام حبات البروتين A Alpha المانحة (Perkin Elmer، AS10)، وحبات متقبل Ni-Chelate AlphaLISA (Perkin Elmer، AL1)، وحبات متقبل AlphaLISA المضادة لـ 102xhis (Perkin Elmer، AL108) للكشف.

تم إجراء تجربة المنافسة التجارية للأجسام المضادة المعادلة ACE2 مع الأجسام المضادة التالية: nAb1 (Acro Biosystems، SAD-S35)، nAb2 (Sino Biological، 40592-MM57)، nAb3 (Sino Biological، 40591-MM43)، nAb4 (Sino Biological، 40592) -R001). إليسا آي سي₅₀ تم تسجيل القيم من صفحة المنتج في وقت الشراء وتحويلها إلى ميكروغرام / مل بافتراض أن MW يبلغ 150,000 دا إذا تم الإبلاغ عنها في M. وتم تخفيف الأجسام المضادة بشكل تسلسلي في محلول ألفا وخلطها مع SARS-CoV-2 RBD (Sino Biological، 40592). -V02H) بتركيز 10 نانومتر في التفاعل النهائي وحضنت لمدة ساعة واحدة. تمت إضافة Mouse FC الموسوم بـ ACE1 البشري (Sino Biological، 2-H10108H) لاحقًا واحتضانه لمدة ساعة واحدة، تليها إضافة متزامنة للخرز المستقبل والمانح. تم إجراء اكتشاف AlphaLISA باستخدام حبات Anti-Mouse IgG Alpha Donor (PerkinElmer، AS05) وحبات Strep-Tactin AlphaLISA Acceptor (PerkinElmer، AL1). إيك₅₀ تم حساب القيم باستخدام Prism 9 عن طريق ملاءمة البيانات المقيسة مع [المثبط] مقابل الاستجابة - المنحدر المتغير (أربعة معلمات) الذي يتناسب مع الحد الأقصى المقيد بقيمة 1.

بالنسبة لجميع تجارب فحص الأجسام المضادة، تم وصف الكواشف المختلفة وشروط AlphaLISA المستخدمة في الجدول التكميلي 2. تم إجراء قياسات AlphaLISA المختلفة كما هو موضح أدناه.

تتكون تفاعلات التجميع AlphaLISA من sdFab معبرًا عن CFPS وإما الجسم المضاد لسلسلة خفيفة من Rabbit Anti-Human kappa (Abcam، ab125919) أو سلسلة خفيفة من Rabbit Anti-Human lambda (Abcam، ab124719). تم خلط تفاعل CFPS الذي يحتوي على sdFab محل الاهتمام مع الجسم المضاد المناسب لسلسلة الضوء وتم السماح له بالتوازن لمدة ساعتين قبل الإضافة المتزامنة للخرز المستقبل والمانح.

تتكون تفاعلات AlphaLISA الملزمة لـ SARS-CoV-2 S6P من sdFab معبرًا عن CFPS وتم خلط تفاعل SARS-CoV-2 S6P CFPS الذي يحتوي على sdFab محل الاهتمام مع S6P وتم السماح له بالتوازن لمدة ساعتين قبل الإضافة المتزامنة للمستقبل والمتبرع خرز.

تتكون تفاعلات AlphaLISA المرتبطة بـ SARS-CoV-2 RBD من sdFab معبرًا عن CFPS وSARS-CoV-2 RBD. تم خلط تفاعل CFPS الذي يحتوي على sdFab المثير للاهتمام مع RBD وتم السماح له بالتوازن لمدة ساعتين قبل الإضافة المتزامنة للخرز المتقبل والمانح.

تتألف تفاعلات AlphaLISA من منافسة ACE2 وRBD من sdFab الذي يعبر عن CFPS، وACE2 البشري، وSARS-CoV-2 S6P. تم خلط تفاعل CFPS الذي يحتوي على sdFab محل الاهتمام أولاً مع S6P وتم السماح له بالاحتضان لمدة ساعة واحدة. وفي وقت لاحق، تمت إضافة ACE1 وسمح له بالتوازن لمدة ساعة أخرى قبل الإضافة المتزامنة للخرز المتقبل والمانح.

بالنسبة لمتغير SARS-CoV-2 والتجارب الأخرى المرتبطة بفيروس كورونا غير المرتبط بـ SARS-CoV-2، تم إجراء قياسات AlphaLISA بنفس الطريقة الموصوفة لـ SARS-CoV-2 S6P. تم استخدام البروتينات التالية ذات العلامات Hisx6. SARS-CoV-2 S6P (Acro Biosystems, SPN-C52H9)، SARS-CoV-2 S6P Alpha/ B.1.1.7 (هدية من لورين كارتر في معهد تصميم البروتين بجامعة واشنطن، تم التعبير عنه وتنقيته كما هو موصوف في مكان آخر⁷⁷)، SARS-CoV-2 S6P Beta/B.1.351 (هدية من لورين كارتر في معهد تصميم البروتين بجامعة واشنطن، تم التعبير عنها وتنقيتها كما هو موضح في مكان آخر⁷⁷)، SARS-CoV-2 S6P Gamma/P.1 (هدية من لورين كارتر في معهد تصميم البروتين بجامعة واشنطن، تم التعبير عنها وتنقيتها كما هو موضح في مكان آخر⁷⁷)، SARS-CoV-2 S6P Delta/B.1.617.2 (AcroBiosystems، SPN-C52He)، SARS-CoV-2 S6P Omicron/BA.1 (AcroBiosystems، SPN-C52 هرتز)، SARS-CoV-2 S6P Omicron/ BA.2 (AcroBiosystems، SPN-C5223)، SARS-CoV-2 S6P Omicron/BA.2.12.1 (AcroBiosystems، SPN-C522d)، SARS-CoV-2 S6P Omicron/BA.4/5 (AcroBiosystems، SPN- C522e)، SARS-CoV S2P (AcroBiosystems، SPN-S52H6)، MERS-CoV S2P (AcroBiosystems، SPN-M52H4)، HCoV-HKU1 S (AcroBiosystems، SPN-H52H5)، HCoV-OC43 S (AcroBiosystems، SPN-H52 هرتز) و HCoV-NL63 S (AcroBiosystems، SPN-H52H4)، وHCoV-229E S (AcroBiosystems، SPN-H52H3).

في تجارب المعايرة المنافسة لـ ACE2 المعتمدة على الجرعة، تم تحضين تفاعلات CFPS مع SARS-CoV-2 RBD لمدة ساعة واحدة تليها إضافة التركيز المحدد (شقين مخفف تسلسليًا من 1 نانومتر) من ACE100 البشري. تم تحضين جميع المكونات الثلاثة لمدة ساعة إضافية قبل الإضافة المتزامنة لخرز AlphaLISA. تم تحضين التفاعلات لمدة ساعتين قبل القياس.

بالنسبة لتجارب التجسير RBD وACE2، تم تحضين SARS-CoV-2 RBD، وACE2 البشري، والتخفيف المحدد لـ CFPS (شقين مخفف تسلسليًا من 0.025 فولت/حجم) لمدة ساعة واحدة قبل الإضافة المتزامنة لخرز AlphaLISA. تم تحضين التفاعلات لمدة ساعتين قبل القياس.

تحصين الفأر وتلطيخ الخلايا وفرزها

تم شراء أنثى C57BL/6 (السلالة: 000664) من مختبر جاكسون. تم تحصين الحيوانات البالغة من العمر ستة أسابيع بـ 10¹⁰ الجسيمات الفيروسية (vp) لـ ChAd-SARS-CoV-2-S⁷³ في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني عن طريق الحقن العضلي في الساق الخلفية. تم جمع الغدد الليمفاوية الأربية بعد 10 أيام ومعالجتها في تعليق خلية واحدة. تم تلوين الخلايا بارتفاع SARS-CoV-2 المؤتلف بيولوجيًا (S2P) لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية ثم تم غسلها مرتين باستخدام محلول FACS متبوعًا بتلطيخ بمضاد CD19 BV421 (BioLegend # 115537)، ومضاد CD4 FITC (BioLegend # 100405). ) ، ومضاد IgD-PE-Cy7 (BioLegend # 405719)، وStreptavidin APC (BioLegend # 405207)، وصبغة حيوية الخلايا المائية (Invitrogen L34957)، وكتلة CD16/CD32 Fc المضادة للفأر (BioLegend # 156607). تم فرز الخلايا B النشطة الإيجابية سبايك (القميص الحي CD4- CD19 + IgDlo Streptavidin +) بكميات كبيرة على فارز BD FACSAriaII.

إعداد مكتبة RNA-seq أحادية الخلية وتسلسلها

تم استخدام مجموعات علم الجينوم 10x التالية لإعداد المكتبات: مكتبة Chromium Single Cell 5 ′ وGel Bead Kit v2 (PN-1000006)، Chromium Single Cell A Chip Kit (PN-1000152)، Chromium Single Cell V(D)J Enrichment Kit وخلية الماوس B (96rxns) (PN-1000072)، ومجموعة الفهرس الفردي T (PN-1000213). وأعقب جيل GEM والتشفير الشريطي إعداد [كدنا] ثم رد فعل GEM RT وخطوات تنظيف الخرزة. تم تضخيم [كدنا] المنقى لمدة 10-14 دورة ثم تنظيفها باستخدام حبات SPRIselect. تم تحديد تركيز [كدنا] عن طريق تشغيل عينات على Bioanalyzer. تم إجراء التخصيب المستهدف لـ BCR على [كدنا] كامل الطول متبوعًا بإعداد مكتبات BCR على النحو الموصى به في دليل المستخدم 10x Genomics Chromium Single Cell V(D)J Reagent Kits (v1 Chemistry). تم تسلسل مكتبات cDNA على Novaseq S4 (Illumina)، مستهدفًا عمق تسلسل متوسط ​​يبلغ 5000 زوج قراءة لكل خلية.

معالجة تسلسلات BCR أحادية الخلية

تمت معالجة قراءات FASTQ ذات نهاية زوجية منزوعة الإرسال من 10x ملفات تعريف الجينوميات أحادية الخلية V (D) J مسبقًا باستخدام الأمر "cellranger vdj" من حارس الخلية v3.1.0 للمحاذاة مع مرجع الماوس GRCm38 v3.1.0 (refdata-cellranger-vdj-GRCm38-alts-ensembl-3.1.0) ، مما يؤدي إلى إنشاء 3760 تسلسل BCR عالي الثقة لـ 4420 خلية. تم اختيار تسلسلات الفحص بشكل عشوائي من أفضل المجموعات النسيلية التي تضم أكثر من 10 أعضاء في المجموعة النسيلية. تم بعد ذلك تحليل إخراج Cellranger vdj باستخدام Change-O v0.4.6 ضمن مجموعة immcantation. وشملت مراقبة الجودة الإضافية فحص التسلسلات المراد إعادة ترتيبها بشكل منتج والحصول على تعليقات توضيحية صالحة للجينات V وJ. علاوة على ذلك، تم الاحتفاظ فقط بالخلايا التي تحتوي على تسلسل سلسلة ثقيلة واحد فقط مقترنًا بتسلسل سلسلة خفيفة واحد على الأقل.

ملخص التقارير

مزيد من المعلومات حول تصميم البحوث متاح في ملخص تقارير حافظة الطبيعة مرتبطة بهذه المادة.

• محتوى مدعوم من تحسين محركات البحث وتوزيع العلاقات العامة. تضخيم اليوم.
• PlatoData.Network Vertical Generative Ai. تمكين نفسك. الوصول هنا.
• أفلاطونايستريم. ذكاء Web3. تضخيم المعرفة. الوصول هنا.
• أفلاطون السيارات / المركبات الكهربائية ، كربون، كلينتك ، الطاقة، بيئة، شمسي، إدارة المخلفات. الوصول هنا.
• BlockOffsets. تحديث ملكية الأوفست البيئية. الوصول هنا.
• المصدر https://www.nature.com/articles/s41467-023-38965-w