التعبير عن ناقل حمض ثنائي الكربوكسيل وحذف مسارات المنتجات الثانوية

المقدمة السابقة لمسار rTCA إلى أنا شرقية (سلالة SA) (الشكل XNUMX). 1B) مكّن من إنتاج SA بعيار 11.6 جم / لتر في تخمير دورق الرج¹³. لمزيد من تحسين العيار، حاولنا التعبير عن ناقل لـ SA. MAE1 تبدأ من شيزوساكارومايس بومب (SpMAE1) تم العثور على أنه الناقل الأكثر كفاءة للحمض ثنائي الكربوكسيل لتصدير SA¹⁸. الكودون الأمثل SpMAE1 تم دمجها في جينوم السلالة SA، مما أدى إلى ظهور السلالة SA/MAE1. تم تقييم السلالات SA وSA/MAE1 لإنتاج SA باستخدام تخمير دورق الرج في الحد الأدنى من الوسائط (SC-URA) مع 50 جم/لتر من الجلوكوز في ظل ظروف محدودة الأكسجين. مقدمة SpMAE1 تحسن بشكل كبير عيار SA من 6.8 جم / لتر إلى 24.1 جم / لتر (الشكل XNUMX أ). 2الشكل التكميلي 1A، والشكل التكميلي. 1B).

أشرطة الخطأ، تعني ± SD (n  = 3 عينات مستقلة بيولوجيا). *p < 0.05، **p  < 0.01، ***p  <0.001، ns غير مهم، محسوب بواسطة ثنائي الذيل غير المقترن t-اختبار. يتم توفير بيانات المصدر كملف بيانات المصدر.

صورة بالحجم الكامل

كان الإيثانول هو المنتج الثانوي الرئيسي وتراكم عند 9.5 جم/لتر في تخمير السلالة SA/MAE1. يتكون الإيثانول من التفاعل المحفز بواسطة هيدروجيناز الكحول (ADH)، والذي يستخدم NADH لاختزال الأسيتالديهيد إلى إيثانول. نظرًا لأن إنتاج SA بواسطة مسار rTCA يتطلب NADH، فإن إزالة مسار تكوين الإيثانول قد يؤدي إلى تحسين إنتاج SA. علاوة على ذلك، على الرغم من أن الجلسرين تراكم أقل من 1 جم / لتر ولم يكن المنتج الثانوي الرئيسي الذي لوحظ في تخمير السلالة SA / MAE1، فإن مسار تكوين الجلسرين المحفز بواسطة هيدروجيناز الجلسرين -3 فوسفات (GPD) يمكن أن يتنافس مع مسار rTCA لـ الكربون وNADH. وهكذا على حد سواء PDC (بيروفيك ديكاربوكسيلاز) و GPD تم حذفها في السلالة SA/MAE1، مما أدى إلى السلالة SA/MAE1/pdc∆/gpd∆. في حين حذف PDC لمنع تكوين الإيثانول يجب من الناحية النظرية تحسين عيار SA بسبب زيادة توافر كل من البيروفات و NADH، أدى تخمير السلالة SA/MAE1/pdc∆/gpd∆ بشكل غير متوقع إلى عيار SA مماثل قدره 24.6 جم / لتر وتراكم 19.8 جم / لتر من البيروفات في ظل ظروف محدودة الأكسجين (الشكل XNUMX أ). 2 والشكل التكميلي. 1C).

في الآونة الأخيرة، تم إنشاء نموذج على نطاق الجينوم ل أنا شرقية، وكان من المتوقع أن تكون جميع أنشطة ADH موضعية في الميتوكوندريا¹⁹. وبالتالي، فإن إزالة إنتاج الإيثانول من خلال PDC لا ينبغي أن يؤدي الحذف إلى تعزيز توافر NADH العصاري الخلوي، مما يؤدي إلى عدم زيادة عيار SA. فيما يتعلق بتوازن NADH العصاري الخلوي، ينتج تحلل السكر 2 مول من البيروفات و2 مول من NADH من 1 مول من الجلوكوز، في حين أن تحويل 1 مول من البيروفات إلى 1 مول من حمض السكسينيك يتطلب 2 مول من NADH. وهكذا، على الرغم من أن دورة TCA الاختزالية لديها أعلى عائد نظري، فإن العائد الفعلي لـ SA في الخمائر يقتصر على 1 مول/مول فقط من الجلوكوز. أجرينا ¹³تحليل التدفق الأيضي C (MFA) والتحقق من أن مسار rTCA يستخدم بكفاءة معظم NADH الخلوي الناتج عن تحلل السكر لإنتاج SA وإفراز البيروفات يمثل نصف البيروفات المنتج من الخطوة الأخيرة من تحلل السكر (الشكل التكميلي SXNUMX). 2). لقد عبرنا أيضًا عن نسخة إضافية من مسار rTCA أو الجين الفردي للمسار في السلالة SA/MAE1/pdc∆/gpd∆ لمزيد من تعديل تدفقات الكربون بين البيروفات وSA، ولكن لم يكن هناك تغيير كبير في عيار SA أو تراكم البيروفات (الشكل التكميلي. 3). وبالتالي، فإن النقص في إمدادات NADH في العصارة الخلوية هو عنق الزجاجة الرئيسي لإنتاج SA من خلال مسار rTCA.

التخمير المشترك للجلوكوز والجلسرين لإنتاج SA

نظرًا لأن الجلوكوز وحده لا ينتج ما يكفي من NADH عصاري خلوي لإنتاج SA، فيمكن النظر في مصادر الكربون الأخرى من أجل الحصول على عيارات وعائدات أعلى. يتمتع الجلسرين بدرجة أعلى من الاختزال وبالتالي يمكن أن ينتج مكافئات اختزالية أكبر لـ NADH مقارنة بالجلوكوز^20,21. نظرًا لأن السلالة SA/MAE1/pdc∆/gpd∆ أظهرت عيوب نمو في وسط SC-URA مع الجلسرين كمصدر وحيد للكربون، فقد سعينا إلى إجراء تخمير هذه السلالة باستخدام وسط SC-URA مع 50 جم / لتر من الجلوكوز و20 جم / لتر من الجلسرين. في السابق، تبين أن استخدام الجلوكوز والجلسرين كمصادر ثنائية الكربون يعزز تحويل أوكسالوسيتات إلى مالات من خلال زيادة إمدادات NADH من الجلسرين في عملية هندسية. M. succiniciproducens⁶. كما هو مبين في الشكل التكميلي. 4A، يمكن للخلايا أن تستهلك كلا الركائز لإنتاج SA في ظل ظروف محدودة الأكسجين؛ ومع ذلك، كان استهلاك الجلسرين بطيئًا، وتم تحسين عيار SA إلى 30.5 جم / لتر فقط بعد 7 أيام من التخمير. أجرينا بعد ذلك عملية التخمير في ظل الظروف الهوائية، مفترضين أن استقلاب الجلسرين قد يكون محدودًا في الظروف المحدودة بالأكسجين. في ظل الظروف الهوائية، تم استهلاك كل من الجلوكوز والجلسرين بشكل أسرع، مما يسمح بإنتاج 38.6 جم / لتر من SA (الشكل XNUMX أ). 2 والشكل التكميلي. 4B). قمنا أيضًا باختبار تخمير السلالة SA/MAE1/pdc∆/gpd∆ باستخدام وسط SC-URA مع 50 جم/لتر من الجلوكوز في الظروف الهوائية. ومن المثير للاهتمام، في حين أن مسار rTCA هو مسار تخمير والتهوية العالية قد توجه المزيد من تدفق الكربون إلى دورة TCA للتنفس الهوائي، فقد لاحظنا أن الظروف الهوائية أدت إلى عيارات مماثلة مقارنة بالظروف المحدودة للأكسجين وكانت الخلايا قادرة على استهلاك الجلوكوز أسرع، مما يؤدي إلى إنتاجية أعلى (الشكل التكميلي XNUMX). 4C).

حذف مستورد حمض ثنائي الكربوكسيل ونازعة هيدروجيناز NADH الخارجية

ثم تمت محاولة المزيد من عمليات حذف الجينات لزيادة إنتاج SA. في الآونة الأخيرة، ظهرت ناقلات الكربوكسيل من عائلة JEN PkJEN2-1 وPkJEN2-2 في بيتشيا كودريافزيفي تم وصفها بأنها متورطة في الامتصاص الداخلي للأحماض ثنائية الكربوكسيل^22,23. تمت إضافة تعليقات توضيحية إلى PkJEN2-1 وPkJEN2-2 كـ g3473 وg3068 في أنا شرقية، على التوالى. تم حذف g3473 من السلالة SA/MAE1/pdc∆/gpd∆، مما أدى إلى السلالة g3473∆. أدى تخمير هذه السلالة في وسط SC-URA مع 50 جم / لتر من الجلوكوز و 20 جم / لتر من الجلسرين إلى تحسين عيار SA إلى 42.0 جم / لتر (الشكل XNUMX أ). 2 والشكل التكميلي. 5A)، مما يشير إلى أن منع SA من إعادة دخول الخلايا كان مفيدًا. تم التخلص من g3068 أيضًا في السلالة g3473∆؛ ومع ذلك ، لاحظنا أن تعطيل كلا الناقلين JEN2 أدى إلى خفض عيار SA إلى 34.5 جم / لتر وبالتالي لم يكن مفيدًا (الشكل التكميلي XNUMX). 5B). كانت هذه النتيجة غير متوافقة مع التقرير السابق الذي يشير إلى حذف كلا الناقلين JEN في P. كودريازيفيفي أدى CY902 إلى ارتفاع عيار SA مقارنة بحذف الجين الفردي، والذي قد يعزى إلى خلفيات وراثية مختلفة. P. كودريازيفيفي تم تصميم CY902 لإنتاج SA باستخدام مسار TCA (oTCA) المؤكسد عن طريق حذف جين الوحدة الفرعية المعقدة لهيدروجيناز السكسينات. SDH5، في حين تم تصميم إنتاج SA في شركتنا أنا شرقية تم تحقيق SD108 باستخدام مسار rTCA. علاوة على ذلك، استنادًا إلى MFA، تمت أكسدة كمية صغيرة من NADH العصاري الخلوي بواسطة هيدروجيناز NADH الخارجي للميتوكوندريا (NDE)، الذي ينقل الإلكترونات من NADH عصاري خلوي إلى سلسلة نقل الإلكترون بالميتوكوندريا (الشكل التكميلي XNUMX). 2). تجربة الاقتراب من الموت تم استهدافه للتعطيل في السلالة g3473∆، مما أدى إلى السلالة g3473∆/nde∆. بالمقارنة مع سلالة g3473∆، تجربة الاقتراب من الموت أدى الحذف إلى تحسين عيار SA إلى 46.4 جم / لتر، مما يشير إلى خروج المغلوب من تجربة الاقتراب من الموت زيادة تجمع NADH عصاري خلوي لإنتاج SA (الشكل XNUMXA). 2 والشكل التكميلي. 5C). ومع ذلك، فإن التعطيل تجربة الاقتراب من الموت خفض معدل استهلاك الجلوكوز. ومن ثم، على الرغم من وجود عيار أعلى، فإن السلالة g3473∆/nde∆ كانت لها إنتاجية مماثلة مثل السلالة g3473∆ (الشكل XNUMX أ). 2).

تحسين استهلاك الجلسرين

يشير الاستهلاك البطيء للجلسرين إلى أن استقلاب الجلسرين الداخلي قد لا يكون نشطًا للغاية. في السابق، كان هناك فرط في التعبير عن إنزيم هيدروجيناز الجلسرين (GDH) من بيتشيا أنجوستا وثنائي هيدروكسي أسيتون كيناز داخلي المنشأ (DAK) أنشأ مسار استهلاك الجلسرين المنتج لـ NADH في س. خميرة²⁴. ولذلك سعينا إلى توظيف استراتيجية مماثلة لتحسين استهلاك الجلسرين في أنا شرقية. الكودون الأمثل باغد وداخلي DAK تم التعبير عنها بشكل مفرط في السلالات g3473∆ و g3473∆/nde∆، مما أدى إلى سلالات g3473∆/PaGDH-DAK وg3473∆/nde∆/PaGDH-DAK، على التوالي. لم يؤدي تخمير هذه السلالات في وسط SC-URA مع 50 جم / لتر من الجلوكوز و 20 جم / لتر من الجلسرين إلى ارتفاع عيار SA؛ أنتجت g3473∆/PaGDH-DAK وg3473∆/nde∆/PaGDH-DAK SA عند عيار 41.9 جم/لتر و46.5 جم/لتر، على التوالي، على غرار التتر الذي حققته السلالات الأم التي تفتقر إلى الإفراط في التعبير عن باغد و DAK (تين. 2الشكل التكميلي 6A، والشكل التكميلي. 6B). ومع ذلك، فإن الإفراط في التعبير عن باغد و DAK كان مفيدًا لمعدلات استخدام الجلوكوز والجلسرين. تمت زيادة الإنتاجية من 0.29 إلى 0.44 جم / لتر / ساعة في السلالة g3473 ∆ / PaGDH-DAK ومن 0.28 إلى 0.32 جم / لتر / ساعة في السلالة g3473 ∆ / nde ∆ / PaGDH-DAK (الشكل XNUMX أ). 2 والشكل التكميلي. 6C).

يمكن أن تنتج سلالة g3473∆/PaGDH-DAK 25.4 جم/لتر من SA في التخمير باستخدام 50 جم/لتر من الجلوكوز، بينما يمكن الحصول على 41.9 جم/لتر من SA من 50 جم/لتر من الجلوكوز و20 جم/لتر من الجلسرين (تكميلي). تين. 7A). نظرًا لأنه يمكن أيضًا تحقيق عيار SA البالغ 41.9 جم / لتر بمجرد استخدام المزيد من الجلوكوز الأولي في التخمير باستخدام الجلوكوز فقط، فقد يتساءل المرء عن مزايا استخدام الجلوكوز والجلسرين كمصادر ثنائية الكربون. على أساس مكافئ الكربون، 1 جرام من الجلوكوز يعادل 1 جرام من الجلسرين. أدى استخدام 50 جم / لتر من الجلوكوز و 20 جم / لتر من الجلسرين إلى تمكين إنتاجية SA البالغة 0.60 جم ​​/ جم من الجلوكوز المكافئ، وهو أعلى من إنتاجية 0.51 جم / جم من الجلوكوز من التخمير باستخدام 50 جم / لتر فقط من الجلوكوز (الشكل التكميلي . 7B). علاوة على ذلك، من 70 جم/لتر من الجلوكوز، أي تركيز يعادل 50 جم/لتر من الجلوكوز و20 جم/لتر من الجلسرين، يمكن لسلالة g3473∆/PaGDH-DAK إنتاج SA عند عيار 35.6 جم/لتر فقط وإنتاجية 0.50 جم / جم جلوكوز (الشكل التكميلي XNUMX). 7). لذلك، فإن استخدام خليط من الجلوكوز والجلسرين كمصادر للكربون سمح بإنتاج SA عند عيارات أعلى وإنتاجية أعلى من استخدام كمية مكافئة من الجلوكوز. قارنا أيضًا إنتاج SA في السلالة g3473∆/PaGDH-DAK باستخدام 50 جم / لتر من الجلوكوز وتركيزات مختلفة من الجلسرين تبلغ 10 جم / لتر و 20 جم / لتر و 30 جم / لتر (الشكل التكميلي SXNUMX). 8). كما هو متوقع، زاد عيار SA مع زيادة الكمية الأولية من الجلسرين؛ وبالتالي، فإن المقارنة بين التتر لم تكن ذات معنى. كما أن المحصول كان أدنى عند استخدام 10 جم/لتر من الجلسرين. لم يلاحظ أي اختلاف كبير في الغلة عند استخدام 20 جم / لتر و 30 جم / لتر من الجلسرين؛ ومع ذلك، كانت الإنتاجية أعلى عند استخدام 20 جم/لتر من الجلسرين. وبالتالي، فقد اعتبرنا أن 20 جم/لتر من الجلسرين هو التركيز الأمثل للاستخدام مع 50 جم/لتر من الجلوكوز لإنتاج SA.

لقد حاولنا أيضًا تخفيف قمع الجلوكوز في استهلاك الجلسرين من خلال حذف هيكسوكيناز، والذي ثبت أنه يقلل من معدل فسفرة الجلوكوز ويسمح بالاستخدام المشترك للجلوكوز والزيلوز في س. خميرة²⁵. من خلال تحليل BLAST، تم تحديد ثلاثة جينات هيكسوكيناز محتملة (g1398، g2945، وg3837)، وفقط حذف g3837 في السلالة g3473∆/PaGDH-DAK مكّن من الاستهلاك المتزامن لكل من الجلوكوز والجلسرين (الشكل التكميلي SXNUMX). 9). في حين أنه يمكن تحقيق عيارات SA مماثلة، فإن حذف g3837 أدى إلى خفض معدلات استهلاك الجلوكوز والجلسرين، مما أدى إلى عدم زيادة الإنتاجية.

التخمير دفعة بنك الاحتياطي الفيدرالي وتوسيع نطاقها

بعد تخمير دورق الرج، أجرينا عمليات تخمير دفعة مغذية لزيادة عيار SA ولتقييم أداء سلالتنا الهندسية في الإنتاج على نطاق واسع. لاستغلال التسامح المتفوق لدرجة الحموضة المنخفضة أنا شرقية، اخترنا إجراء عمليات التخمير الدفعي عند درجة الحموضة 3. عند هذا الرقم الهيدروجيني، ما يقرب من 90٪ من الأنواع SA تكون بروتونية بالكامل SA، في حين أن الـ 10٪ المتبقية من الأنواع عبارة عن سكسينات الهيدروجين²⁶. قمنا أولاً باختبار أداء السلالة g3473∆/PaGDH-DAK، والتي تم اختيارها على g3473∆/nde∆/PaGDH-DAK نظرًا لزيادة الإنتاجية، باستخدام وسط SC-URA مع 50 جم/لتر من الجلوكوز و20 جم/لتر من الجلوكوز. الجلسرين في التخمير الدفعي في مفاعل حيوي على سطح الطاولة بحجم 0.3 لتر وحجم عمل قدره 0.1 لتر في ظل ظروف ثابتة من التحريض والرش المستمر لـ O₂ وشارك₂. لاحظنا أن التتر (27.1 جم/لتر و30.7 جم/لتر عند 0.333 فولت في الدقيقة (الحجم لكل حجم عمل في الدقيقة) من ثاني أكسيد الكربون₂ و 0.667 vvm من ثاني أكسيد الكربون₂، على التوالي) كانت أقل بكثير من العيار الذي تم الحصول عليه في تخمير دورق الرج (42.1 جم / لتر) (الشكل التكميلي SXNUMX). 10 أ ، ب). على وجه الخصوص، في حين يمكن إنتاج عيارات مماثلة من SA من الجلوكوز في كل من المفاعل ودورق الرج، فإن عيارات SA المنتجة خلال مرحلة استخدام الجلسرين كانت أقل بكثير في المفاعل الحيوي. أجرينا أيضًا عملية تخمير دفعة في مفاعل حيوي باستخدام السلالة g3473∆/PaGDH-DAK/g3837∆ ولاحظنا أن هذه السلالة يمكن أن تنتج المزيد من SA خلال مرحلة استهلاك الجلسرين ويمكن الحصول على عيار 38.8 جم/لتر من SA عند 0.167 vvm من O.₂ و 0.667 vvm من ثاني أكسيد الكربون₂ (الشكل التكميلي. 10 ج ، د). افترضنا أنه في حين تم استخدام الجلسرين في بيئة المفاعل الحيوي مع تهوية أعلى من بيئة قارورة الاهتزاز، قد يتم توجيه المزيد من تدفق الكربون إلى دورة TCA وأدى إلى انخفاض عيار SA؛ من ناحية أخرى، قد يؤدي حذف g3837 إلى كبح نشاط جينات دورة TCA وتحسين إنتاج SA. تم استخدام تحليل PCR في الوقت الحقيقي لمقارنة مستويات النسخ للجينات في مسار rTCA وبعض الجينات المحددة في دورة TCA (سيترات سينسيز، CIT; أكونيتاز, ACO; وإيزوسيترات ديهيدروجينيز، HDI) في سلالات g3473∆/PaGDH-DAK مع أو بدون حذف g3837 المزروع في وسط YP مع الجلسرين. لاحظنا أن خروج المغلوب من g3837 حافظ على تعبيرات مماثلة للجينات في مسار rTCA ولكنه خفض مستويات التعبير لـ CIT، تماثل ACOو HDIق (الشكل التكميلي. 11). وبالتالي، فإن الأنشطة المنخفضة للجينات في دورة TCA قد تؤدي إلى ارتفاع عيار SA الذي تم الحصول عليه بواسطة السلالة g3473∆/PaGDH-DAK/g3837∆ في المفاعل الحيوي. أنتج التخمير الدفعي للسلالة g3473∆/PaGDH-DAK/g3837∆ في وسط SC-URA مع تغذية الجلوكوز والجلسرين 109.5 جم/لتر من SA مع إنتاجية 0.65 جم/جم مكافئ الجلوكوز وإنتاجية 0.54 جم/ لتر/ساعة (الشكل. 3A). في نهاية عملية التخمير، لاحظنا تكوين بلورات، والتي كانت على الأرجح SA (الشكل التكميلي SXNUMX). 12). في حين أن الأحماض العضوية الأخرى، مثل حمض اللاكتيك وحمض الخليك، تكون قابلة للامتزاج تمامًا في المرق المائي عند درجة الحموضة 1-14، فإن قابلية ذوبان SA تتناقص عندما يصبح الرقم الهيدروجيني أكثر حمضية²⁷.

A تخمير الدفعة الفيدرالية للسلالة g3473∆/PaGDH-DAK/g3873∆ في الحد الأدنى من الوسط مع الجلوكوز والجلسرين. B التخمير الفيدرالي للسلالة g3473∆/PaGDH-DAK/ScSUC2 في وسط عصير قصب السكر. C التخمير الدفعي للسلالة g3473∆/PaGDH-DAK/ScSUC2 في وسط عصير قصب السكر في مفاعل تجريبي. يتم توفير بيانات المصدر كملف بيانات المصدر.

صورة بالحجم الكامل

بعد الأداء التخميري العالي للمؤتلف لدينا أنا شرقية باستخدام الحد الأدنى من الوسيلة المستخدمة عادة في المختبر، قمنا بعد ذلك باختبار إنتاج SA باستخدام ركيزة صناعية حقيقية، عصير قصب السكر. قصب السكر هو نبات C4 المعمر الأكثر كفاءة في استخدام الطاقة وله إنتاجية أعلى من الكتلة الحيوية مقارنة بالمحاصيل الأخرى مثل عشبة التبديل والميسكانثوس²⁸. علاوة على ذلك، فإن عصير قصب السكر، باعتباره مادة خام تعتمد على السكروز، أرخص من الجلوكوز والركائز القائمة على النشا مثل الذرة والكسافا.²⁹. منذ أنا شرقية غير قادر على الاستفادة من السكروز، الإنفرتيز SUC2 تبدأ من س. خميرة تم التعبير عنه في g3473∆/PaGDH-DAK. حدث التخمير الدفعي في أول 48 ساعة، ويمكن إنتاج SA عند عيار 46.0 جم/لتر، وإنتاجية 0.40 جم/جم مكافئ الجلوكوز، وإنتاجية 0.96 جم/لتر/ساعة. مع تغذية عصير قصب السكر المركز بعد ذلك، يمكن لسلالتنا الهندسية إنتاج SA عند عيار 104.6 جم / لتر، وإنتاجية 0.63 جم / جم مكافئ الجلوكوز، وإنتاجية 1.25 جم / لتر / ساعة على مقياس مقاعد البدلاء (الشكل XNUMX أ). 3B).

علاوة على ذلك، قمنا بتوسيع نطاق عملية التخمير SA باستخدام عصير قصب السكر من ميزان الطاولة إلى مقياس تجريبي. هنا، قمنا بتحديد معلمات العملية للحفاظ على مدخلات طاقة مماثلة لكل وحدة حجم ونفس رقم رينولدز بين المفاعلات الحيوية ذات الحجم التجريبي والمقياس التجريبي، وتم إجراء التخمير الدفعي في مفاعل حيوي على نطاق تجريبي بحجم 75 لترًا وعاملًا حجم 30 لترًا أو عامل توسيع يبلغ 300 × مقارنة بالمفاعل الحيوي الموجود على سطح الطاولة. يمكن لسلالتنا إنتاج SA عند عيار 63.1 جم / لتر، وإنتاجية 0.50 جم / جم مكافئ الجلوكوز، وإنتاجية 0.66 جم / لتر / ساعة عند الرقم الهيدروجيني 3 (الشكل XNUMX أ). 3C). نظرًا لمتطلبات الحجم، لم نحاول إجراء عملية تخمير دفعة غذائية على نطاق تجريبي؛ ومع ذلك، فإن عيارنا وإنتاجنا للتخمير الدفعي في المفاعل الحيوي على نطاق تجريبي كانا مماثلين لتلك الموجودة في المفاعلات الحيوية على نطاق مقاعد البدلاء. وهكذا، توقعنا أداءً مماثلاً للسلالة في عملية التخمير الدفعي على المستوى التجريبي.

لقد أكملنا أيضًا عملية الإنتاج الكاملة لـ SA من خلال تصميم DSP لاستعادة SA من مرق تخمير عصير قصب السكر باستخدام التقطير الفراغي على مرحلتين والبلورة. بدون مزيد من التحمض لمرق التخمير الذي يحتوي على 63.1 جم/لتر SA تم الحصول عليه من التخمير التجريبي، كان الحد الأقصى للإنتاجية 31.0% خلال المرحلة الأولى. تم بعد ذلك تركيز ناتج الترشيح من المرحلة 1 إلى 50% من حجمه باستخدام التقطير الفراغي وإخضاعه للمرحلة الثانية من التبلور. كان إنتاج SA من المرحلة 2 47.7%، وتم الحصول على كميات مماثلة من كريستال SA لكلا المرحلتين (1.98 جم للمرحلة 1 و2.10 جم للمرحلة 2). وبالتالي، من خلال التقطير الفراغي والبلورة على مرحلتين، تم الحصول على عائد استرداد SA الإجمالي بنسبة 64.0% من مرق التخمير منخفض الرقم الهيدروجيني. علاوة على ذلك، قدرت نقاء بلورات SA المستردة في المرحلة 1 والمرحلة 2 بـ 88.9% و86.23% على التوالي. وكانت النتيجة التي تم الحصول عليها متوافقة مع نتائج دراسة سابقة³⁰. من النتائج، كان من الواضح أن تبلور SA في درجة نقاء عالية (> 85٪) من مرق التخمير غير المعالج كان ناجحا. ومع ذلك، هناك حاجة إلى مزيد من البحث لإزالة شوائب التلوين لاستعادة بلورة SA من الدرجة التجارية.

التحليل الفني والاقتصادي وتقييم دورة الحياة

قمنا بتصميم ومحاكاة مصانع حيوية شاملة قادرة على قبول قصب السكر كمادة أولية، وتحويله إلى عصير قصب السكر (السكروز، والجلوكوز، والفركتوز)، وتخمير السكريات إلى SA باستخدام أنا شرقية، وفصل مرق التخمير لاستعادة بلورات SA المجففة (الشكل التكميلي XNUMX). 13) بطاقة إنتاجية سنوية تبلغ 26,800 طن متري من SA (بلغ الطلب العالمي على SA في عام 2013 حوالي 76,000 طن متري³¹). تمت محاكاة المصافي الحيوية في ظل سيناريوهات التخمير البديلة مع افتراضات المحصول والعيار والإنتاجية المقابلة لأداء التخمير الذي تم تحقيقه في وضع الدُفعات على نطاق المختبر (سيناريو الدُفعات المختبرية) ووضع الدُفعات المغذية (سيناريو الدُفعات المخبرية) بالإضافة إلى تجارب إعداد وضع الدفعة على نطاق تجريبي (سيناريو الدفعة التجريبية). لتوصيف الجدوى المالية والفوائد البيئية لمسارات SA المطورة، أجرينا TEA وLCA لكل سيناريو في ظل افتراضات خط الأساس وكذلك في ظل عدم اليقين (محاكاة مونت كارلو لعام 2000 لكل سيناريو مع أخذ عينات المكعب الفائق اللاتيني؛ توزيع النتائج على أرقام بديلة) تم الإبلاغ عن عمليات محاكاة مونت كارلو في الجدول التكميلي 1 ويتم الإبلاغ عن القيم الأساسية المفترضة وتوزيعات جميع المعلمات غير المؤكدة لكل سيناريو في البيانات التكميلية 1). استخدمنا الحد الأدنى لسعر بيع المنتج (MPSP، في عام 2016 مع معدل عائد داخلي قدره 10%)، وإمكانية الاحتباس الحراري لمدة 100 عام (GWP)₁₀₀; من المهد إلى اللحد)، واستهلاك الطاقة الأحفورية (FEC؛ من المهد إلى البوابة) كمقاييس لتمثيل نتائج TEA وLCA. لقد أجرينا أيضًا تحليلات الحساسية باستخدام معاملات ارتباط ترتيب رتبة سبيرمان (Spearman's ρ) لتحديد الدوافع الرئيسية لتكاليف الإنتاج والتأثيرات البيئية. أخيرًا، لتحديد الأهداف وترتيب أولوياتها لمزيد من التحسينات على الجدوى المالية والاستدامة البيئية، قمنا بتصميم ومحاكاة المصافي الحيوية عبر مشهد أداء التخمير المحتمل (على سبيل المثال، 2500 مجموعة من عيار الإنتاجية لكل منها عبر مجموعة من الإنتاجية لكل من التخمير المحايد ومنخفض الرقم الهيدروجيني) ).

استنادًا إلى الأداء التجريبي في سيناريو الدفعة المختبرية، يمكن للمصفاة الحيوية إنتاج SA بسعر MPSP يقدر بـ 1.70 دولار/كجم (خط الأساس؛ الشكل XNUMX). 4A) بنطاق يتراوح بين 1.51-1.92 دولارًا أمريكيًا/كجم (النسب المئوية 5-95؛ فيما يلي بين قوسين). القدرة على إحداث الاحترار العالمي للمصفاة الحيوية₁₀₀ و FEC في ظل هذا السيناريو قدرت بـ 1.95 كجم من ثاني أكسيد الكربون₂-مكافئ/كجم (1.37-2.65 كجم CO₂-مكافئ/كجم) و-3.74 ميجا جول/كجم (.12.9–5.39 ميجا جول/كجم)، على التوالي (الشكل XNUMX أ). 4B والشكل التكميلي. معالج الرسوميات PowerVR ). في سيناريو الدفعة المغذية المختبرية (مع تحسين عيار SA التخمير، والإنتاجية، والإنتاجية مقارنة بسيناريو الدفعة المختبرية)، كان MPSP للمصفاة الحيوية هو 1.06 دولار/كجم (0.96-1.22 دولار/كجم)، وإحداث الاحترار العالمي₁₀₀ كان 0.93 كجم من ثاني أكسيد الكربون₂-مكافئ/كجم (0.71-1.32 كجم CO₂- مكافئ / كجم)، وكان FEC .5.36 ميجا جول / كجم (.8.97–0.213 ميجا جول / كجم). في سيناريو الدفعة التجريبية (مع تحسن إنتاجية SA وعيار التخمير مقارنة بسيناريو الدفعة المختبرية ولكن أقل من تلك الخاصة بسيناريو الدفعة المغذية في المختبر، وإنتاجية أقل من كلا السيناريوهين المختبريين)، كان لدى المصفاة الحيوية MPSP تقديري قدره 1.37 دولار/كجم (1.23-1.54 دولار/كجم)، القدرة على إحداث الاحترار العالمي₁₀₀ 1.67 كجم من ثاني أكسيد الكربون₂-مكافئ/كجم (1.22-2.17 كجم CO₂- مكافئ/كجم)، وFEC بقيمة .0.21 ميجا جول/كجم (.7.08 إلى 6.47 ميجا جول/كجم). تم أيضًا عرض مخطط سانكي الذي يصور تدفق الكربون عبر المصفاة الحيوية لهذا السيناريو في الشكل التكميلي XNUMX. 15.

حالات عدم اليقين (المؤامرات المربعة والشريطية) والانهيارات (المخططات الشريطية المكدسة) لـ (A) الحد الأدنى لسعر بيع المنتج (MPSP) و (B) احتمالية الاحتباس الحراري من المهد إلى اللحد لمدة 100 عام (GWP₁₀₀). تمثل الشعيرات والمربعات والخط الأوسط النسب المئوية 5/95 و25/75 و50 من عمليات محاكاة مونت كارلو لعام 2000 (n = 2000 محاكاة) لكل سيناريو. تمثل علامات البنتاغون والمربع والماس نتائج خط الأساس لسيناريوهات دفعة المختبر (دفعة المختبر) دفعة التغذية المختبرية (دفعة تغذية المختبر) والدفعة التجريبية (الدفعة التجريبية)، على التوالي. تعرض المخططات الشريطية المكدسة نتائج خط الأساس لسيناريو الدفعة التجريبية؛ يتم تضمين نتائج السيناريوهات الأخرى في SI. يشمل استهلاك الكهرباء استهلاك النظام فقط؛ تم استبعاد الإنتاج من التفصيل المصور لوضوح الشكل. بيانات تفصيلية مجدولة لتكاليف المواد والمعدات المثبتة، ورسوم التدفئة والتبريد، واستخدام الكهرباء، والقدرة على إحداث الاحترار العالمي₁₀₀وFEC متاحة على الإنترنت⁶². تشير الخطوط الرمادية الداكنة الموسومة إلى التأثيرات المُبلغ عنها على مسارات الإنتاج القائمة على الحفريات (ص ١⁵²; f2-f4⁵¹). تشير الخطوط ذات اللون الرمادي الفاتح إلى التأثيرات المبلغ عنها لمسارات الإنتاج الحيوية البديلة (ب1⁵¹; ب2⁵³; ب3⁵²). حيث الاحترار العالمي₁₀₀ تم الإبلاغ عنها على أنها من المهد إلى البوابة، وتم إضافة 1.49 كجم من مكافئ ثاني أكسيد الكربون/كجم كتأثيرات نهاية العمر من أجل الاتساق مع هذه الدراسة وDunn et al. 2. يتم سرد القيم لجميع MPSPs المبلغ عنها والتأثيرات قبل وبعد التعديل في الجدول التكميلي 3 و 4. (C, D) مسب و (E, F) القدرة على إحداث الاحترار العالمي₁₀₀ عبر 2500 مجموعة من عيار إنتاجية التخمير عند الإنتاجية الأساسية لسيناريو الدفعة التجريبية (0.66 جم/لتر/ساعة) للمحايد (اللوحة اليسرى؛ C, E) ودرجة الحموضة المنخفضة (اللوحة اليمنى؛ D, F) التخمير. يظهر العائد كنسبة مئوية من الحد الأقصى النظري (% النظري) المدرج إلى الحد الأقصى النظري للعائد البالغ 1.31 جم/جم من مكافئ الجلوكوز (استنادًا إلى توازن الكربون). بالنسبة لنقطة معينة على الشكل، فإن xتمثل قيمة المحور - العائد، وتمثل قيمة المحور y العيار، وتمثل خطوط اللون والخطوط الكنتورية قيمة MPSP، GWP₁₀₀. تُظهر العلامات الماسية نتائج خط الأساس لسيناريو الدفعة التجريبية. يتم توفير بيانات المصدر كملف بيانات المصدر.

صورة بالحجم الكامل

عبر المعلمات الـ 28 التي يُعزى إليها عدم اليقين في سيناريو الدفعة التجريبية، وجدنا أن MPSP كان الأكثر حساسية لإنتاجية SA التخمير (Spearman's ρ of .0.60؛ جميع توزيعات عدم اليقين مدرجة في البيانات التكميلية 1 وترد قيم ρ لسبيرمان لجميع المعلمات في الجدول التكميلي 2). كان MPSP أيضًا حساسًا بشكل كبير لسعر وحدة تغذية قصب السكر (Spearman's ρ 0.39)، ووقت تشغيل المصنع (.0.38)، وقدرة المصنع على تغذية قصب السكر (.0.31)، وعيار SA للتخمير (.0.30). إحداث الاحترار العالمي₁₀₀ كان الأكثر حساسية لكفاءة الغلاية (سبيرمان ρ لـ .0.63). إحداث الاحترار العالمي₁₀₀ كان أيضًا حساسًا بشكل كبير لعيار التخمير SA والإنتاجية، مع قيم ρ لسبيرمان البالغة .0.62 و0.32 على التوالي. كان FEC أكثر حساسية لإنتاجية التخمير SA (Spearman's ρ 0.63)، كما كان حساسًا لكفاءة الغلاية (.0.56) وعيار التخمير SA (.0.49). لتوصيف الآثار المترتبة على أداء التخمير بشكل أكبر، أجرينا TEA وLCA عبر مشهد أداء التخمير (الشكل XNUMX أ). 4C-F والشكل التكميلي. 14 ب ، ج) ، محاكاة 2500 مجموعة من عيار الإنتاجية عبر مجموعة من الإنتاجية لكل من النظامين البديلين: التخمير منخفض الرقم الهيدروجيني (أي مع التخمير عند درجة حموضة 3 يتم التحكم فيها باستخدام إضافة القاعدة أثناء التخمير وعدم الحاجة إلى تحمض بعد التخمير) والتخمير المحايد (أي مع تحييد كامل لـ SA عن طريق إضافة القاعدة أثناء التخمير وإعادة التحميض الكاملة بعد التخمير). تم عرض نتائج سيناريو بديل منخفض الأس الهيدروجيني مع إعادة التحمض المطلوبة بعد التخمير في الشكل التكميلي XNUMX. 16.

• محتوى مدعوم من تحسين محركات البحث وتوزيع العلاقات العامة. تضخيم اليوم.
• PlatoData.Network Vertical Generative Ai. تمكين نفسك. الوصول هنا.
• أفلاطونايستريم. ذكاء Web3. تضخيم المعرفة. الوصول هنا.
• أفلاطون كربون، كلينتك ، الطاقة، بيئة، شمسي، إدارة المخلفات. الوصول هنا.
• أفلاطون هيلث. التكنولوجيا الحيوية وذكاء التجارب السريرية. الوصول هنا.
• المصدر https://www.nature.com/articles/s41467-023-41616-9