توليف وتوصيف t-TLR7 / 8a و K-nanoadjuvant

تم تصنيع TLR7 / 8a المقترن بالكوليسترول من خلال المخطط الكيميائي الموضح في الأشكال التكميلية. 1-3. تميزت تراكيب المركبات المحضرة بـ ¹H NMR (Bruker Avance III ، 700 ميجا هرتز). لتحضير الجسيمات الشحمية (التنشيط في الوقت المناسب TLR7 / 8a ، t-TLR7 / 8a) ، ثنائي ميثيل ثنائي أوكتاديسيل بروميد الأمونيوم (Sigma-Aldrich) ، 1,2،XNUMX-dioleoyl-sn- الجلسرو -3 فوسفوكولين (Avanti Polar Lipid) و TLR7 / 8a المقترن بالكوليسترول (النسبة المولية ، 2: 5.3: 1) تم إذابتهما في الكلوروفورم / الميثانول (نسبة الحجم ، 9: 1). تمت إزالة المذيب العضوي تمامًا باستخدام مبخر دوار عند درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. تم ترطيب الغشاء الرقيق باستخدام PBS ، وتم صوت المحلول الناتج لمدة دقيقتين عن طريق صوتنة طرف في ظروف حمام جليدي. بعد ذلك ، تم بثق الجسيمات الشحمية النهائية من خلال أغشية المرشح بأحجام مسام 2 ميكرومتر و 0.4 ميكرومتر باستخدام Mini Extruder (Avanti Polar Lipid). كعناصر تحكم ، تم تصنيع الجسيمات الشحمية الفارغة والجسيمات الشحمية التي تحتوي على R0.2 (MedChemExpress) أو خليط من R848 والكوليسترول (Sigma-Aldrich) بنفس الطريقة. تم قياس الكميات المحملة من t-TLR848 / 7a و R8 المجاني بواسطة مطياف الضوء فوق البنفسجي المرئي (UV-848). تم قياس الحجم الهيدروديناميكي وإمكانات زيتا لتركيبات الجسيمات الشحمية باستخدام تشتت الضوء الديناميكي (DLS ، ELS-Z مقياس ضوئي تشتت الضوء الكهربي). تم تحليل المورفولوجيا بواسطة المجهر الإلكتروني للإرسال المبرد (FEI Tecnai F1800 G20 ، مركز التحليل المتقدم ، المعهد الكوري للعلوم والتكنولوجيا).

للحصول على الظروف المثلى لـ K-nanoadjuvant وتأكيدها ، تمت إضافة poly (I: C) بحيث كانت نسبة الكتلة من t-TLR7 / 8a إلى poly (I: C) (Sigma-Aldrich) تقريبًا 12: 1. بعد ذلك ، تم تشغيل poly (I: C) و t-TLR7 / 8a و K-nanoadjuvant على هلام agarose بنسبة 1 ٪ عن طريق الرحلان الكهربائي في 1 × Tris acetate-EDTA buffer (TAE ، محلول LPS) عند 100 فولت لمدة 40 دقيقة. تم تصور فصل الجل باستخدام نظام التصوير BioDoc-It (UVP).

الحيوانات وخطوط الخلايا والأجسام المضادة

تمت مراجعة الدراسة على الحيوانات والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدامها (IACUC) بكلية الطب بجامعة سونجكيونكوان (SKKUIACUC2020-12-13-1) ، والتي تم اعتمادها من قبل جمعية التقييم والاعتماد الدولية لرعاية الحيوانات المختبرية و يلتزم بإرشادات معهد الثروة الحيوانية في المختبر. تم شراء الفئران C57BL / 6 و BALB / C (من 6 إلى 8 أسابيع من العمر من الإناث) من Orient Bio و DBL (كوريا). تم استلام الفئران IFNAR1 من Sang-Jun Ha (جامعة يونسي ، كوريا). تم استلام فئران OT-I من Yong-Soo Bae (جامعة Sungkyunkwan ، كوريا). تم إيواء جميع الحيوانات في أقفاص مهواة بشكل فردي تحت ظروف رطوبة 30-70٪ ، درجة حرارة 21-26 درجة مئوية ودورة ضوئية مظلمة لمدة 12 ساعة. تمت زراعة خلايا RAW 264.7 (خط خلايا البلاعم ، ATCC) وخلايا الورم B16OVA الفئران (الورم الميلانيني ، ATCC) في وسط إيجل Dulbecco المعدل (DMEM ، Thermo Fisher). تمت زراعة الخلايا السرطانية للمورين TC-1 (سرطان عنق الرحم ، ATCC) والخلايا السرطانية 4T1 (سرطان الثدي ، ATCC) في وسط RPMI 1640 (Thermo Fisher). تمت زراعة خلايا RAW-Blue (InvivoGen) في DMEM التي تحتوي على Zeocin (200 ميكروغرام مل^-1، InvivoGen). تم استخدام خطوط الخلايا التي تم فحصها في هذه الدراسة بعد التأكد من خلوها من تلوث المايكوبلازما ولم يتم إدراجها في خطوط الخلايا التي تم التعرف عليها بشكل خاطئ. تم استكمال جميع الوسائط بمصل بقري جنيني معطل بالحرارة بنسبة 10٪ (Thermo Fisher) ، بنسلين (50 وحدة دولية مل)^-1) والستربتومايسين (50 ميكروجرام مل^-1، ثيرمو فيشر). يتم توفير معلومات مفصلة عن الأجسام المضادة مثل نوع الجسم المضاد الفلوري ، والشركة المصنعة ، ورقم الاستنساخ والكتالوج المستخدم في هذه الدراسة في الجدول التكميلي. 3.

في ثقافة المختبر BMDC ومقايسة امتصاص الخلوية

تم إنشاء BMDCs من نخاع العظام لفئران C57BL / 6 (من 6 إلى 8 أسابيع من العمر للإناث). تم عزل عظام الفخذ والساق ، وتم غسل النخاع العظمي بوسط RPMI 1640 (بدون HEPES ، Thermo Fisher Scientific) باستخدام حقنة قياس 26. تمت إزالة خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) باستخدام محلول تحلل كريات الدم الحمراء (BioLegend). بعد الغسيل ، تم إعادة تعليق الخلايا في وسط RPMI (24 مل) يحتوي على mGM-CSF (20 نانوغرام مل).^-1، CreaGene) والمصنف (2.5 × 10⁶ لكل بئر) في لوحة ثقافة 6 آبار. في اليوم الثاني ، الوسيط الذي يحتوي على mGM-CSF (2 نانوغرام مل^-1) بعد الغسيل القوي باستخدام برنامج تلفزيوني لإزالة الخلايا غير الملتصقة. في اليوم الرابع ، وسط طازج يحتوي على mGM-CSF (4 نانوغرام مل^-1) تمت أضافتة. تم استخدام BMDCs غير الناضجة المتمايزة في اليوم السادس.

للامتصاص الخلوي للجسيمات الشحمية ، تم تحضير الجسيمات الشحمية باستخدام كوليسترول FITC (TopFluor Cholesterol ، Avanti Polar Lipid). BMDCs غير ناضجة (4 × 10⁴ الخلايا) في غرفة الفحص المجهري ibidi μ-slide 8-well. تم تحضين الخلايا مسبقًا باستخدام Dynasore (40 ميكرومتر ، Sigma-Aldrich) لمدة ساعة واحدة وتم تحضينها باستخدام الجسيمات الشحمية (FITC- كوليسترول) عند 1 درجة مئوية لمدة 37 ساعات. بعد الغسل باستخدام PBS ، تم تلوين غشاء الخلية بجرثومة القمح agglutinin أحمر تكساس (Thermo Fisher) ، وكانت النوى ملطخة بـ Hoechst 4 (Invitrogen). تم إجراء التصوير الخلوي باستخدام DeltaVision PD (GE Life Sciences) المجهز بهدف 33342 × ومجموعات المرشحات التالية (الإثارة (نانومتر) / الانبعاثات (نانومتر)): Cy100 (5/645) ، FITC (679/490) ، TRITC (525/555) و DAPI (605/360).

تحليل t-TLR7 / 8a المعتمد على GILT

انقسام t-TLR7 / 8a المعتمد على GILT

تم تحضير t-TLR7 / 8a (1.27 مم ، 50 ميكرولتر) في أنبوب 5 مل. تم إذابة السيستين (1 ميكرومتر أو 200 نانومتر ، 50 ميكرولتر ، Sigma-Aldrich) في برنامج تلفزيوني مع أو بدون GILT (2.5 ميكروغرام ، IFI30 مؤتلف بشري ، RayBiotech) وإضافته إلى الأنبوب. تم تحضين جميع العينات في حاضنة اهتزاز 37 درجة مئوية. تم تجميد العينات بشكل مفاجئ باستخدام النيتروجين السائل كل ساعة وتخزينها عند -20 درجة مئوية. بعد 12 ساعة ، تم تجميد جميع العينات عند درجة حرارة -80 درجة مئوية في مجفف تجميد فراغ (FDU-2100 ، EYELA) تحت 10 باسكال لمدة 24 ساعة. تم تحليل العينات المجففة بالتجميد بواسطة كروماتوجرافيا سائلة - مطياف الكتلة (Agilent 1100) لتحديد كمية R848.

تحليل ضربة قاضية للجينات GILT

264.7 خلية RAW (2 × 10⁵ تم زرع الخلايا لكل بئر) في صفيحة من 6 آبار ، وبعد 24 ساعة ، تمت إعادة تنقية الخلايا باستخدام DMEM جديد. تم خلط Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher ، 12 ميكرولتر) و siRNA الخاص بـ IFI30 (Genolotion) و opti-MEM (Thermo Fisher) بحجم إجمالي 300 ميكرولتر ، وتم تحضين المحلول عند درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. عولجت الخلايا بالمحلول (40 ميكرولامول لكل بئر) وحضنت لمدة 18 ساعة. بعد تحريض ضربة قاضية لجين GILT ، تمت إعادة تنقية الخلايا بوسط جديد ومعالجتها بـ R848 (1 ميكروغرام مل)^-1، 3.18 ميكرومتر) و t-TLR7 / 8a (2.9 ميكروغرام مل^-1، 3.18 ميكرومتر). تم جمع المواد الطافية للخلايا بعد 24 ساعة ، وتم قياس إفراز TNF-α بواسطة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).

في المختبر Th1 / Th2 استقطاب CD4⁺ خلايا T

تمت معالجة BMDCs مسبقًا بـ R848 (1 ميكروغرام مل^-1، 3.18 ميكرومتر) أو t-TLR7 / 8a (2.9 ميكروغرام مل^-1، 3.18 ميكرومتر) في وجود OVA (10 ميكروغرام مل^-1) لمدة 12 ساعة. تم حصاد الطحال من C57BL / 6 الفئران و CD4⁺ تم عزل الخلايا التائية باستخدام CD4 ساذج⁺ مجموعة عزل الخلايا التائية ، الماوس (Miltenyi Biotec) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تمت تربية البلدان النامية المحتضنة مسبقًا مع CD4⁺ الخلايا التائية (DC: نسبة الخلايا التائية = 1:10) في لوحة مسطحة القاع 96 بئر. بعد 3 أو 5 أو 7 أيام ، تم جمع المواد الطافية للثقافة الخلوية ، وتم قياس إفراز IL-4 و IFN-بواسطة ELISA.

التحليل النسيجي

تم حقن الفئران الساذجة C57BL / 6 (أنثى عمرها 6 أسابيع) تحت الجلد باستخدام R848 (50 ميكروغرام ، 159 ميكرولتر) ، بولي (I: C) (12.5 ميكروغرام) ، t-TLR7 / 8a (144.2 ميكروغرام ، 159 ميكرولتر) ، R848 + بولي (I: C) أو K-nanoadjuvant أربع مرات كل 3 أيام. بعد ثلاثة أيام من الحقن الأخير ، تم حصاد الكبد والرئة والطحال والكلى. تم تقسيم العينات وتلطيخها بـ H&E. تم تصور المقاطع الملطخة بواسطة الفحص المجهري المقلوب (Eclipse Ts2 ، A-FRONTIER) بهدف 40 ×.

في تحليل التدفق الخلوي في الجسم الحي

الخلايا السرطانية B16OVA أو TC-1 (5 × 10⁵ الخلايا لكل فأر) تحت الجلد في الأجنحة اليمنى من C57BL / 6 الفئران (أنثى عمرها 6 أسابيع). بعد التوزيع العشوائي للفئران الحاملة للورم على المجموعات بعد 5-7 أيام ، R848 (25 ميكروغرام ، 79.5 ميكرولتر) ، بولي (I: C) (6.25 ميكروغرام) ، t-TLR7 / 8a (72.1 ميكروغرام ، 79.5 ميكرولتر) ، R848 + تم إعطاء poly (I: C) أو K-nanoadjuvant مع SIINFEKL (15 ميكروغرام ، مستضد ببتيد OVA257-264 ، MIMOTOPES) أو الببتيد طويل E7 (AGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDS) (10 ميكروغرام ، Anygen). تم تكرار جميع التطعيمات كل 3 أيام ليصبح المجموع ثلاث مرات. تم استخدام المجموعة غير المعالجة كعنصر تحكم.

تحضير المعلقات وحيدة الخلية

تم تعطيل الأورام و TDLNs ميكانيكيًا وإعادة تعليقها في وسط يحتوي على كولاجيناز D (1 مجم مل)^-1، سيجما الدريتش). تم تحضين المحاليل في حاضنة اهتزاز لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، تم غسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني بعد الترشيح من خلال مصافي خلايا 70 ميكرومتر. لعزل الخلايا الطحالية ، تم تجانس الطحال ميكانيكيًا وإعادة تعليقه في محلول تحلل كرات الدم الحمراء (BioLegend) لإزالة كرات الدم الحمراء. تم ترشيح المحاليل من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر ، وتمت إضافة الوسيط. تم الحصول على الخلايا الطحالية بعد طرد المعلقات عند 488g لمدة 3 دقائق.

تنشيط DC وتجمع الكريات البيض المتسلل إلى الورم (TIL)

تم تلطيخ الخلايا المفردة من TDLNs والأورام بأجسام مضادة خاصة بـ DCs المنشط (CD11c المضاد للفأر و CD80 و CD86). كانت الخلايا المفردة من الأورام ملطخة بأجسام مضادة خاصة بـ MDSCs (مضاد للفأر CD11b و Gr-1) وخلايا T وخلايا NK (CD45 و CD3 و CD8 و NK1.1 و CD69). يتم توفير معلومات مفصلة عن الأجسام المضادة المستخدمة في الجدول التكميلي 3.

إعادة تنشيط الببتيد لـ CD8⁺ الخلايا التائية وتحفيز الخلايا القاتلة الطبيعية

ل CD8 الخاص بمستضد⁺ تحليل الخلايا التائية ، الخلايا المفردة (5 × 10⁵ لكل بئر) في صفيحة 96 بئر مستديرة القاع. بعد ذلك ، تمت إعادة تنشيط الخلايا باستخدام ببتيد OVA SIINFEKL (10 ميكروغرام مل^-1) أو الببتيد Long-E7 (10 ميكروغرام مل^-1) ، IL-2 (30 نانوغرام مل^-1، PeproTech) ، و GolgiPlug أو GolgiStop (مثبط نقل البروتين ، 0.6 ميكروغرام مل^-1، BD Bioscience) لمدة 12 ساعة. لتحليل تحفيز الخلايا القاتلة الطبيعية ، الخلايا المفردة (5 × 10⁵ لكل بئر) في صفيحة 96 بئر مستديرة القاع. تم تحفيز الخلايا بكوكتيل تنشيط الخلية (مع بريفيلدين أ) (BioLegend ، 500X) ، وهو خليط من التركيزات المُحسَّنة من PMA ، أيونوميسين ومثبط نقل البروتين (بريفيلدين أ) لمدة 4 ساعات. بعد التحفيز ، تم جمع الخلايا وغسلها مرتين. تم تلوين الخلايا بأجسام مضادة لعلامة السطح لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. كانت الخلايا المفردة من TDLNs والأورام ملطخة بأجسام مضادة خاصة بـ CD8 المنهك⁺ الخلايا التائية (ضد الماوس CD3 و CD8 و PD-1 و LAG-3 و TIM-3) أو CD8 المنشط⁺ الخلايا التائية (ضد الماوس CD3 و CD8 و CD69 و 4-1BB و CD25). يتم توفير معلومات مفصلة عن الأجسام المضادة المستخدمة في الجدول التكميلي 3.

بالنسبة للتلوين داخل الخلايا ، تم غسل الخلايا ثم إعادة تعليقها في محلول التثبيت / النفاذية لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تم غسل الخلايا الثابتة مرتين باستخدام محلول BD Perm / Wash (BD Bioscience) وتلطيخها بأجسام مضادة لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. كانت الخلايا المفردة من TDLNs والأورام والخلايا الطحالية ملطخة بأجسام مضادة خاصة بـ CD8 المنتجة للسيتوكين⁺ الخلايا التائية (CD3 المضاد للفأر و CD8 و IFN-γ و TNF-α و Granzyme B) أو الخلايا القاتلة الطبيعية المنتجة للسيتوكين (CD3 المضاد للفأر و NK1.1 و IFN-γ و TNF-α و Granzyme B). بعد التلوين ، تم غسل الخلايا مرتين باستخدام المخزن المؤقت BD Perm / Wash وتم تعليقها في محلول تلطيخ. تم تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي باستخدام BD FACSCanto II (في BIORP التابع لمعهد كوريا للعلوم الأساسية) وقياسها كميًا باستخدام FlowJo v.10. يتم توفير معلومات مفصلة عن الأجسام المضادة واستراتيجيات البوابات المستخدمة في الجدول التكميلي 3 والتين التكميلية. 15, 23, 24, 38 و 39.

إفراز السيتوكينات في الجسم الحي في الأورام و TDLNs

لتحليل إفراز السيتوكين في الأنسجة ، تعطلت شبكات TDLN ميكانيكيًا وأعيد تعليقها في وسط يحتوي على كولاجيناز D (1 مجم مل)^-1، سيجما الدريتش). تم زرع المعلقات أحادية الخلية التي تم الحصول عليها من TDLNs في لوحة ثقافة ذات قاع دائري 96 بئر وحضنت عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. تم حصاد الخلايا ، وتم جمع المواد الطافية بعد الطرد المركزي. تم تعليق الأورام في كاشف تحلل الخلايا CellLytic MT (100 ملغ نسيج لكل مل ، Sigma-Aldrich) وتعطلت ميكانيكيًا. تم الطرد المركزي للحلول عند 10,000g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتم جمع المواد الطافية. تم تحليل جميع المواد الطافية التي تم جمعها باستخدام مجموعات IL-12 (p70) أو IFN-γ ELISA.

حركية الجسم الحي لإفراز السيتوكين IL-12 (p70) وأرقام الخلايا المناعية في LNs

لتحليل حركية إفراز السيتوكين IL-12 (p70) في LNs ، تلقت الفئران الساذجة C57BL / 6 حقنة واحدة من بولي (I: C) (6.25 ميكروغرام) + R848 (25 ميكروغرام ، 79.5 ميكرولتر) أو t-TLR7 / 8 أ (72.1 ميكروغرام ، 79.5 ميكرولتر) مع SIINFEKL (15 ميكروغرام). تم حصاد LNs الأربية للتصريف في نقاط زمنية متسلسلة (6 و 12 و 24 و 48 و 72 ساعة). ثم نواصل العمل بنفس الطريقة الموضحة أعلاه. تم تحليل جميع المواد الطافية التي تم جمعها باستخدام مجموعات IL-12 (p70) أو IFN-γ ELISA. لتحليل حركية أعداد الخلايا المناعية في LNs ، تلقت الفئران الساذجة C57BL / 6 حقنة واحدة تساوي الجرعة المذكورة أعلاه بدون مستضد. تم حصاد LNs الأربية للتصريف في نقاط زمنية متسلسلة (0 ، 1 ، 2 ، 4 ، 7 و 14 يومًا). بعد ذلك ، تابعنا بنفس الطريقة الموضحة أعلاه للحصول على خلايا مفردة من العقدة الليمفاوية أعلاه.

في دراسة مضادات الأورام في الجسم الحي

الخلايا السرطانية TC-1 (5 × 10⁵ الخلايا لكل فأر) تحت الجلد في الأجنحة اليمنى من C57BL / 6 الفئران (أنثى عمرها 6 أسابيع). تم حقن بولي (I: C) (6.25 ميكروغرام) + R848 (25 ميكروغرام ، 79.5 ميكرولتر) أو t-TLR7 / 8a (72.1 ميكروغرام ، 79.5 ميكرولتر) مع ببتيد طويل E7 (10 ميكروغرام) وفقًا للجدول المحدد بعد عشوائي توزيع الفئران الحاملة للورم على المجموعات. تم استخدام المجموعة المعالجة ببرنامج تلفزيوني كعنصر تحكم. تمت مراقبة نمو ورم الفأر والبقاء على قيد الحياة في نقاط زمنية مختلفة. تم حساب حجم الورم باستخدام الصيغة التالية: (قطر المحور الطويل) × (قطر المحور القصير)²/ 2. قُتلت الفئران عندما وصل حجم الورم إلى الحد الأقصى لحجم الورم (1,000 ملم³) معتمدة من قبل IACUC ، كلية الطب بجامعة Sungkyunkwan.

الدمج مع حصار حاجز المناعة

بعد 4 أيام من تلقيح الورم ، تلقت الفئران K-nanoadjuvant (t-TLR7 / 8a ، 72.1 ميكروغرام ؛ بولي (I: C) ، 6.25 ميكروغرام) مع الببتيد الطويل E7 (10 ميكروغرام) ، وأجريت التحصينات كل 3. أيام ليصبح المجموع ست مرات. تم إعطاء الأجسام المضادة لـ PD-L1 (استنساخ: 10 F. G2 ، BioXCell ، 100 ميكروغرام) داخل الصفاق كل يومين لما مجموعه ثماني مرات.

بالاشتراك مع العلاج الكيميائي

بعد 4 أيام من تلقيح الورم ، حُقنت الفئران بـ K-nanoadjuvant (t-TLR7 / 8a ، 72.1 ميكروغرام ؛ بولي (I: C) ، 6.25 ميكروغرام) بالببتيد الطويل E7 (10 ميكروغرام) ، وتكررت التطعيمات خمس مرات. مرات كل 3 أيام. تم تصنيع الليبوزوم (دوكسوروبيسين) بالطريقة الموضحة في طرق تكميلية. تم حقن الفئران بالجسيم الشحمي (دوكسوروبيسين) (80 ميكروغرام من دوكسوروبيسين) مرتين على فترات 6 أيام.

دراسة نضوب IL-12 في الجسم الحي

الخلايا السرطانية B16OVA (5 × 10⁵ الخلايا لكل فأر) تحت الجلد في الأجنحة اليمنى للفئران. تلقت الفئران حقنة تحت الجلد من K-nanoadjuvant (t-TLR7 / 8a ، 72.1 ميكروغرام ؛ بولي (I: C) ، 6.25 ميكروغرام) مع SIINFEKL (15 ميكروغرام) ثلاث مرات كل 3 أيام. بدءًا من 3 أيام قبل الحقن الأول لـ K-nanoadjuvant ، تم إعطاء IL-12p75 المضاد للفأر (استنساخ: R2-9A5 ، BioXcell ، 300 ميكروغرام) داخل الصفاق لما مجموعه خمس مرات على فترات 3 أيام.

دراسة نموذج الورم البعيد في الجسم الحي

الخلايا السرطانية TC-1 (5 × 10⁵ الخلايا لكل فأر) تحت الجلد في الأجنحة اليمنى لـ C57BL / 6 الفئران (أنثى عمرها 6 أسابيع) في اليوم 0. في 4 أيام بعد تلقيح الورم الأولي ، خلايا الورم الثانوية (2.5 × 10)⁵ الخلايا لكل فأر) تحت الجلد في الجناح الأيسر. تم حقن K-nanoadjuvant (t-TLR7 / 8a ، 72.1 ميكروغرام ؛ بولي (I: C) ، 6.25 ميكروغرام) أربع مرات كل 3 أيام بدءًا من 4 أيام بعد تلقيح الورم الأولي. تمت مراقبة نمو ورم الفأر في نقاط زمنية مختلفة. في اليوم الثاني والعشرين ، تم حصاد الأورام وتصويرها.

في دراسة نموذج TC-1 خارج الجسم الحي

تم تخدير C57BL / 6 فئران (أنثى عمرها 6 أسابيع) عن طريق التخدير المستنشق. تم شق الجانب الأيمن من جلد الصدر. بعد ذلك ، تم تلقيح الفئران بخلايا TC-1 (5 × 10⁵ الخلايا لكل فأر) على الجانب الأيمن من فص الرئة. بعد 3 أيام ، يكون K-nanoadjuvant (t-TLR7 / 8a ، 72.1 ميكروغرام ، 79.5 ميكروغرام ؛ بولي (I: C) ، 6.25 ميكروغرام) و R848 (25 ميكروغرام ، 79.5 ميكرولتر) + بولي (I: C) (6.25 ميكروغرام) ) تم إعطاء المجموعات تحت الجلد ، وتم إجراء التطعيمات كل 3 أيام ليصبح المجموع أربع مرات. في اليوم 14 ، تم حصاد الرئتين وتقطيعهما وتلطيخهما بـ H&E. تم تصور المقاطع الملطخة H & E باستخدام مجهر (Zeiss Axiovert 200 M) مجهز بهدف 40 ×. قُتلت المجموعة الضابطة ومجموعات R848 + poly (I: C) و K-nanoadjuvant في اليومين 14 و 31 ، على التوالي ، لتلطيخ الرئة.

تحليل ورم خبيث في الرئة

تم تلقيح فئران BALB / C (أنثى عمرها 6 أسابيع) في الجهة اليمنى بخلايا ورم 4T1 (5 × 10⁵ خلايا لكل فأر). بعد 5 أيام ، تم إعطاء الفئران K-nanoadjuvant (t-TLR7 / 8a ، 72.1 ميكروغرام ؛ بولي (I: C) ، 6.25 ميكروغرام) مع محلول الورم (10 ميكروغرام) ، وتم إجراء التحصين كل 3 أيام لما مجموعه أربع مرات. بعد حوالي شهر واحد ، تم تقييم ورم خبيث في الرئة باستخدام حبر الهند (1 مل في 3 مل من برنامج تلفزيوني) ، والذي تم إعطاؤه عن طريق الحقن داخل الرغامى. تم استئصال الرئتين وغسلهما باستخدام برنامج تلفزيوني وغمرهما في محلول مثبت (47٪ إيثانول (70 مل) و 40٪ فورمالدهيد (4 مل) وحمض أسيتيك (1 مل)). تم حساب العقيدات النقيلية في الرئة عن طريق الملاحظة البصرية.

دراسة نموذجية لاعادة تشكيل الورم في الجسم الحي

الخلايا السرطانية TC-1 (5 × 10⁵ الخلايا لكل فأر) تحت الجلد في الأجنحة اليمنى لـ C57BL / 6 الفئران (أنثى عمرها 6 أسابيع) في اليوم 0. بعد 4 أيام ، تم حقن الفئران بـ K-nanoadjuvant خمس مرات كل 3 أيام ، وتم حقن الفئران بأجسام مضادة لـ PD-L1 (100 ميكروغرام) خمس مرات كل يومين ابتداءً من 2 أيام بعد تلقيح الورم. في اليوم 7 ، قُتلت الفئران وتم جمع TDLNs والطحال. تم تلطيخ الخلايا المفردة من TDLNs والخلايا الطحالية بأجسام مضادة خاصة بخلايا الذاكرة التائية (CD17 و CD3 و CD8 و CD44L). يتم توفير معلومات مفصلة عن الأجسام المضادة المستخدمة في الجدول التكميلي 3. ثم تم إجراء قياس التدفق الخلوي باستخدام BD FACSCanto II لتحليل معلقات الخلايا الملطخة. بعد واحد وعشرين يومًا من تلقيح الورم ، تمت إعادة تحدي الفئران الساذجة والفئران الخالية من الورم المعالجة بـ K-nanoadjuvant بخلايا الورم TC-1 (5 × 10)⁵ خلايا لكل فأر) في نفس الجهة اليمنى.

الإحصاء والتكاثر

يشار إلى جميع النتائج على أنها متوسط ​​± sd A ثنائي الذيل غير مقترن t-تم استخدام الاختبار للمقارنة بين المجموعتين. تم استخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) (أو ANOVA ثنائي الاتجاه) مع اختبار المقارنات المتعددة من Tukey (أو اختبار المقارنات المتعددة Sidak) لتحليل مجموعات متعددة من البيانات. تم استخدام اختبار رتبة السجل (Mantel-Cox) لبيانات البقاء على قيد الحياة. تم إجراء جميع التحليلات الإحصائية باستخدام GraphPad Prism 8 و Microsoft Excel 2016. P القيم (NS ، ليست مهمة ، *P <0.05، **P <0.01، ***P <0.001 و ****P <0.0001) للإشارة إلى دلالة إحصائية. تجارب في التين. 1 ج ، ه ، و ، ح و 2j تكررت ثلاث مرات مأخوذة من عينات متميزة. تجارب في التين. 2i و 5 أ ، ص تكررت مرتين مأخوذة من عينات متميزة.

ملخص التقارير

مزيد من المعلومات حول تصميم البحوث متاح في ملخص تقارير حافظة الطبيعة مرتبطة بهذه المادة.

• محتوى مدعوم من تحسين محركات البحث وتوزيع العلاقات العامة. تضخيم اليوم.
• بلاتوبلوكشين. Web3 Metaverse Intelligence. تضخيم المعرفة. الوصول هنا.
• المصدر https://www.nature.com/articles/s41565-022-01296-w