تخليق وتوصيف الببتيدات وقليل النيوكليوتيدات وتقارن الببتيد- قليل النوكليوتيد

تم تصنيع جميع الببتيدات وأوليغنوكليوتيدات وتنقية HPLC بواسطة CPC Scientific and Integrated DNA Technologies (IDT) ، على التوالي. تم إنشاء اتحادات الببتيد - قليل النوكليوتيد بواسطة كيمياء النقر الخالية من النحاس. تمت تنقية الاتحادات على Agilent 1100 HPLC. تم إجراء التحليل الطيفي الكتلي للاتحادات على نموذج Bruker لامتصاص / التأين بالليزر بمساعدة مصفوفة MicroFlex - وقت قياس طيف الطيران. يتم سرد تسلسل جميع الجزيئات المستخدمة في الجداول التكميلية 1 و 3.

مقايسة انشقاق الفلورسنت Cas12a

إلباتم تحضين Cas12a (التركيز النهائي ، 100 نانومتر ؛ New England Biolabs (NEB)) باستخدام 1 × NEB Buffer 2.1 و crRNA (250 نانومتر ؛ IDT) ومنشطات الحمض النووي التكميلية (4 نانومتر ما لم يتم وصفها على وجه التحديد ، في محلول أو مسننة في البول ؛ IDT ) أو عينات البول التي تم جمعها من حيوانات التجارب ، في تفاعل 50 ميكرولتر عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تم تخفيف التفاعلات بعامل 4 إلى 1 × NEB Buffer 2.1 و ssDNA T₁₀ ركيزة مراسل FQ (30 pmol ؛ IDT) في حجم رد فعل 60 ميكرولتر لكل بئر وتشغيل في ثلاث نسخ. إلباتم اكتشاف تنشيط Cas12a عند 37 درجة مئوية كل دقيقتين لمدة 2 ساعات عن طريق قياس التألق باستخدام قارئ لوحة Tecan Infinite Pro M3 (λ_ex = 485 نانومتر ، λ_em = 535 نانومتر). يتم سرد تسلسل جميع قليل النوكليوتيدات في الجدول التكميلي 1. تم استخدام مضان لظروف الخلفية (إما عدم إدخال منشط DNA أو عدم وجود شروط كرنا) كعناصر تحكم سلبية. تم حساب نشاط Cas12a ssDNase من منحنى الحركية الناتج عن قارئ اللوحة (مضان المسبار الاصطناعي مقابل الوقت). سرعة التفاعل الأولية (V₀) مع منحدر الطور الخطي للمنحنى الحركي (8-10 نقاط زمنية أولية). تم إجراء التحليل في Python v.3.9.

مقايسة الانقسام Cas12a مع قراءات التدفق الجانبي

تم تحضين العينات لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية كما هو الحال في مقايسة التنشيط Cas12a الموصوفة أعلاه. ثم تم تخفيف التفاعلات بمعامل 4 إلى 1 × NEB Buffer 2.1 و ssDNA T₁₀ ركيزة مراسل FAM- البيوتين (1 pmol ؛ IDT) في حجم تفاعل 100 ميكرولتر وحضنت عند 37 درجة مئوية لمدة 1-3 ساعات. تم غمس شرائط HybriDetect 1 ذات التدفق الجانبي في المحلول (20 ميكرولتر من العينة مع 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت Milenia Hybridetect). تم قياس شدة النطاقات في ImageJ الإصدار 1.49.

توصيف تركيز أو طول منشط الحمض النووي لنشاط Cas12a ssDNase

لتحديد الطول الأمثل للكشف باستخدام Cas12a ، اختبرنا أطوال منشط DNA الأصلية المقطوعة والمعدلة من 10 إلى 34 nt. لتحديد المتانة في الجسم الحي ، تم حقن أطوال مختلفة من منشطات الحمض النووي المعدلة بالفوسفوروثيوات عند 1 نانومول في الفئران BALB / c ، وتم جمع عينات البول بعد ساعة واحدة من الحقن. تم استخدام عينات البول كمنشطات للحمض النووي في مقايسة الانقسام الفلوري Cas1a. تم تطبيع نشاط Cas12a ssDNase الذي يتم تشغيله بواسطة كل منشط للحمض النووي إلى نشاط منشط الحمض النووي المعدل 12 مير.

كشف السوائل وتحليل البيانات

تم إجراء تفاعلات الكشف عن Cas12 في مزيجين منفصلين ، مزيج الفحص ومزيج العينة ، للتحميل على التعبير الجيني موائع جزيئية (GE) 96.96 دائرة فلويديك متكاملة (IFC) (Fluidigm): يحتوي مزيج الفحص على 10 ميكرومتر إلباCas12a (NEB) ، 1 × كاشف تحميل الفحص (Fluidigm) ، 1 × NEB Buffer 2.1 و 1 ميكرومتر كرنا لحجم إجمالي 16 ميكرولتر لكل تفاعل. احتوى مزيج العينة على 25.2 U RNase inhibitor (NEB) ، 1 × NEBuffer 2.1 ، 1 × ROX Reference Dye (Invitrogen) ، 1 × GE كاشف تحميل العينة (Fluidigm) ، 9 ملي MgCl₂ و 500 نانومتر مراسل الحمض النووي الفلوري الاصطناعي المروى (FAM-T₁₀–3IABkFQ ، IDT) بحجم إجمالي يبلغ 12.6 ميكرولتر. تم بعد ذلك تحميل حقنة و 4 ميكرولتر من الفحص أو مخاليط العينات في مواقعها الخاصة على موائع جزيئية GE 96.96 IFC وتم تشغيلها وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم تحميل IFC على Juno (Fluidigm) حيث تم تشغيل البرنامج النصي "Load Mix". بعد تحميل IFC المناسب ، تم جمع الصور على مدى 3 ساعات باستخدام بروتوكول مخصص على Biomark HD.

لتحليل البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة نظام Fluidigm ، قمنا برسم تألق مرجعي مطروح في الخلفية للخلفية لأزواج الدليل والهدف. بالنسبة للزوج الإرشادي والهدف (في نقطة زمنية معينة ، t، والتركيز المستهدف) ، قمنا أولاً بحساب القيمة المرجعية المعيارية كـ (الوسيط (P_t - P₀(/)R_t - R₀)) أين P_t هي إشارة الدليل (FAM) في النقطة الزمنية ، P₀ هو قياس الخلفية قبل رد الفعل ، R_t هي الإشارة المرجعية (ROX) عند النقطة الزمنية ، R₀ هو قياس الخلفية الخاصة به ، ويتم أخذ الوسيط عبر التكرارات. تم تصور البيانات باستخدام Python 3 و R 4 و Prism 9.

الاستنساخ والتعبير عن الأجسام النانوية المؤتلفة

تم طلب شظايا جين gBlocks المزدوجة التي تقطعت بها السبل والتي تشفر الجسم النانوي ذي الأهمية مع مواقع تقييد NcoI و BlpI المرافقة من IDT. تم استنساخ شظايا الجين في متجه تعبير Novogen pET-28a (+) في مواقع تقييد NcoI و BlpI وتحويلها إلى SHuffle T7 المختصة الإشريكية القولونية (NEB). تم تأكيد المستعمرات البكتيرية المشفرة لإدخالات الجينات الصحيحة بتسلسل سانجر. لإنتاج البروتين المؤتلف اللاحق ، 500 مل ثقافة ثانوية من شفل T7 المختصة E. كولاي. تمت تنمية ترميز جين الجسم النانوي ذي الأهمية في مرق LB المضاف إليه الكاناميسين عند 37 درجة مئوية من ثقافة أولية طوال الليل 3 مل حتى وصلت الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر (OD 600) إلى حوالي 0.6 - 0.8. ثم تم إحداث تعبير الجسم النانوي بإضافة الأيزوبروبيل β-d-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيد (IPTG) (تركيز نهائي 0.4 ملي مولار). حضنت الثقافة عند 27 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. تم تحلل الحبيبات البكتيرية بكاشف استخلاص البروتين الكامل للبكتيريا B-PER (Thermo Fisher Scientific) ، ثم تمت تنقيتها عبر كروماتوغرافيا تقارب المعادن المعيارية الثابتة (IMAC) باستخدام Ni-NTA agarose (Qiagen). تم تأكيد منتج الجسم النانوي عن طريق تحليل الرحلان الكهربائي للهلام SDS – polyacrylamide. يتم سرد تسلسل الأجسام النانوية المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول التكميلي 3.

توليف العلامات الحيوية للبول الاصطناعية المشفرة بالحمض النووي مع نواة الجسم النانوي

تم تحضين الجسم النانوي (2 مجم) في درجة حرارة الغرفة طوال الليل في جل بيرس المثبط لثنائي كبريتيد TCEP (7.5٪ حجم / حجم) (Thermo Fisher Scientific) لتقليل السيستين الطرفي C بشكل انتقائي باتباع بروتوكول تم إنشاؤه مسبقًا³⁷. تم تفاعل السيستين C-terminal المخفض (مكافئ واحد) مع sulfo DBCO-malimide crosslinker (1 ما يعادل) (انقر فوق أدوات الكيمياء) في PBS (الرقم الهيدروجيني 4 ، 6.5 ملي مولار EDTA) عند درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعات وبعد ذلك يكون الرابط المتشابك الزائد. تمت إزالته باستخدام عمود تحلية PD-6 يمكن التخلص منه (GE Healthcare Bio-Sciences). تم تحسين الجسم النانوي الوظيفي DBCO بشكل إضافي بواسطة كروماتوجرافيا سائل بروتين سريع البروتين ÄKTA (GE Healthcare). تم إجراء اقتران مراسل الحمض النووي عن طريق احتضان الجسم النانوي الوظيفي DBCO (10 equiv.) مع مراسل DNA الذي يعمل بالأزيد (1 equiv.) في PBS (الرقم الهيدروجيني 1.1) في درجة حرارة الغرفة لمدة 7.4 ساعة. تمت إزالة مراسل الحمض النووي الزائد عن طريق كروماتوغرافيا استبعاد الحجم. تم تأكيد المنتج عن طريق تحليل الرحلان الكهربائي للهلام SDS – polyacrylamide وقياس كميته باستخدام مجموعة مقايسة Quant-iT OliGreen ssDNA. يتم سرد تسلسل المؤشرات الحيوية للبول الاصطناعية المشفرة بالحمض النووي المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول التكميلي 4.

توليف المؤشرات الحيوية للبول الاصطناعية المشفرة بالحمض النووي مع نوى بوليمرية

تم إذابة PEG متعدد التكافؤ (40 كيلو دالتون ، ثمانية أذرع) تحتوي على مقابض تفاعلية مالييميد (تقنية JenKem) في محلول فوسفات 100 ملي مولار (درجة الحموضة 7.0) وتم ترشيحه (حجم المسام ، 0.2 ميكرومتر). بعد الترشيح ، تمت إضافة اتحادات الببتيد - الحمض النووي المنتهية بالسيستين عند ضعف الضرس الزائد إلى PEG وتفاعلت لمدة 2 ساعات على الأقل في درجة حرارة الغرفة. تم فصل الجزيئات غير المقترنة باستخدام كروماتوجرافيا استبعاد الحجم مع عمود Superdex 4 زيادة 200/10 GL على كروماتوجراف سائل بروتين سريع ÄKTA (GE Healthcare). تم تركيز مستشعرات النانو المنقاة بواسطة مرشحات الدوران (قطع الوزن الجزيئي ، 300 كيلو دالتون ؛ ميليبور) ، وتم قياسها باستخدام مجموعة مقايسة Quant-iT OliGreen ssDNA (Thermo Fisher Scientific). تمت قراءة الإسفار على قارئ لوحة Tecan Infinite Pro M10 Quant-iT في λ_ex = 485 نانومتر ، λ_em = 535 نانومتر. تم تخزين الجسيمات عند 4 درجات مئوية في برنامج تلفزيوني. تم استخدام تشتت الضوء الديناميكي (Zeta Sizer Nanoseries ، Malvern Instruments) لتوصيف القطر الهيدروديناميكي للجسيمات النانوية. يتم سرد تسلسل المؤشرات الحيوية للبول الاصطناعية المشفرة بالحمض النووي في الجدول التكميلي 4.

المجهر الإلكتروني للإرسال المبرد

تم تجميع SUBs المكونة من 5-plex البوليمرية الأساسية القائمة على الحمض النووي وتركيزها إلى 0.5 مجم مل^-1 عن طريق تركيز الحمض النووي. تم تحميل العينات على شبكة نحاسية لاسي مطلية بفيلم كربون مستمر. تم بعد ذلك تركيب الشبكة على حامل تجميد أحادي الميل Gatan 626 والذي تم وضعه في عمود المجهر الإلكتروني للإرسال. تم تبريد العينات بواسطة النيتروجين السائل وحافظت على البرودة أثناء النقل إلى المجهر (مجهر JEOL 2100 FEG مضبوط على 200 كيلو فولت ؛ التكبير ، 10,000-60,000). تم تسجيل جميع الصور باستخدام كاميرا جهاز Gatan 2kx2k UltraScan مقترنة بالشحن.

التحليل النسبي والبروتيني

تم إنشاء بيانات RNA-Seq لسرطان غدي القولون البشري بواسطة شبكة أبحاث أطلس جينوم السرطان (http://cancergenome.nih.gov). تم إجراء تحليلات التعبير التفاضلي باستخدام DESeq2 1.10.1. تم الحصول على البيانات البروتينية حول تكوين المصفوفة خارج الخلية في سرطانات القولون البشري وأنسجة القولون الطبيعية عن طريق تحليل قياس الطيف الكتلي لمكونات المصفوفة خارج الخلية وهي متاحة من Matrisome (http://matrisomeproject.mit.edu/).

زراعة الخلايا

تمت زراعة خط خلايا الفأر MC26-LucF (الذي يحمل لوسيفيراز اليراع ، من مختبر كينيث ك. تانابي ، مستشفى ماساتشوستس العام) في وسط DMEM (Gibco) مُكمل بـ 10٪ (حجم / حجم) مصل بقري جنيني (Gibco) ، 1٪ ( v / v) البنسلين / الستربتومايسين (CellGro) عند 37 درجة مئوية وفي 5٪ من ثاني أكسيد الكربون₂. نمت خطوط الخلايا البشرية PC-3 (ATCC CRL-1435) في RPMI1640 (Gibco) مع 10٪ (حجم / حجم) مصل بقري جنيني و 1٪ (حجم / حجم) بنسلين / ستربتومايسين. تم زراعة خلايا RWPE1 (ATCC CRL-11609) في وسط خالٍ من المصل الكيراتيني (Gibco) مع 2.5 ميكروغرام من عامل نمو البشرة المؤتلف البشري و 25 مجم من مستخلص الغدة النخامية البقري. تم اختبار جميع خطوط الخلايا سلبية للتلوث بالميكوبلازما.

نماذج حيوانية

تمت الموافقة على جميع الدراسات التي أجريت على الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوان التابعة لمعهد ماساتشوستس للتكنولوجيا (MIT) (بروتوكولات MIT 0420-023-23 و 0220-010-23). أجريت جميع التجارب وفقًا للإرشادات المؤسسية والوطنية وأشرف عليها قسم الطب المقارن (DCM) لموظفي معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا.

أنثى BALB / c (BALB / cAnNTac ، من 6 إلى 8 أسابيع من العمر ؛ Taconic Biosciences) ، أنثى عارية NCr (CrTac: NCr-Foxn1^nu، من 4 إلى 5 أسابيع ، Taconic Biosciences) ، وأنثى وذكور KRAS^{LSL − G12D / +};التربتوفان53^{فلوريدا / فلوريدا} تم استخدام الفئران C57L / B6 (KP) (من 8 إلى 16 أسبوعًا من العمر ؛ هدية من مختبر Tyler Jacks ، MIT) لإجراء التجارب. تم الحفاظ على الفئران في منشأة الحيوان بمعهد كوخ للسرطان ، بدورة مظلمة 12 ساعة / 12 ساعة (07: 00-19: 00) ، عند حوالي 18-23 درجة مئوية و ~ 50٪ رطوبة. يمكن الوصول إلى الماء المعقم ونظام غذائي تشاو القياسي في جميع الأوقات. تم إيواء الفئران العارية NCr في غرف تعاني من نقص المناعة فقط ، في أقفاص معقمة وأغطية ورقية وتم التعامل معها بتقنيات معقمة. تم فحص الحالة الصحية للفئران أسبوعيًا ويوميًا عندما كان قطر الأورام أكبر من 5 مم. تم قتل الفئران وفقًا لمعايير الأطباء البيطريين (على سبيل المثال ، حجم الورم> 1 سم ، سوء حالة الجسم). استخدمنا حجم عينة لا يقل عن ثلاثة فئران لكل مجموعة. حجم المجموعة أكبر من أو يساوي خمسة عند مقارنة مستويات الباركود البولي (على الوجهين t-test ، مجموعة α عند 0.05). تم توزيع القمامة من نفس الجنس بشكل عشوائي على المجموعات التجريبية والضابطة.

لتأسيس أورام الرئة CRC ، تم تلقيح إناث الفئران BALB / c عن طريق الحقن في الوريد بخط خلايا MC26-Fluc الذي يعبر عن لوسيفيراز (100,000 خلية لكل فأر). تمت مراقبة تطور الورم أسبوعيًا باستخدام نظام التصوير IVIS (PerkinElmer) وقياسه على الصورة الحية (PerkinElmer). لإنشاء نموذج PCa xenograft ، تم تلقيح الفئران الإناث العارية NCr بخطوط خلايا PC-3 البشرية (5 ملايين خلية لكل جناح ، جناحان لكل فأر) أثناء تخدير الأيزوفلورين. تم تحضير الخلايا في 2٪ من مصفوفة غشاء Corning Matrigel (Thermo Fisher Scientific) ووسائط منخفضة المصل (Opti-MEM ، Gibco). تم قياس الأورام أسبوعيا وأجريت التجارب بمجرد وصول أورام الخاصرة إلى ما يقرب من 30 ملم في الطول أو العرض (حوالي 5 ملم)³) أو 3 أسابيع بعد التلقيح. تم حساب حجم الورم من خلال قياس الفرجار لطول وعرض الجناح. يتبع حساب الحجم المعادلة f_x = (العرض² × الطول) / 2 ، حيث يكون الطول هو الجزء الأطول.

للحث على أورام الرئة الذاتية ، أنشأنا أولاً KRAS^{LSL − G12D / +};التربتوفان53^{فلوريدا / فلوريدا} الفئران C57L / B6 (KP)^42,43 حيث يتم تنشيط أليل الورم KRAS يكفي لبدء عملية تكوين الأورام ، وحذف إضافي أو طفرة نقطية TRP53 يعزز بشكل كبير تطور الورم ، مما يؤدي إلى تطور أسرع في الأورام الغدية التي لها سمات مرض أكثر تقدمًا. بدأت أورام الرئة عن طريق إعطاء 50 ميكرولتر من الفيروس الغدي-SPC-Cre داخل الرغامى (2.5 × 10⁸ وحدات تشكيل البلاك في Opti-MEM مع 10 ملي كلوريد الكالسيوم في إناث أو ذكور فئران KP تتراوح أعمارهم بين 8 و 16 أسبوعًا) تحت تخدير الأيزوفلورين. تألفت مجموعات التحكم من الفئران المتطابقة مع العمر والجنس والتي خضعت أيضًا للإعطاء داخل الرغامى من AdenoCre. تم الحفاظ على الفئران KP دون تدخل إضافي للسماح بنمو الورم حتى إجراء التجارب.

تحليل مقايسة انشقاق Cas12a المنشط بالباركود DNA البولي

تم حقن ssDNAs (1 نانومول) ، مستشعرات PEG المشفرة بالحمض النووي المكونة من 5 صفائح (0.2 نانومول لكل منهما ، 1 نانومول بتركيز الباركود DNA في المجموع) أو مجسات الجسم النانوي المشفرة بالحمض النووي (1 نانومول بواسطة تركيز الباركود DNA) عن طريق الوريد في الفئران التجريبية. تم جمع عينات البول (100-200 ميكرولتر لكل فأر) في الساعة 12:00 كل يوم ، بعد ساعة واحدة من حقن الحمض النووي أو المستشعر ، وتم فحصها لتفعيل Cas1a لتحديد سرعة التفاعل الأولية (V₀). تم إجراء التطبيع على V₀ القيم لحساب الاختلاف من حيوان إلى حيوان في تركيز البول. في مقايسة الانقسام Cas12a التي تستخدم مراسل الفلورسنت ، فإن y يمثل المحور يعني التطبيع V_{0_ الحيوانات الحاملة للورم}/ يعني تطبيع V_{0_control الحيوانات}. ثم تم استخدام نفس عينة البول لإجراء مقايسة الانقسام Cas12a مع قراءة LFA. تم محاذاة شرائط الورق الناتجة ومسحها ضوئيًا في وقت واحد. تم قياس شدة النطاق باستخدام ImageJ v.1.49v.

دراسات التوزيع الحيوي والدوائية

تم استخدام العوامل التي تحمل علامات صبغ الأشعة تحت الحمراء القريبة لتقليل التداخل من الخلفية الفلورية الذاتية في الجسم الحي. تم حقن الفئران BALB / c عن طريق الوريد بجزيئات DNA الأصلية المعدلة أو المسمى Cy5 (1 نانومول) وتم جمع عينات البول في 30 دقيقة و 1 ، 2 ، 3 ، 4 ساعات بعد الحقن. تقارن الأجسام النانوية مع الحمض النووي مع إستر السلفو-سيانين 7 NHS (Lumiprobe ، 2 صبغة مكافئة. من البروتين) ، يتفاعل طوال الليل ، ينقى بالترشيح الدوراني ويحقن عن طريق الوريد في الفئران العارية الحاملة للورم PC-3. بعد 24 ساعة ، تم التخلص من الفئران وتم إجراء التشريح لإزالة الأورام والرئتين والقلب والكلى والكبد والطحال. تم فحص البول والدم والأعضاء باستخدام أنظمة التصوير IVIS و Odyssey CLx (LI-COR). تم تحديد كمية مضان الأعضاء بواسطة ImageStudio في Odyssey CLx. تمت مراقبة حركية الدورة الدموية في الفئران BALB / c عن طريق سحب الدم التسلسلي في 10 دقائق و 30 دقيقة وساعتين و 2 ساعات بعد الحقن الوريدي للحمض النووي المسمى Cy3 أو PEG عند صبغة 5 نانومول لكل فأر. تم جمع الدم لقياسات الحرائك الدوائية باستخدام نزيف الذيل. تم تخفيف الدم في PBS مع 1 ملي EDTA لمنع التجلط ، وطرده لمدة 5 دقائق عند 5g، وتم قياس تركيز مراسل الفلورسنت في 384 لوحة جيدة بالنسبة للمعايير في Odyssey CLx.

علم الأنسجة والكيمياء النسجية المناعية ودراسات التألق المناعي

تم حفظ الأنسجة المضمنة بالبارافين في بارافورمالدهيد 4٪ طوال الليل وتم تخزينها في 70٪ من الإيثانول قبل التضمين في البارافين. تم حفظ الأنسجة المجمدة المفاجئة في 2 ٪ بارافورمالدهيد لمدة ساعتين ، وتم تخزينها في 2 ٪ سكروز طوال الليل وتم تجميدها في مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) عند -30 درجة مئوية. تمت معالجة الرئتين المفاجئة المجمدة من خلال الحقن داخل الرغامى بنسبة 80:50 أكتوبر في برنامج تلفزيوني مباشرة بعد أن تم التخلص من الحيوان بجرعة زائدة من الأيزوفلورين. تم تجميد الرئتين ببطء مع تضمين OCT في حمام النيتروجين السائل / الأيزوبنتان. تم تقسيم العينات إلى شرائح 50 ميكرومتر. بالنسبة لدراسات الكيمياء الهيستولوجية المناعية ، كانت الشرائح ملطخة بالأجسام المضادة الأولية وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة ، متبوعة بـ Rabbit-on-Rodent HRP-Polymer المستخدم كما تم استلامه (Biocare Medical). بالنسبة لدراسات التألق المناعي ، بعد حجب 6٪ من مصل الماعز و 5٪ BSA و 2٪ Triton X-0.1 في برنامج تلفزيوني لمدة ساعة واحدة ، تم تلوين المقاطع بجسم مضاد أولي في 100٪ BSA في PBS طوال الليل عند 1 درجات مئوية. تم تحضين الأجسام المضادة الثانوية المقترنة من Alexa Fluor عند 1 ميكروغرام مل^-1 في 1٪ جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تم إغلاق الشرائح باستخدام ProLong Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific) ، وتم رقمنتها وتحليلها باستخدام ماسح ضوئي عالي السعة ثلاثي الأبعاد Histech P3 (PerkinElmer). تم تقييم السمية النسيجية من قبل أخصائي علم الأمراض البيطري الذي أعمى عن مجموعات العلاج. يتم سرد الأجسام المضادة الأولية والتخفيفات المستخدمة في الجدول التكميلي 5.

استخراج الحمض النووي الريبي وتفاعل البوليميراز الكمي في الوقت الحقيقي

تمت زراعة خلايا PC-3 و RWPE1 وجمعها بعد التربسين. تم جمع عينات الأنسجة عن طريق التشريح بعد الموت الرحيم للفئران وتم الاحتفاظ بها على الفور في RNAlater RNA Stabilization Reagent (Qiagen). تم استخراج الحمض النووي الريبي من كريات الخلايا أو عينات الأنسجة المبردة باستخدام RNeasy Mini Kit (Qiagen). تم نسخ RNA عكسيًا إلى cDNA باستخدام Bio-Rad iScript Reverse Transcription Supermix على Bio-Rad iCycler. تم قياس تضخيم تفاعل البوليميراز الكمي المتسلسل لـ cDNA بعد الخلط مع مجسات التعبير الجيني Taqman والأنظمة الحيوية التطبيقية TaqMan Fast Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم إجراء تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي على Cycler الحرارية Bio-Rad CFX96 Real Time System C1000.

ركيزة البروتياز المؤتلف ومقايسات انشقاق محللة الأنسجة

تم تصنيع ركائز الأنزيم البروتيني الفلوروجينيك مع مضان (FAM) و Quencher (CPQ2) بواسطة CPC Scientific. تم شراء البروتياز المؤتلف من Enzo Life Sciences و R&D Systems. تم تجانس عينات الأنسجة في برنامج تلفزيوني وطردها عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق عند 6,000g. تم طرد الطرد المركزي أيضًا عند 14,000g لمدة 25 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تم قياس تركيز البروتين باستخدام Thermo Fisher BCA Protein Assay Kit وتم تحضيره عند 2 مجم مل^-1. تم إجراء فحوصات في 384 طبقًا جيدًا في ثلاث نسخ في مخزن مؤقت خاص بالإنزيم مع الببتيدات (1 ميكرومتر) والبروتياز (40 نانومتر لفحص الأنزيم البروتيني المؤتلف) / محللات الخلية (0.33 مجم مل)^-1 لفحص محللة الأنسجة) في 30 ميكرولتر عند 37 درجة مئوية. تم قياس الإسفار في λ_ex = 485 نانومتر ، λ_em = 535 نانومتر على قارئ صفيحة ميكروسكوبية Tecan Infinite 200pro. يتم سرد الإنزيمات وشروط المخزن المؤقت في الجدول التكميلي 6.

مقايسة الممتز المناعي المرتبط بإنزيم PSA

تم جمع ما يقرب من 200 ميكرولتر من الدم من الوريد الصافن الجانبي لحيوانات التجارب وتم تكوير خلايا الدم على الفور بالطرد المركزي عند 14,000.g لمدة 25 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تم تخزين البلازما عند -80 درجة مئوية قبل تقدير PSA الكمي. تم قياس مستويات PSA باستخدام مجموعة PSA Quantikine ELISA وفقًا لبروتوكولات الشركة المصنعة (أنظمة البحث والتطوير).

التحليل الإحصائي والتكاثر

أجريت التحليلات الإحصائية في GraphPad Prism 9. تم عرض البيانات كوسيلة مع sem تم تقييم الفروق بين المجموعات باستخدام مقارنات مجموعة حدودي وغير حدودي عندما يكون ذلك مناسبًا مع التعديل للاختبار متعدد الفرضيات. على وجه التحديد ، تم اختبار مجموعات البيانات لأول مرة للتأكد من كونها طبيعية عن طريق اختبار الوضع الطبيعي كولموغوروف - سميرنوف مع اختبار دالال - ويلكينسون - ليلي من أجل P قيمة. ثم تم اختبار النتائج من أجل دلالة إحصائية بواسطة ثنائي الذيل غير مزدوج t-اختبار (حدودي) لمقارنات بين مجموعتين وتحليل التباين لمقارنات متعددة المجموعات. أجريت التحليلات غير البارامترية عن طريق اختبار Mann-Whitney ثنائي الذيل غير المزدوج. يتم تحديد أحجام العينات والاختبارات الإحصائية في وسيلة إيضاح الشكل. تم تكرار جميع التجارب بشكل مستقل مرتين على الأقل مع نتائج مماثلة. لاحظ أن التجارب تم تكرارها وتصورها من قبل باحثين مستقلين عند عرض نتائج التجارب التمثيلية (مثل الصور المجهرية النسيجية أو الفلورية).

ملخص التقارير

مزيد من المعلومات حول تصميم البحوث متاح في ملخص تقارير حافظة الطبيعة مرتبطة بهذه المادة.

• محتوى مدعوم من تحسين محركات البحث وتوزيع العلاقات العامة. تضخيم اليوم.
• بلاتوبلوكشين. Web3 Metaverse Intelligence. تضخيم المعرفة. الوصول هنا.
• سك المستقبل مع أدرين أشلي. الوصول هنا.
• المصدر https://www.nature.com/articles/s41565-023-01372-9