زراعة الخلايا

تم تمييز الخلايا الشحمية البنية عن خط خلايا الفأر preadipcyt البني المخلّد الذي قدمه B. Spiegelman (جامعة هارفارد) كما هو موضح سابقًا¹⁹. تم الحفاظ على الخلايا التمهيدية وتوسيعها عند التقاء منخفض (<50٪) في وسط النمو (متوسط ​​الجلوكوز المرتفع في النسر المعدل في Dulbecco (Gibco)، مع 20٪ من مصل الأبقار الجنيني (Sigma-Aldrich)، 20 مم HEPES (Sigma-Aldrich) و 100 يو مل^-1 البنسلين - الستربتومايسين (جيبكو)). للتمايز، تم غسل الخلايا الشحمية مرتين بمحلول مخزن بالفوسفات (PBS) (Gibco، pH 7.4، 1 ×)، وفصلها مع TrypLE Express، وتم زرعها بكثافة تبلغ حوالي 23,000 خلية سم^-2 في وسط النمو . تم تغيير الوسيط بعد 24 ساعة إلى وسط تمايز (وسط نسر Dulbecco المعدّل، الجلوكوز العالي، مكمل بـ 10٪ من مصل الأبقار الجنيني، 20 نانومتر من الأنسولين، 1 نانومتر ثلاثي يودوثيرونين و 100 يو مل).^-1 البنسلين - الستربتومايسين) وتم زراعة الخلايا لمدة يومين. تم بعد ذلك إحداث تمايز الخلايا عن طريق إضافة وسيط تحريضي (وسائط تمايز مكملة بـ 2 ملي إندوميتاسين و 0.125 ميكرومتر ديكساميثازون و 0.5 ملي مولار إيزوبوتيل ميثيل زانثين) لمدة يومين، وبعد ذلك تم تغيير الوسيط إلى وسط التمايز لمدة يومين إضافيين. تم غسل الخلايا الشحمية المتمايزة مرة واحدة باستخدام وسط التجويع (وسط نسر Dulbecco المعدّل ، الجلوكوز المنخفض (Gibco) ، مع إضافة الجلوكوز إلى تركيز نهائي قدره 0.5 مم ، 2٪ من ألبومين المصل البقري (Sigma-Aldrich) و 8 U ml^-1 البنسلين - الستربتومايسين) وحضنت لمدة ساعتين في وسط التجويع قبل العلاج باستخدام الأنسولين NanoRods أو NanoRods المخفف في وسط التجويع للأوقات المشار إليها في النص الرئيسي. بعد العلاج، تم غسل الخلايا مرة واحدة في برنامج تلفزيوني وحصادها لعزل البروتين من أجل الكتل المناعية أو الحمض النووي الريبي للتعبير الجيني. لتحليل الأشعة تحت الحمراء بواسطة DNA-PAINT، تم التمييز بين الخلايا الشحمية كما هو موضح أعلاه مع التعديلات التالية. بعد العلاج باستخدام الوسيط التعريفي، تم فصل الخلايا باستخدام TrypLE Express وتم زرعها في وسط التمايز في آبار μ-Slide 2 Well Glass Bottom (ibidi). بعد يومين، تم تحضين الخلايا بوسط التجويع لمدة ساعتين يليه العلاج بـ 18 نانومتر من الأنسولين في وسط التجويع لمدة 2 دقائق. في تجارب المراقبة، تم حذف إضافة الأنسولين. قبل العلاج، تم تحليل الخلايا الشحمية المتمايزة بصريًا لتقييم كثافة سطح الخلية وتقييم تمايز الخلايا، ثم تم تخصيصها عشوائيًا لمجموعتي العلاج والسيطرة.

تمت صيانة الخلايا وتوسيعها وتمييزها في جو رطب يحتوي على 5٪ من ثاني أكسيد الكربون₂ عند 37 درجة مئوية.

طلاء الحمض النووي للأشعة تحت الحمراء

تم إصلاح الخلايا الشحمية المتمايزة لمدة 12 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة (RT) مع بارافورمالدهيد 4٪ مُسخن مسبقًا في PBS، وتم غسلها ثلاث مرات باستخدام PBS، وتم حظرها لمدة 90 دقيقة عند RT باستخدام محلول مانع (3.0٪ مصل بقري جنيني / 0.1٪ Triton X). -100 في برنامج تلفزيوني) واحتضانها مع الأجسام المضادة للأرنب IR β (تشوير الخلية (4B8)؛ التخفيف 1:300 في محلول الحظر) لمدة يومين عند 2 درجات مئوية. تم بعد ذلك غسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS واحتضانها باستخدام الجسم النانوي FluoTag-XM-QC المضاد للأرنب IgG (الضوئيات الضخمة) المخفف بنسبة 4: 1 في مخزن مؤقت مانع (الضوئيات الضخمة) لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة. بعد ثلاث عمليات غسل باستخدام PBS، تم تحضين الخلايا بجسيمات ذهبية نانوية بحجم 200 نانومتر (Sigma-Aldrich؛ تخفيف بنسبة 1:80 في المخزن المؤقت للحجب) لمدة 1 دقائق. تم غسل الخلايا مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني واحتضانها بخيوط تحمل علامة Cy5b بـ 10 نانومتر (ضوئيات ضخمة) مخففة في مخزن مؤقت للصور (ضوئيات ضخمة).

تم إجراء التصوير على مجهر Nikon ECLIPSE Ti-E مع نظام التركيز المثالي (Nikon Instruments)، مع تطبيق تكوين مضان انعكاس داخلي إجمالي من النوع الموضوعي باستخدام وحدة مضان الانعكاس الداخلي الكلي الدائرية iLAS2 (أنظمة Gataca) مع غمر بالزيت 1.49 فتحة رقمية CFI Plan Apo هدف مضان الانعكاس الداخلي الإجمالي × 100 (Nikon Instruments) مزود بتكبير Optovar المساعد × 1.5 المطابق لحجم البكسل النهائي البالغ 87 نانومتر. كان الليزر المستخدم هو OBIS 561 نانومتر LS 150 ميجاوات (متماسك) مع بصريات توسيع شعاع إدخال iLas المخصصة (Cairn) المُحسّنة لتقليل التصوير فائق الدقة للمجال. تم تمرير شعاع ضوء الفلورسنت أولاً من خلال مكعب مرشح (89901، تقنية Chroma) يحتوي على مرشح الإثارة رباعي النطاق، ومرشح مزدوج اللون رباعي النطاق، ومرشح انبعاث رباعي النطاق (ZET405/488/561/640x، ZET405/488/561/640bs وZET405) /488/561/640 م، تقنية الكروما). تمت بعد ذلك تصفية ضوء الإسفار طيفيًا باستخدام مرشح انبعاث (ET595/50m، تقنية Chroma) وتم تصويره على كاميرا جهاز مزدوج الشحنة مضاعف الإلكترون iXon Ultra 888 (Andor). تم استخدام برنامج Micro-Manager v. 1.4 للحصول على 12,000 إطار بإطار قراءة بسرعة 10 ميجاهرتز، وتعريض يبلغ 130 مللي ثانية وبدون كسب مضاعفة للإلكترون. تم تصوير ما مجموعه عشر خلايا من ثلاث تجارب مستقلة في كل حالة (ملاحظة تكميلية والشكل التكميلي. 1).

إنتاج وتنقية INS-DNA

أنسولين (ميرك 1 مجم مل^-1) تم تفاعله مع ثنائي بنزوسيكلوكتين-سلفو-N-hydroxysuccinimidyl استر (DBCO-sulfo-NHS، انقر فوق أدوات الكيمياء؛ 690 ميكرومتر) في 100 ملي مولار Na₂CO₃ المخزن المؤقت (الرقم الهيدروجيني 11.5) لمدة 20 دقيقة عند RT. تم بعد ذلك إخماد التفاعل لمدة 5 دقائق من خلال إضافة قاعدة Tris (Sigma-Aldrich، 100 مم). تم غسل المحلول ثلاث مرات باستخدام 400 ميكرولتر من 100 ملي مولار Na₂CO₃ باستخدام وحدات تصفية الطرد المركزي Amicon Ultra سعة 0.5 مل مع غشاء مقطوع بقدرة 3 كيلو دالتون (Merck). في كل خطوة غسيل، تم تدوير الأعمدة لمدة 10 دقائق عند 14,000×g. بعد خطوة الغسيل النهائية، تم خلط الأنسولين-DBCO (690 ميكرومتر) مع الحمض النووي المعدل بالأزيد (البيومرات، 35 ميكرومتر؛ جدول إضافي 3) في 100 ملم نا₂CO₃ ويترك للرد لمدة 3 ساعات عند RT. تم إخماد التفاعل بإضافة NaN₃ (سيجما الدريخ، 6.9 ملم). تم تشغيل العينات على هلام بولي أكريلاميد أصلي (6٪ 19: 1 بولي أكريلاميد في 1 × TAE، 20 دقيقة، 200 فولت، TAE قيد التشغيل المخزن المؤقت) وملطخ بـ SYBR Gold (Thermo Fisher) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة، لتأكيد INS- تكوين الحمض النووي. تم إجراء التصوير باستخدام جهاز تصوير هلام ImageQuant LAS 4000. تم تحسين بروتوكول اقتران الأنسولين-DBCO-sulfo-NHS لتعزيز ربط ssDNA oligo بالليسين-29 من السلسلة B (B29 ليسين) مقارنة بمجموعات الأمين في N نهايات سلسلتي الأنسولين A وB. قيمة pKa للأمين B29 أعلى من قيمة أمينات الاثنين N تيرميني (11.2 مقابل 8.6 و6.8). عند درجة حموضة عالية، من المتوقع أن تتفاعل مجموعة NHS للرابط المتشابك بشكل تفضيلي مع مجموعة الأمين الأساسية، وهي B29 ليسين أمين³². لذلك، تم تحسين ظروف تفاعل الرقم الهيدروجيني للترويج لمنتج INS-DNA واحد.

تمت تنقية مخاليط تفاعل INS-DNA بواسطة تحليل كروماتوجرافي سائل عالي الأداء في المرحلة العكسية C₁₈ العمود (أجيلنت بوروشيل 120 EC-C₁₈) على شركة Amersham Pharmacia Biotech ÄKTA Ettan LC. تم استخدام المخزن المؤقت A (50 مم خلات ثلاثي إيثيل أمين) والمخزن المؤقت B (90٪ أسيتونيتريل و 10٪ المخزن المؤقت A) في ملف تعريف متدرج، حيث تمت زيادة نسبة المخزن المؤقت B من 30٪ إلى 50٪ على مدى 20 دقيقة. تم جمع الكسور ولفها في مكثف فراغ (Thermo Scientific SpeedVac Savant DNA 120) لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة عالية لإزالة المكونات المتطايرة للمخازن المؤقتة للكروماتوجرافيا السائلة عالية الأداء. تم تبادل القمم المحددة إلى PBS باستخدام وحدات مرشح الطرد المركزي Amicon Ultra 0.5 مل مع غشاء قطع 3 كيلو دالتون (Merck)، عن طريق الدوران ثلاث مرات لمدة 10 دقائق عند 14,000 ×g والغسيل في كل مرة مع 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. تم تشغيل عينات من الكسور النقية على هلام بولي أكريلاميد أصلي وملطخة بـ SYBR Gold (Thermo Fisher) لتصور INS-DNA المنقى. تم تحليل النقاء النهائي للاقترانات لكل تحضير من خلال ثلاث طرق: مقارنة شدة شريط تلطيخ الفضة (Pierce Silver Stain Kit) على رحلان الصوديوم الكهربائي بجيل دوديسيل كبريتات بولي أكريلاميد (Invitrogen، 4-12٪ Bolt gel) مقابل معايير الأنسولين (Merck). ، مقارنة كثافة نطاق SYBR Gold على الفصل الكهربائي الأصلي لجيل بولي أكريلاميد مقابل معايير الحمض النووي (تقنيات الحمض النووي المتكاملة) ومن خلال مجموعة فحص Qubit ssDNA (Qubit 4 Fluorimeter، Invitrogen). تم حساب التركيزات النهائية لـ INS-DNA بناءً على قياسات Qubit ssDNA. تم تجميد INS-DNA المنقى وتخزينه عند درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى استخدامه مرة أخرى.

إنتاج NanoRods وNanoRods الأنسولين

تم تحضير هياكل الأوريجامي عن طريق خلط DNA البلازميد للسقالة (p7560، Tilibit، 10 nM) مع الخيوط الأساسية المناسبة (Integrated DNA Technologies، 100 nM) (الجداول التكميلية 4-9) في مخزن مؤقت قابل للطي (5.0 ملي مولار تريس عند درجة الحموضة 8.5 (سيجما الدريخ)، 1.0 ملي مولار EDTA (Panreac AppliChem) و12.5 ملي مولار MgCl₂ (سيجما الدريخ)). تم بعد ذلك وضع المزيج في دراجة حرارية (MJ Research PTC-225 Gradient Thermal Cycler) وتصلبه بالتسخين إلى 80.0 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، والتبريد إلى 60.0 درجة مئوية عند 1.0 درجة مئوية لكل دقيقة على مدار 20 دقيقة ثم التبريد ببطء إلى 20.0 درجة مئوية عند 0.5 درجة مئوية في الدقيقة. تمت إزالة الدبابيس الزائدة باستخدام وحدات مرشح الطرد المركزي Amicon Ultra 0.5 مل مع غشاء مقطوع 100 كيلو دالتون (Merck) عن طريق الدوران خمس مرات لمدة دقيقتين عند 2 ×g ويغسل في كل مرة باستخدام 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت القابل للطي. تم تحديد تركيز البنية المنقى عن طريق قياس امتصاص الحمض النووي عند 260 نانومتر (Thermo Scientific NanoDrop 2000). تمت بعد ذلك إضافة INS-DNA المنقى بمقدار 3 × فائض متكافئ إلى مواقع ربط الخيوط الممتدة المتوفرة على هيكل NanoRod وتصلبه في دراجة حرارية عن طريق التسخين إلى 37.0 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة، والتبريد إلى 1 درجة مئوية عند 22.0 درجة مئوية في الدقيقة، الحضانة عند 0.1 درجة مئوية لمدة 22.0 ساعة والتبريد إلى 14 درجة مئوية عند 4.0 درجة مئوية في الدقيقة. تمت إزالة INS-DNA غير المنضم باستخدام وحدات مرشح الطرد المركزي Amicon Ultra 0.1 مل مع غشاء مقطوع 0.5 كيلو دالتون (Merck)، يدور خمس مرات لمدة دقيقتين عند 100 ×g والغسيل في كل مرة مع 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني + 10 ملي MgCl₂. تم تخزين الأنسولين NanoRods عند درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.

الاغاروز الكهربائي للهلام

تم تحليل هياكل NanoRod عن طريق تشغيل عينات على المواد الهلامية agarose على الجليد لمدة 4 ساعات عند 70 فولت. وتتكون المواد الهلامية من 2٪ agarose (Thermo Scientific TopVision Agarose) في محلول 0.5 × TBE (Panreac AppliChem) بالإضافة إلى 10 ملي مولار MgCl₂ (Sigma-Aldrich) و1 × SYBR Safe DNA وصمة عار (Invitrogen). تم إجراء التصوير باستخدام جهاز تصوير هلام ImageQuant LAS 4000.

تفكك الضوء الديناميكي

تم تحضير عينات NanoRod والأنسولين NanoRod في PBS + 10 ملي مولار MgCl₂، تمت تصفية الحقنة باستخدام أغشية 0.1 ميكرومتر (Merck) وتم تحليلها باستخدام أداة Zetasizer Ultra (Malvern Panalytical). تم أخذ ثلاثة قياسات عند 25 درجة مئوية في خلية منخفضة الحجم (ZSU1002) ثم تم حساب متوسطها.

محاكاة oxDNA لـ NanoRod

تم تحليل هياكل NR وNR-1 وNR-2 وNR-4 وNR-7 وNR-15 باستخدام نمذجة الحبيبات الخشنة oxDNA (https://oxdna.org/). تم إنشاء هياكل NanoRod مع خيوط dsDNA الممتدة من مواقع دمج الأنسولين باستخدام vHelix وتحويلها إلى تنسيق oxDNA باستخدام موقع الويب tacoxDNA (http://tacoxdna.sissa.it/). تم تقديم الهياكل إلى oxDNA.org خادم الويب للمحاكاة عند 37 درجة مئوية، مع 1 كتركيز الملح، 1 × 10⁸ خطوات الوقت مع الإعلانt قيمة 0.0001، وخطوة تخفيف أولية مع المعلمات الافتراضية. تم تصور عمليات المحاكاة وتم إنتاج مقاطع الفيديو باستخدام أداة oxView (https://oxdna.org/).

تلطيخ سلبي TEM

تم توزيع NanoRods المنقى (10 نانومتر) على شبكة TEM نحاسية مفرغة ومدعومة بالكربون (TEM-CF200CU50، Thermo Fisher Scientific) وحضنت لمدة 60 ثانية قبل إزالة المحلول. تم بعد ذلك تلوين الشبكات لمدة 10 ثوانٍ باستخدام 5 ميكرولتر من فورمات اليورانيل بنسبة 2% وزن/حجم، والتي تمت إزالتها لاحقًا. تم تكرار إجراء التلوين سبع مرات وتم تجفيف شبكات TEM بالهواء لمدة 30 دقيقة قبل التصوير. تم إجراء التصوير على Talos 120C G2 (120 كيلو فولت، كاشف Ceta-D) عند × 92,000 لمشاهد المجال القريب. تمت معالجة الصور الأولية باستخدام برنامج ImageJ (الإصدار 1.53).

AFM

تم تصوير هياكل NanoRod على قرص من الميكا مثبت بمادة لاصقة إيبوكسي في وسط شريحة المجهر ومحاطة بحلقة بلاستيكية متصلة بالشريحة باستخدام Reprorubber. تم تخفيف الهياكل النانوية إلى 1 نانومتر في المخزن المؤقت TE-Mg (قاعدة Tris 5 مم ، 1 مم EDTA ، 10 مم MgCl₂، درجة الحموضة 8.0) وتم ضخ 10 ميكرولتر على الميكا المشقوقة حديثًا. بعد 30 ثانية، 4 ميكرولتر من 5 ملي نيسو₄ تمت إضافته واحتضانه لمدة 4.5 دقيقة أخرى. تم بعد ذلك شطف السطح باستخدام 1.0 مل من محلول TE-Mg المُصفى بقطر 0.1 ميكرومتر، وبعد ذلك تمت إضافة 1.5 مل من محلول TE-Mg المُصفى إلى قرص الميكا للتصوير. تم إجراء التصوير في السائل باستخدام مجهر القوة الذرية JPK Instruments NanoWizard 3 Ultra مع ناتئ Bruker AC40 في وضع التيار المتردد.

طلاء الحمض النووي لهياكل الأنسولين النانوية النانوية

تم تنظيف الآبار ذات القاع الزجاجي ذات 18 شريحة (ibidi) باستخدام الأيزوبروبانول وتجفيفها باستخدام N₂. تم تحضين الآبار بـ 1 ملغ^-1 ألبومين مصل البيوتين البقري (ثيرمو فيشر) في المخزن المؤقت A (10 ملي مولار تريس-حمض الهيدروكلوريك، 100 ملي مول كلوريد الصوديوم و0.05% (حجم/حجم) توين 20 عند درجة الحموضة 8.0) لمدة 5 دقائق عند درجة حرارة الغرفة، وغسله ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت A واحتضانه بـ 0.5 ملجم مل^-1 نيوترافيدين (ثيرمو فيشر) في المخزن المؤقت A لمدة 5 دقائق عند RT. تم بعد ذلك غسل الآبار ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت A متبوعًا بثلاث عمليات غسل باستخدام المخزن المؤقت B (5 مللي مولار Tris-HCl، 10 مللي مولار MgCl₂، 1 ملم EDTA و 0.05٪ (حجم / حجم) توين 20 عند درجة الحموضة 8.0). بعد ذلك، تحتوي 500 ميكرومتر من قضبان النانو على أربعة خيوط من الحمض النووي تحمل علامة البيوتين (البيانات الموسعة الشكل XNUMX). 2a) ، مع INS-DNA الذي يحتوي على تسلسل لرسو السفن PAINT مكون من 9 نيوكليوتيدات (DS1 ؛ جدول إضافي 3) ، تمت إضافته إلى كل بئر لمدة 5 دقائق. تم غسل الآبار ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت B. ثم، 1 نانومتر من حبلا تصوير Atto-647N (IS1؛ جدول إضافي 10) في المخزن المؤقت B المكمل بكاسحات الأكسجين (حمض البروتوكاتيكويك (Sigma) ، تمت إضافة protocatechuate 3,4،2-dioxygenase (Sigma) و Trolox (Sigma)) إلى كل بئر. بالنسبة لـ PAINT ثنائي التبادل، هناك ثلاثة تسلسلات لرسو السفن (DSXNUMX؛ الجدول التكميلي XNUMX). 10) تمت إضافتها على طرفي NanoRods. تم إعداد العينات كما هو موضح سابقًا، مع غسل الآبار عشر مرات باستخدام المخزن المؤقت B بين كل عملية شراء للتصوير. تم إجراء كل عملية شراء للتصوير باستخدام شريط تصوير Atto-647N مختلف (IS1 وIS2؛ جدول إضافي 10). تم استخدام برنامج Micro-Manager للحصول على 9,000 إطار بإطار قراءة بسرعة 10 ميجاهرتز، وتعرض لمدة 200 مللي ثانية وعدم وجود مكاسب مضاعفة للإلكترون (ملاحظة تكميلية والتين التكميلية. 2 و 3).

SPR

تم استخدام أداة Biacore T200 (Cytiva) لإجراء تجارب SPR وتم الحصول على البيانات باستخدام برنامج التحكم في نظام Biacore T200 v.2.01. تم تجميد ECD-IR (Nordic BioSite) باستخدام Biotinylated على شريحة استشعار الستربتافيدين SA (Cytiva). تم استخدام المخزن المؤقت HBS-P + (Cytiva) كمخزن مؤقت قيد التشغيل. بعد تجميد ECD-IR، تم تقديم وقت تثبيت قدره 15 دقيقة للوصول إلى خط أساس مستقر. تم حقن NR-1، NR-2، NR-4، NR-7، NR-15، NR-8 وNR-8dsDNA بتركيز 11.4 نانومتر من الأنسولين في المخزن المؤقت قيد التشغيل. تم حقن الأنسولين وINS-DNA عند 55 نانومتر، وهو الحد الأدنى للتركيز للحصول على منحنى ربط يمكن تحليله. تم حقن NR كعنصر تحكم سلبي بتركيز يساوي أعلى تركيز لـ NanoRod المستخدم في حقن الأنسولين NanoRod (NR-1 = 11.4 نانومتر). وبدلاً من ذلك، تم حقن NR-2 وNR-4 وNR-7 وNR-15 بتركيز 5.7 نانومتر من البنية النانوية (البيانات الموسعة الشكل XNUMX). 4e)، وNR-7^K-PEG تم حقنه أيضًا بتركيز 50 نانومتر من الأنسولين (البيانات الموسعة الشكل XNUMX). 9c). تم إجراء حقن كل عينة باستخدام مرحلة الارتباط لمدة 180 ثانية ومرحلة التفكك لمدة 300 ثانية. ثابت توازن التفكك (K_D) ، معدل الارتباط ثابت (k_on) ومعدل التفكك ثابت (k_خصم) تم تحديدها باستخدام برنامج BIAevaluation 3.0. ال t_1/2 تم تحديد القيم التي تحدد وقت الإقامة باستخدام الصيغة ln2/k_خصم. لمقارنة ربط هياكل NR-7 بين IR وIGF1R، تم تثبيت بروتينات ECD-IR وECD-IGF1R (Nordic BioSite) على خليتين تدفق مختلفتين لرقائق مستشعر CM5 عبر تفاعلات اقتران الأمين، وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم اختبار ارتباط الأنسولين وINS-DNA عن طريق حقن تركيزات مختلفة من الأنسولين (6.2، 18.5، 55.6، 166.7 و500.0 نانومتر) في المخزن المؤقت قيد التشغيل (HBS-P+) في الوضع الحركي أحادي الدورة، باستخدام مرحلة الارتباط من 140 ثانية ومرحلة تفكك 300 ثانية. تم اختبار ربط NR-7 عن طريق حقن تركيز واحد من البنية (11.4 نانومتر من الأنسولين) باستخدام مرحلة ارتباط مدتها 180 ثانية ومرحلة تفكك مدتها 300 ثانية.

جل كوماسي

هنا تمت إعادة تعليق 0.5 ميكروغرام من ECD-IR المؤتلف (Nordic BioSite) في المخزن المؤقت لعينة Laemmli (Bio-Rad). لتقليل الظروف، تمت إضافة 2-ميركابتوإيثانول إلى التركيز النهائي بنسبة 2.5%. تم تغيير طبيعة العينات عند 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وتم حلها بواسطة رحلان كهربائي لهلام دوديسيل كبريتات بولي أكريلاميد الصوديوم وملطخة بصبغة البروتين الآمن GelCode Blue (Thermo Fisher Scientific).

فحص التحول هلام

تم تحضين NanoRods (NR وNR-7) عند 20 نانومتر مع 300 نانومتر من المجال خارج الخلية المؤتلف من الأشعة تحت الحمراء البشرية (Nordic BioSite) أو مع PBS لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تم بعد ذلك تشغيل العينات على هلام الاغاروز 2٪ وملطخة بـ SYBR Safe.

Immunoblotting

تم غسل الخلايا باستخدام PBS، وتم وضعها في محلول مقايسة الهطول المناعي الإشعاعي (Sigma-Aldrich) مع إضافة كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني والفوسفاتيز (Thermo Fisher Scientific) واحتضانها على الجليد مع الرج لمدة 30 دقيقة. تمت تصفية المحللة بواسطة الطرد المركزي (20,000×g لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية) وتم قياس كمية البروتين باستخدام اختبار بروتين برادفورد (Bio-Rad). تمت إعادة تعليق محلول البروتين في المخزن المؤقت لعينة Laemmli (Bio-Rad) الذي يحتوي على 2.5٪ من 2-ميركابتوإيثانول، تم تغيير طبيعةه عند 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وتم حله بواسطة رحلان كهربائي لهلام دوديسيل كبريتات بولي أكريلاميد الصوديوم ونقله إلى أغشية فلوريد البولي فينيلدين. تم تحضين الأغشية لمدة ساعة واحدة في محلول مانع (محلول ملحي تريس مع 1٪ توين 0.1 (TBST) و20٪ حليب جاف خالي من الدهون)، تليها حضانة طوال الليل عند 5.0 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية ضد بيتا الفوسفو-IR / IGF4R بيتا (CST 1، 3024:1)، phospho-AKT-S1,000 (CST 473، 4058:1) أو GAPDH (Invitrogen PA1,000-1، 987:1). بعد ثلاث عمليات غسل باستخدام TBST، تم تحضين الأغشية بالأجسام المضادة الثانوية المرتبطة ببيروكسيداز الفجل (Invitrogen، 5,000، 31460:1) لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة. تم إجراء الكشف عن بيروكسيداز الفجل بواسطة الركيزة الكيميائية Immobilon Forte على نظام التصوير ChemiDoc (Bio-Rad). تم إجراء قياس كثافة النطاق باستخدام برنامج ImageJ.

التدفق الخلوي

تم تحضير الخلايا الشحمية المتمايزة المتعطشة للمصل كما هو موضح أعلاه. تم بعد ذلك غسل الخلايا الشحمية مرتين باستخدام محلول ملح هانكس المتوازن (HBSS) وفصلها في محلول كولاجيناز D (1.5 U ml^-1 كولاجيناز د (روش) و10 ملي CaCl₂ في HBSS) لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تمت إعادة تعليق الخلايا في HBSS، وتم ترشيحها من خلال مصفاة خلايا معايرتها HBSS بحجم 35 ميكرومتر (BD Biosciences)، وتم تكويرها عند 300 ×g لمدة 5 دقائق وتم إعادة تعليقه في المخزن المؤقت للتلوين (1 × PBS و1% من ألبومين المصل البقري). تمت تسمية الخلايا الميتة بـ LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit (Thermo Fisher Scientific) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة، وبعد ذلك، تم تكوير تعليق الخلية عند 300 ×g لمدة 5 دقائق وتم تعليقه في المخزن المؤقت للتلوين. هنا تم تحضين حوالي 100,000 خلية بهياكل NanoRod ذات 10 نانومتر ATTO-647 في حجم نهائي قدره 100 ميكرولتر لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. تم استخدام الخلايا المحتضنة بدون هياكل NanoRod كعنصر تحكم غير معالج. تم بعد ذلك غسل الخلايا مرتين باستخدام المخزن المؤقت للتلوين بواسطة الطرد المركزي عند 300 ×g لمدة 5 دقائق. تم إجراء قياسات التدفق الخلوي على BD FACSCANTO II باستخدام برنامج BD FACSDIVA v.9.0 (BD Biosciences). تم التعرف في البداية على الخلايا الشحمية الحية عن طريق الخلايا النابضة على FSC-A مقابل AmCyan-A، تليها النابضة على FSC-A مقابل FSC-H للكشف عن المفردات. تم تحليل البيانات المكتسبة باستخدام برنامج FlowJo 10.7.1 (BD Biosciences). تم استخدام المتوسط ​​الهندسي لشدة التألق بعد التطبيع للتحكم غير المعالج لتحديد درجة وضع العلامات على الخلايا بواسطة NanoRods.

إعداد مكتبة RNA-seq وتسلسلها

تم عزل إجمالي الحمض النووي الريبي (RNA) من الخلايا الشحمية المتمايزة باستخدام Quick-RNA Microprep Plus Kit (Zymo Research)، وتم استخدام 500 نانوغرام من الحمض النووي الريبي (RNA) المنقى لإعداد مكتبة mRNA-seq باستخدام TruSeq RNA Library Prep Kit v2 وفقًا لبروتوكول العينة المنخفضة الخاص بالشركة المصنعة. تم إجراء القياس الكمي للمكتبة باستخدام نظام QuantiFluor dsDNA (Promega) وفقًا لبروتوكول اللوحة متعددة الآبار الخاص بالشركة المصنعة على قارئ الألواح الدقيقة متعدد الأوضاع Varioskan LUX (Thermo Fisher). تم تقييم حجم المكتبة وجودتها باستخدام Bioanalyser 2100 ومجموعة الحمض النووي عالية الحساسية (Agilent). تم تغيير طبيعة المكتبات وتخفيفها باستخدام بروتوكول التطبيع القياسي NextSeq (Illumina)، وتم إجراء التسلسل باستخدام قراءات أحادية الطرف (1 × 75 نقطة أساس) مع NextSeq 500/550 High Output Kit v.2.5 (75 دورة) على منصة NextSeq 550 ( إلومينا).

القياس الكمي RNA-seq وتحليل DEG وGSEA

تم تعيين قراءات التسلسل مقابل نسخة مرجعية لـ المصحف العضلي تسلسلات نص ترميز البروتين (الإصدار M29، GRCm39؛ https://www.gencodegenes.org/mouse/) وقياسها باستخدام Salmon 1.7.0 (المرجع. ³³). تم إنشاء جداول العد باستخدام حزمة tximport³⁴ وتم الحصول على قوائم DEG باستخدام حزمة DESeq2 (الإصدار 1.34.0)³⁵، حيث الجينات المعدلة فقط P قيم تساوي أو تقل عن 0.001 وسجل₂تم أخذ قطع تغيير الطية عند ± 0.58 في الاعتبار لمزيد من التحليل. تم إنشاء الخرائط الحرارية ومخططات UpSet باستخدام ComplexHeatmap (الإصدار 2.10.0)³⁶. تم إجراء GSEA للعمليات البيولوجية باستخدام مصطلحات علم الجينات ومسارات KEGG باستخدام قائمة الجينات المصنفة كمدخلات إلى ملف التعريف العنقودي (الإصدار 4.2.2)³⁷ وأهمية معدل الاكتشاف الخاطئ المعدل P قيم أقل من 0.10 و0.05 على التوالي.

الحقن الدقيقة الزرد وتقدير كمية الجلوكوز الحرة

تم خلط NanoRod والأنسولين NanoRods مع oligolysine-PEG (K₁₀-PEG_5K، ألاماندا بوليمرات) بنسبة 1:1 بين أمينات الليسينات في K₁₀-PEG_5K والفوسفات في الحمض النووي³⁰، واحتضانها في RT لمدة 30 دقيقة قبل حقن مكروي من 2 nl من العينة في كل يرقة الزرد. تم تحضير عينات الحقن بتركيز نهائي قدره 100 نانومتر من الهياكل لعينات NanoRod المطلية وبتركيز نهائي قدره 100 نانومتر من الأنسولين لعينات الأنسولين NanoRod المطلية (الموافق 100.0 و 14.3 نانومتر من NanoRods لـ NR-1)^K-PEG و إن آر-7^K-PEG، على التوالى). لقد تبين أن حقن 1 نانولتر من الأنسولين البشري بتركيز 100 نانومتر في يرقات الزرد يؤدي إلى انخفاض في مستويات الجلوكوز الحرة والتغيرات النصية المتوافقة مع إشارات الأنسولين³⁸. لذلك، قمنا بحقن 2 لتر من تركيز الأنسولين 100 نانومتر في فحوصاتنا لتقييم تأثيرات الأنسولين على مستويات الجلوكوز الحرة. نظرًا لأن إجمالي حجم الدم لسمك الزرد 2 dpf هو 60-89 nl (المرجع XNUMX). ³⁹) ، سيكون التركيز المقدر للأنسولين المحقون في فحوصاتنا حوالي 2-3 نانومتر. في هذه الاختبارات، كنا أيضًا محدودين في كمية العينة المحقونة، مع مستويات حقن أعلى (3 و4 nl) مما أدى إلى ضعف بقاء اليرقات.

صيانة وعبور الزرد (د. ريريو) تم إجراء الخطوط وفقًا للتشريعات السويدية بشأن لوائح رعاية الحيوان التي وافقت عليها ستوكهولم djurförsöksetiska nämnd. نظرًا لأنه لم يتم استخدام سوى الحيوانات التي يقل عمرها عن 5 أيام في تجارب استئصال خلايا بيتا ومقايسة الجلوكوز المجانية، لم يكن هناك حاجة إلى تصريح أخلاقي وفقًا لـ 2010/63/EU. وقد سبق وصف الخطوط المعدلة وراثيا الزرد المستخدمة، وهي، Tg(انس:CFP-NTR)^s892 (المرجع. ²⁷) و Tg(انس:Kaede الذي)^s949 (المرجع. ²⁸).

تم إجراء استئصال خلايا β في عمر يومين Tg(انس:CFP-NTR) و Tg(انس:CFP-NTR);Tg(انس:Kaede الذي) الأجنة عن طريق العلاج بـ 10 ملي مولار MTZ (سيجما ألدريتش) مخفف في 1٪ DMSO (VWR) في محلول ماء البيض (E3) مضاف إليه 0.2 ملي مولار 1-فينيل-2-ثيوريا (PTU، Acros Organics) لمدة 24 ساعة. بعد استئصال خلايا بيتا، عمرها ثلاثة أيام Tg(انس:CFP-NTR) تم تخدير اليرقات (72 حصانًا) في تريكين 0.01٪ وحقنها بـ 2 لتر من 1 × PBS أو الأنسولين غير المعدل أو NanoRod / الأنسولين NanoRods المطلي في الوريد الأساسي المشترك (قناة كوفييه)⁴⁰. تمت إضافة الفينول الأحمر (Sigma-Aldrich) إلى تركيز نهائي قدره 0.1٪ إلى عينات PBS أو الأنسولين أو الأنسولين NanoRod المطلي للمساعدة في تصور عملية الحقن المجهري وتحديد اليرقات التي تم حقنها بنجاح. عشوائيا يرقات الزرد لمجموعات العلاج. تم قياس مستويات الجلوكوز الحرة كما هو موضح في مكان آخر⁴¹ باستخدام مجموعة إنزيمية تعتمد على التألق (BioVision). تم استخدام مجموعات من ثلاثة إلى ستة يرقات محقونة لكل حالة/تكرار.

التصوير متحد البؤر

Tg(انس:CFP-NTR);Tg(انس:Kaede الذي) - تم جمع اليرقات المتحللة على مدار 24 ساعة بعد علاج الاجتثاث، وتم تخديرها وحقنها وفقًا للبروتوكول المذكور مسبقًا وتم تثبيتها في محلول بارافورمالدهيد بنسبة 4٪ قبل تحليل أرقام خلايا β عن طريق التصوير متحد البؤر. تم الحصول على الصور البؤرية باستخدام مجهر Leica TCS SP8 وبرنامج LAS X (الإصدار 3.5.5.19976). الجزر البنكرياسية الأولية للخلية بيتا المتحللة Tg(انس:CFP-NTR);Tg(انس:Kaede الذي) تم فحص اليرقات باستخدام هدف غمر بالماء × 40 و z تم تحليل المداخن باستخدام برنامج فيجي (الإصدار 1.53). تم الحصول على جميع الصور المعروضة من نفس التجربة وتم تعديل قيم التباين الخاصة بها لأغراض التصور. تم إجراء القياس الكمي للخلايا على الصور الأصلية غير المعدلة.

تحليل احصائي

لم يتم استخدام أي طرق إحصائية لتحديد أحجام العينة مسبقًا، ولكن أحجام العينات كانت مماثلة لتلك المذكورة في المنشورات السابقة^28,38,42. تم توزيع عينات زراعة الخلايا والحيوانات بشكل عشوائي على مجموعات المراقبة والعلاج. لم يتم إجراء جمع البيانات وتحليلها بشكل أعمى لظروف التجارب. يتم رسم نقاط البيانات الفردية لمعظم الرسوم البيانية. حجم العينة (n) لعدد التكرارات البيولوجية التجريبية والطرق الإحصائية المستخدمة موضحة في أساطير الشكل المقابلة. تم اختبار مجموعات البيانات للتوزيع الغوسي متبوعًا بالاختبار الإحصائي المناسب. تمت معالجة التحليل الإحصائي والتمثيل الرسومي للبيانات باستخدام GraphPad Prism 9.4.0. تم إجراء اختبار مان ويتني ثنائي الذيل لمقارنة خصائص الكتلة بين الخلايا الضابطة والخلايا المعالجة بالأنسولين. بالنسبة لتقديرات اللطخة الغربية، تم إجراء تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) متبوعًا باختبار مقارنات دونيت المتعددة. لتقدير خلايا بيتا، تم إجراء اختبار كروسكال-واليس متبوعًا باختبار مقارنات دن المتعددة. تم إجراء تحليل قيم الجلوكوز الحرة باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار مقارنات توكي المتعددة.

ملخص التقارير

مزيد من المعلومات حول تصميم البحوث متاح في ملخص تقارير حافظة الطبيعة مرتبطة بهذه المادة.

• محتوى مدعوم من تحسين محركات البحث وتوزيع العلاقات العامة. تضخيم اليوم.
• PlatoData.Network Vertical Generative Ai. تمكين نفسك. الوصول هنا.
• أفلاطونايستريم. ذكاء Web3. تضخيم المعرفة. الوصول هنا.
• أفلاطون كربون، كلينتك ، الطاقة، بيئة، شمسي، إدارة المخلفات. الوصول هنا.
• أفلاطون هيلث. التكنولوجيا الحيوية وذكاء التجارب السريرية. الوصول هنا.
• المصدر https://www.nature.com/articles/s41565-023-01507-y