عزل القبو وزراعة أورجانويد

عزل القبو من RCCHan ™: تم إجراء إثني عشر أنثى الجرذ وثقافة أورجانويد وفقًا للتقرير السابق²¹. تم عزل الخبايا باستخدام كاشف تفكك الخلايا اللطيفة (تقنيات STEMCELL) لمدة 30 دقيقة على الجليد. تم ترشيح المحتويات المهضومة من خلال مصفاة 70 ميكرومتر وطردها عند 300 ×g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تم إعادة تعليق الكريات باستخدام Advanced DMEM / F-12 المثلج وطردها عند 150 ×g لمدة دقيقتين عند 2 درجات مئوية. تم تضمين جزء الخبايا مع 4٪ Matrigel (تم تقليل عامل النمو ، Corning ، Cat # 100) في الوسط القاعدي ، والذي يتكون من Advanced DMEM / F-356231 ، البنسلين / الستربتومايسين (Thermo Fisher Scientific) ، 12 ملم HEPES (Thermo Fisher Scientific) ) ، 10 ملي GlutaMAX-I (Thermo Fisher Scientific) مكمل بمكمل 2 × B-1 (Thermo Fisher Scientific) ، 27 مم N-اسيتيل-سيستين ، 10 نانومتر جاسترين (سيغما-الدريتش) ، 100 نانوغرام / مل فأر مؤتلف Noggin (Peprotech) ، 50 نانوغرام / مل فأر مؤتلف EGF (Thermo Fisher Scientific) ، 100 نانوغرام / مل IGF-1 مؤتلف بشري (BioLegend) ، 50 نانوغرام / مل أساسي بشري مؤتلف FGF (FGF-2) (ريبوسيل) ، 1 ميكروغرام / مل R-spondin البشري المؤتلف 1 (FUJIFILM Wako Pure Chemical) ، 500 نانومتر A83-01 و 10٪ Afamin / Wnt3a CM (JSR) . تم التقاط العضويات من النوع الناشئ وتمريرها عن طريق الاضطراب الميكانيكي. تم استكمال 10 ميكرومتر من Y-27632 لأول يومين من الثقافة حتى المقطع الأول ، وتمت إزالة EGF من المقطع الأول. تمت المحافظة على عضويات الفئران في وسط ΔE ، يتكون من وسط قاعدي مكمل بمكمل 2 × B-1 ، 27 ملي مولار N-اسيتيل-سيستين ، 10 نانومتر جاسترين ، 100 نانوغرام / مل Noggin ، 100 نانوغرام / مل IGF-1 ، 50 نانوغرام / مل مؤتلف مستقر للحرارة بشري bFGF (Thermo Fisher Scientific) ، 1 أو 0.5 ميكروغرام / مل R-spondin 1 ، 500 nM A83-01 و 10٪ أفامين / Wnt3a سم. بالنسبة للثقافة أحادية الطبقة ، تم فصل عضويات الفئران باستخدام إنزيم TrypLE Select (10 ×) لمدة 5 دقائق في حمام مائي 37 درجة مئوية وتم ترشيحها من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر. تم طرد المرشح عند 300 ×g لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية وتم التخلص من المادة الطافية ، وتم تعليق الخلايا المفردة بوسط E مكمل بـ 50 نانوغرام / مل من EGF و 10 ميكرومتر من Y-27632. 100 ميكرولتر من تعليق الخلية (7.0 × 10⁴ تمت إضافة خلايا / بئر) إلى إدراج ثقافة الخلية (Corning ، Cat # 353095) مغطى بـ Matrigel المخفف 30 ضعفًا مع PBS لمدة ساعتين على الأقل عند 2 درجة مئوية. تم استكمال Y-37 بمستزرع وسط في اليوم الأول فقط. تم الحصول على صور المجال الساطع باستخدام مجهر مقلوب (IX27632 ، أوليمبوس).

تطوير العضيات المخصبة بالكيس

تم فصل عضويات الفئران باستخدام إنزيم TrypLE Select (10 ×) لمدة 5 دقائق في حمام مائي 37 درجة مئوية وتم تصفيتها من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر. تم تعليق الخلايا المفردة بوسط غني بالكيس يتكون من وسط قاعدي مكمل بمكمل 1 × B-27 ، 1 ملي مولار N-اسيتيل-سيستين ، 10 نانوجرام غاسترين ، 100 نانوغرام / مل Noggin ، 50 نانوغرام / مل EGF ، 100 نانوغرام / مل IGF-1 ، 50 نانوغرام / مل مستقر حراريًا ، 0.5 ميكروغرام / مل R-spondin 1 ، 500 نانومتر A83- 01 ، 10 ميكرومتر Y-27632 و 20٪ أفامين / Wnt3a سم. 3.0 × 10⁴ تم دمج الخلايا بـ 50 ميكرولتر من Matrigel وتم تربيتها باستخدام وسط غني بالكيس. تم استبدال الوسيط كل يومين أو ثلاثة أيام ، وتم تمرير العضيات المخصبة بالكيس كل 2 أو 3 أيام عن طريق التفكك الميكانيكي.

ثقافة أحادية الطبقة

تم فصل العضيات التقليدية / العضيات المخصبة بالكيس إلى خلايا مفردة باستخدام إنزيم TrypLE Select (10 ×). بعد الترشيح بواسطة مصفاة خلية 70 ميكرومتر وطرد مركزي ، تم تعليق بيليه الخلية في وسط غني بالكيس وضبطه إلى 3.5 × 10⁵ خلايا / مل. تم زرع 200 ميكرولتر من التعليق الخلوي في Transwell (Corning ، Cat # 3378 أو 3470) مغطى بـ Matrigel المخفف 50 ضعفًا مع PBS بارد عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين ، وتمت إضافة الوسط إلى الحجرة القاعدية. في اليوم الثاني أو الثالث ، تم تغيير الوسيط إلى وسيط التمايز الذي يتكون من وسط قاعدي يحتوي على 2 × B-2 ملحق ، 3 ملي مولار N-اسيتيل سيستين ، 10 نانومتر جاسترين ، 100 نانوغرام / مل Noggin ، 0.5 ميكروغرام / مل R-spondin 1 ، 500 نانومتر A83-01 ، 10 ميكرومتر Y-27632 ، 3 ملي VPA (Abcam). تم استبدال الوسيط كل يومين أو ثلاثة أيام. لمقايسة الحث ، تم تعريض وسيط التمايز المحتوي على 2 ميكرومتر β-naphtoflavone (Sigma) ، أو 3 ميكرومتر 50-ميثيل كولانثرين (Sigma) ، أو 5 نانومتر 3α ، 100-ديهيدروكسي فيتامين D1 (سيغما) لمدة 25 ساعة. تم تحليل نشاط CYP3A ونشاط CYP48A بواسطة فحوصات P1-Glo وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة (luciferin-CEE لـ CYP3A و luciferin-IPA لـ CYP450A و Promega). تم تقييم سلامة الطبقة الأحادية بواسطة TEER. تم قياس قيمة TEER باستخدام نظام Millicell ERS-1 (Merck).

الفحص النسيجي

تم تحضير كتلة البارافين من عضيات الفئران بالطريقة الموصوفة سابقًا⁴⁷. باختصار ، تم إصلاح عضيات الفئران بنسبة 4 ٪ من الجلوتارالدهيد لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة. تم تعطيل قبة Matrigel عن طريق الماصات وتجميعها ، ثم تم دمجها في البارافين بطريقة AMeX⁴⁸. تم تحضير شرائح HE وتم إجراء AB-PAS.

جبل كامل مناعة للأشياء العضوية وطبقة أحادية

بعد سحب وسط الاستزراع ، تم إصلاح قبة Matrigel بنسبة 2 ٪ بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل برنامج تلفزيوني ، تمت إضافة برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.5٪ تريتون X-100 ونفاذه عند 4 درجات مئوية طوال الليل. تم إجراء الحظر باستخدام BlockAid Blocking Solution (Thermo Fisher Scientific) الذي يحتوي على 0.5 ٪ Triton X-100 لمدة 6 ساعات في درجة حرارة الغرفة. الأجسام المضادة الأولية [الأجسام المضادة لـ Ki-555 المسمى Alexa Fluor 67 (Clone B56 ، BD Biosciences) ، الأجسام المضادة لـ Sox9 (Clone D8G8H ، تقنية تشوير الخلية) ، الأجسام المضادة المضادة لـ CK20 (استنساخ SA35-03 ، Thermo Fisher Scientific) ، الجسم المضاد لـ P-gp (Clone F4 ، Thermo Fisher Scientific) ، الجسم المضاد لـ ZO-1 (Clone ZO1-1A12 ، Thermo Fisher Scientific) ، والأجسام المضادة المضادة للفوسفو إزرين (Clone 48G2 ، تقنية تشوير الخلية)] في الحجب تمت إضافة محلول يحتوي على 0.5٪ Triton X-100 واحتضانه لمدة 3 أيام عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، تم غسل العينة باستخدام PBS الذي يحتوي على 0.5٪ Triton X-100 ثلاث مرات ، وحضنت لمدة يوم أو يومين عند 1 درجات مئوية بجسم مضاد ثانوي [جسم مضاد IgG مضاد للأرنب يحمل علامة Alexa Fluor 2 (Thermo Fisher Scientific) ، Alexa الأجسام المضادة IgG المضادة للأرنب المسمى Fluor Plus 4 (Thermo Fisher Scientific) ، أو الجسم المضاد IgG488 المضاد للفأر المسمى Alexa Fluor 555 (Thermo Fisher Scientific)] في محلول منع يحتوي على 555٪ Triton X-1. بعد الغسل باستخدام PBS يحتوي على 0.5٪ Triton X-100 ثلاث مرات ، تم تحضين الآبار بعد ذلك بمحلول SeeDB0.5G 100 [2/1 × Omnipaque1 مع 3٪ سابونين] لمدة 350 ساعات عند درجة حرارة الغرفة ، محلول 2 (3/2 × Omnipaque1 مع 2 ٪ صابونين) يحتوي على Phalloidin-DyLight 350 و 2 ميكروغرام / مل DAPI طوال الليل عند 650 درجات مئوية ، محلول 1 (4 × Omnipaque3) لمدة 1 ساعات في درجة حرارة الغرفة لمسح العضيات⁴⁹، والتي لوحظت باستخدام مجهر مضان متحد البؤر (A1 ، نيكون).

بالنسبة للثقافة أحادية الطبقة ، بعد سحب وسط الاستزراع ، تم إصلاح الطبقة الأحادية بنسبة 4٪ PFA لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة. بعد غسل PBS ، تمت إضافة محلول منع يحتوي على 0.5٪ Triton X-100 واحتضانه لمدة ساعة عند درجة حرارة الغرفة. تم تلطيخ الطبقة الأحادية بالأجسام المضادة الأولية [الأجسام المضادة لـ P-gp ، والأجسام المضادة لـ ZO-1 ، والأجسام المضادة المضادة للفوسفو-إزرين ، والكادرين المضاد لـ E (Thermo Fisher Scientific ، PA1-5) ، والأجسام المضادة لـ Villin-32178 ( استنساخ R1 ، تقنية تشوير الخلية)] في محلول منع يحتوي على 814٪ Triton X-0.3 عند 100 درجات مئوية لمدة يومين ، ثم غسله ببرنامج تلفزيوني ثلاث مرات ، وحضنته طوال الليل عند 4 درجات مئوية بجسم مضاد ثانوي في محلول مانع يحتوي على 2٪ Triton X -4.

المجهر الإلكتروني الناقل للأشياء العضوية

تم إصلاح العضيات بنصف محلول Karnovsky عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة. تم تقطيع العضويات الثابتة مع Matrigel إلى قطع بحجم 1 مم تقريبًا³ بشفرة حلاقة وغسلها بمحلول كاكوديلاتي 0.1 م. تم إجراء مزيد من التثبيت باستخدام 1 ٪ رابع أكسيد الأوزميوم في محلول كاكوديلات 0.1 ميكرومتر عند 4 درجات مئوية لمدة 1.5 ساعة. تم تجفيف العضيات الثابتة مع زيادة تركيز الإيثانول تدريجيًا من 50 إلى 100٪ ، واستبدالها بأكسيد البروبيلين ، وإدخالها في راتنجات الإيبوكسي (Quetol812 ، Nisshin EM). تم بلمرة الراتنج بالحرارة ؛ تم تحضير أقسام فائقة الرقة (60-70 نانومتر) باستخدام جهاز فائق النحافة (Leica EM UC7 ، Leica Microsystems) ، مزدوج الملطخة بخلات اليورانيل وسيترات الرصاص ، وتم ملاحظتها باستخدام مجهر إلكتروني للإرسال (HT7700 ، Hitachi High-Technologies).

مقايسة تشكيل عضوي

تم فصل العضيات التقليدية والعضويات المخصبة بالكيس إلى خلايا مفردة بنفس طريقة الثقافة أحادية الطبقة. تم دمج هذه الخلايا مع Matrigel وتم تربيتها في وسط تمدد مكمل بـ 10 ميكرومتر Y-27632 لمدة 4 أيام. تم قياس النمو العضوي باستخدام CellTiter-Glo^® مقايسة جدوى الخلية ثلاثية الأبعاد (بروميغا) بعد إذابة مادة ماتريجيل مع ديباز (ديسباز I ، فوجي فيلم واكو بيور كيميكال). تم إجراء تحليل التصوير باستخدام CellSens (OLYMPUS) وفقًا للشركة المصنعة. تم تعريف تكوين العضويات على أنها عندما تم قياس المحور الرئيسي لبنيتها بأكثر من 3 ميكرومتر في صورة المجال الساطع.

مقايسة امتصاص EdU

تم إجراء تلطيخ EdU وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة (Click-iT Plus EdU Cell Prolicult Kit للتصوير ، صبغة Alexa Fluor 555 ، Thermo Fisher Scientific). تم حساب الخلايا الإيجابية لـ Nuclei و EdU باستخدام عناصر NIS (Nikon) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة.

RT-PCR الكمي

تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من ثقافة أحادية الطبقة باستخدام TRIzol. تم تصنيع (كدنا) مع نظام توليف Superscript III First-strand لـ RT-PCR (Thermo Fisher Scientific). تم إجراء RT-PCR الكمي في نسختين لكل جين على نظام StepOnePlus Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific) باستخدام SYBR Green (Thermo Fisher Scientific). β-أكتين تم استخدامه كجينات التدبير المنزلي. يتم عرض تسلسل الاشعال لـ RT-PCR في الجدول التكميلي S1.

فحص نفاذية المركب

لمقايسة النفاذية الصفراء لوسيفر ، تمت إضافة مخزن مؤقت للنقل يتكون من 10 ملي مولار HEPES و 1٪ (وزن / حجم) BSA في HBSS (الرقم الهيدروجيني 7.4) مع 200 ميكرومتر أصفر لوسيفر إلى الجانب القمي. تم شراء HBSS من Thermo Fisher Scientific (Cat # 14025092). تمت إضافة المخزن المؤقت الناقل بدون أصفر لوسيفر إلى الجانب القاعدي وتم تربيته عن طريق الاهتزاز. بعد ساعتين ، تم أخذ عينات من المخزن المؤقت الأساسي للتحليل. تم تحديد تركيز لوسيفر الأصفر بواسطة إشارة فلورية تم قياسها باستخدام EnSpire (PerkinElmer) باستخدام الإثارة 2 نانومتر و 428 نانومتر مرشحات الانبعاث. لمقايسة نفاذية الديجوكسين ، تمت إضافة مخزن مؤقت للناقل يحتوي على 536 ميكرومتر من لوسيفر الأصفر و 200 ميكرومتر من الديجوكسين في وجود أو عدم وجود 10 ميكرومتر من Zosuqudar إلى الجانب القمي أو القاعدي ، على التوالي. بعد ساعتين ، تم أخذ عينات من المخزن المؤقت القاعدي أو القمي للتحليل. بالنسبة للمقايسة الأيضية للميدازولام ، تمت إضافة HBSS الذي يحتوي على 5 ميكرومتر من الأصفر الفاتح ، و 2 ميكرومتر من الميدازولام ، و 200 ملي مولار ، و 5 ٪ (وزن / حجم) BSA (درجة الحموضة 10) في وجود أو عدم وجود 1 ملي مولار ABT إلى الجانب القمي من أحادي الطبقة المتمايزة. تمت إضافة المخزن المؤقت للنقل المكون من 6.5 ملي مولار HEPES و 1٪ (وزن / حجم) BSA في HBSS (الرقم الهيدروجيني 10) إلى الجانب الأساسي للطبقة الأحادية. بعد ساعتين ، تم أخذ عينات من المخزن المؤقت الأساسي للتحليل. تم استخدام الطبقة الأحادية التي تم تربيتها لمدة 4 أيام في وسط التمدد ولمدة 7.4 أيام في وسط متباين مع تحريض 2 نانومتر VD3 لمدة 4 ساعة لمقايسة الميدازولام. تم تحديد تركيز الديجوكسين و 100-هيدروكسي ميدازولام بواسطة تحليل LC-MS / MS. تم حساب معامل النفاذية الظاهرة (Papp) وفقًا للمعادلة التالية:

حيث يمثل dQ / dt المركب المنقول إلى الجانب القاعدي أو القمي لكل وحدة زمنية ، A هي مساحة سطح إدراج ثقافة الخلية ، و C₀ هو التركيز الأولي للمركب.

تحليل LC-MS / MS

تم خلط عينات المخزن المؤقت التي تم جمعها مع الميثانول / الأسيتونيتريل (1/1 ، ت / ت) التي تحتوي على معيار داخلي (d3- الديجوكسين لتحليل الديجوكسين ، d4-1 هيدروكسي ميدازولام 1-هيدروكسي ميدازولام). بعد الطرد المركزي أو الترشيح ، تم تحليل المادة الطافية باستخدام نظام Nexera X3 (Shimadzu) ، ونظام QTRAP6500 (SCIEX) ، وعمود ACQUITY UPLC BEH C18 (1.7 ميكرومتر ، 2.1 مم × 50 مم ، المياه) للديجوكسين ، أو XBridge BEH C18 عمود (3.5 ميكرومتر ، 2.1 مم × 100 مم ، مياه) لـ 1-هيدروكسيميدازولام.

تحليل احصائي

تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام GraphPad Prism 7.04 (برنامج GraphPad) عن طريق اختبار الطالب واختبار المقارنة المتعدد لدونت. اعتبرت قيمة p <0.05 ذات دلالة إحصائية.

• محتوى مدعوم من تحسين محركات البحث وتوزيع العلاقات العامة. تضخيم اليوم.
• PlatoData.Network Vertical Generative Ai. تمكين نفسك. الوصول هنا.
• أفلاطونايستريم. ذكاء Web3. تضخيم المعرفة. الوصول هنا.
• أفلاطون السيارات / المركبات الكهربائية ، كربون، كلينتك ، الطاقة، بيئة، شمسي، إدارة المخلفات. الوصول هنا.
• BlockOffsets. تحديث ملكية الأوفست البيئية. الوصول هنا.
• المصدر https://www.nature.com/articles/s41598-023-39425-7