دمج النسخ العكسي في caPCR

قدمنا ​​أولاً خطوة RT لفحص الكابكر القياسي. يتم إجراء عملية caPCR باستخدام مجموعة مكونة من 4 سخانات يتم تثبيتها على أي من وجهي الخرطوشة التي تحتوي على غرفة حلقية مملوءة بخليط تفاعل PCR⁴. من خلال وضع سخانات على جانب واحد من الغرفة لدرجة حرارة الصلب PCR والآخر لدرجة حرارة تمسخ، يتم إنشاء التدرج، وبالتالي إنتاج تدفق الحمل الحراري السلبي الذي يدفع تضخيم PCR. يتم تثبيت مجموعة مسبار موطئ القدم المروية مسبقًا على سطح الخرطوشة وتستجيب من خلال TMSD حيث يتم تصنيع منتجات PCR محددة. لاستيعاب خطوة النسخ العكسي الأولية، قمنا ببرمجة السخانات للحفاظ على درجة حرارة ثابتة قدرها 42 درجة مئوية لتخليق [كدنا] لمدة 10 دقائق، وبعد ذلك تتكيف السخانات إلى 57 درجة مئوية و95 درجة مئوية على التوالي لبدء تدفق الحمل الحراري (الشكل XNUMX أ). 2a). يتم استخدام نهج RT-PCR أحادي الوعاء لتقليل عدد خطوات المعالجة اليدوية في سير العمل. يعمل الكشف بوساطة مسبار موطئ القدم على منصة caPCR على النحو الأمثل في ظل ظروف PCR غير المتماثلة: فائض التمهيدي الذي ينتج الشريط الذي يزيح المخمد يولد إشارة أقوى على صفيف مسبار الفلورسنت من نسبة التمهيدي للأمام إلى الخلف 1:1 (تين. S1). لقد تأكدنا من أن هذا التمهيدي نفسه يتوسط أيضًا في تخليق [كدنا] من أهداف الحمض النووي الريبي (RNA) لتجنب الحاجة إلى تقديم بادئات منفصلة للنسخ العكسي ومراحل PCR.

a يمكن تمديد سير عمل caPCR ليشمل خطوة النسخ العكسي (RT-caPCR) من خلال إضافة إنزيم المنتسخة العكسية، ومرحلة RT مخصصة مع ضبط جميع سخانات الأجهزة على درجة حرارة RT (42 درجة مئوية). يتم بعد ذلك زيادة درجات حرارة السخان إلى درجات حرارة مختلفة للتسخين (95 درجة مئوية) والتليين (57 درجة مئوية)، مما يؤدي إلى تدفق الحمل الحراري وتضخيم PCR لقوالب cDNA. b يمكن استخدام مخطط التصميم النشط للمسابير، استنادًا إلى الديناميكا الحرارية المرتبطة بالحمض النووي، لتلبية حاجتين في تشخيص الأمراض المعدية: XNUMX) يجب أن يكون اكتشاف مسببات الأمراض الفيروسية قويًا تجاه التغييرات الصغيرة في تسلسل النيوكليوتيدات لمنع التسرب في حالة ظهور متغيرات جديدة. II) يتطلب التمييز المتغير تحليل النوكليوتيدات المفردة. يمكن استخدام تنوع طاقات موطئ القدم والمجال والمنطقة غير المتجانسة (NHR) لتلبية كلا هذين المتطلبات. c مثال لإخراج البيانات من تشغيل دونات RT-caPCR. يتم الحصول على صور مجموعة المسبار كل 30 ثانية لمدة 30 دقيقة من الكابكر. يتم استخراج آثار التألق وتحليلها لتحديد مسببات الأمراض التنفسية الموجودة، وإذا أمكن، ما هو متغير فيروس SARS-CoV-2 الموجود.

صورة بالحجم الكامل

لتطوير تحقيقات قابلة للضبط مع انتقائية تسلسلية قابلة للبرمجة، تتراوح من حساسة للطفرة إلى متسامحة مع الطفرة، استخدمنا مجموعتين من المعايير النشطة لتحقيقات موطئ القدم (الشكل 2 أ). 2b). تتميز المجسات القوية بمنطقة موطئ قدم أقوى ومجال أضعف مماثل لتقليل التأثير الكلي لطفرة واحدة على بدء تفاعل الارتباط وإزاحة ذراع التبريد اللاحقة. بالنسبة لتمييز SNV، يتم تقليل طول موطئ القدم، ويتم إدخال منطقة غير متجانسة (NHR) تفتقر إلى التكامل مع الهدف. يعمل هذا المزيج على تقليل الأفضلية النشطة الشاملة لربط موطئ القدم وإزاحة الذراع المخمد، وبالتالي توفير وزن إضافي لعدم التطابق الفردي في التسلسل المستهدف.

طبقنا RT-caPCR مع تحقيقات قوية وتمييز SNV للكشف عن فيروسات الجهاز التنفسي. تتم معالجة صور مجموعة المسبار من نظام RT-caPCR باستخدام برنامج MATLAB مخصص لإنتاج آثار مضان يتم تفسيرها بعد ذلك لتحديد كل من الهدف (الأهداف) الفيروسية الموجودة، ومتغير SARS-CoV-2، إن أمكن. يظهر مثال لمتغير SARS-CoV-2 Omicron في الشكل XNUMX. 2c. وبالتالي، يوضح اختبار RT-caPCR ذو الوعاء الواحد قدرته على إجراء كل من الكشف الحساس باستخدام تحقيقات قوية في وقت واحد بالإضافة إلى دقة النوكليوتيدات الفردية باستخدام تحقيقات تمييزية SNV لتحديد أهداف الحمض النووي الريبي محل الاهتمام بدقة في تفاعل واحد.

صقل علم الطاقة بين تحقيقات قوية وتمييز SNV

لزيادة تنوع الأهداف المكتشفة في اختبار RT-caPCR الخاص بنا، قمنا بتحسين علم الطاقة الخاص بربط موطئ القدم وإزاحة الخيوط لتعديل مقايضة خصوصية الحساسية. وكدراسة حالة، استخدمنا النمط الجيني لـ SARS-CoV-2 '484E' كقالب لتقييمنا النشط. ترتبط الطفرات في هذا الموقع بانخفاض نشاط التحييد من الأجسام المضادة المضيفة¹²، وتم العثور على 3 من 4 قواعد نيوكليوتيدات محتملة (الأدينين والجوانين والسيتوزين) في الموضع الأول من الكودون في متغيرات SARS-CoV-2 المتطورة بشكل طبيعي⁹. إن استبدال اليوراسيل في هذا الموقع من شأنه أن ينتج كودون توقف، وبالتالي لم يتم ملاحظته في الطبيعة، ولكن من أجل الدقة قمنا بإدراج شرط الثيمين في تقييمنا. لقد صممنا مسبارًا لكل من النيوكليوتيدات الأربعة المحتملة في هذا الموضع وقمنا بإنشاء 4 ظروف ديناميكية حرارية مختلفة بناءً على طاقة الربط (ΔG^o) من المناطق الثلاثة لمسبار موطئ القدم (NHR والمجال وموطئ القدم ؛ الشكل 3). 3a، راجع المواد والأساليب). تتراوح ظروف الطاقة هذه من الأكثر تحديدًا (المسبار 1)، حيث تكون طاقة NHR وموطئ القدم متساوية تقريبًا (حوالي -9 كيلو كالوري/مول)، إلى الأكثر حساسية (المسبار 6)، حيث لا يوجد NHR و موطئ القدم أقوى قليلاً (−12 كيلو كالوري / مول). في جميع الحالات، يتم ضبط طاقة ربط المجال للحفاظ على طاقة ربط المسبار الإجمالية ثابتة عند -40 كيلو كالوري/مول تقريبًا.

a معلمات التصميم للتوصيف النشط للمسبار. تم تصميم ستة مخططات حيوية مختلفة عن طريق تغيير طاقات الربط لموطئ القدم، والمجال، ومناطق NHR، للسماح بالمفاضلة بين خصوصية النوكليوتيدات المفردة والحساسية في شكل متانة للطفرات. تم تصميم أربعة مجسات مختلفة لكل من التصميمات الستة النشطة، والتي تغطي جميع الكودونات الأربعة المحتملة في موقع الطفرة 484 في بروتين SARS-CoV-2، وقد تمت ملاحظة ثلاثة منها في المتغيرات. تم اختبار كل مسبار باستخدام 12 قالب بلازميد مختلف، بما في ذلك الطفرات الأربع الفريدة من نوعها للنيوكليوتيدات وحدها وفي وجود طفرة واحدة أو اثنتين أخريين تم العثور عليها في متغير Omicron. b نتائج caPCR من سلسلة 484 K من التحقيقات. تشير المنحنيات الصلبة الحمراء إلى الأداء المستهدف بدون أي طفرات. تشير الخطوط المتقطعة والمنقطة والمنقطة إلى قوالب ذات حالات عدم تطابق 1 أو 2 أو 3 بالنسبة إلى تسلسل المسبار، على التوالي. يحدد اللون الكودون في الموقع 484 (E، K، Q، أو STOP). c مخطط لاختبار التمييز القوي لـ SARS-CoV-1/2. تم تصميم مجسين وفقا لمخطط الطاقة "التحقيق 5" في جزء a لمنطقة من جين القفيصة النووية في SARS-CoV-1 وSARS-CoV-2. تم اختبار كلا المسبارين في وجود قالب المطابقة التامة والمتغيرات بما في ذلك واحد أو كليهما من عدم التطابق الأولي، وكذلك في وجود قالب المطابقة التامة والمتغيرات غير المتطابقة للمسبار الآخر. d نتائج الاختبارات الموضحة في (c). تشير الخطوط الصلبة والمتقطعة والمنقطة والمنقطة إلى قوالب المطابقة التامة، أو القوالب التي تحتوي على أي من اثنين من فيروسات SNV، أو القوالب التي تحتوي على كلا فيروسي SNV نسبة إلى جينوم SARS-CoV-1 (الأزرق) أو SARS-CoV-2 (الأحمر).

صورة بالحجم الكامل

قمنا باختبار هذه المجسات باستخدام 12 قالبًا مختلفًا من الحمض النووي، 4 منها تمثل قالب المطابقة التامة لكل قاعدة من القواعد الأربعة المحتملة في الكودون 4. لإثبات قابلية ضبط علم الطاقة الخاص بالمسبار، أخذنا الطفرات التي نشأت في سلالات لاحقة من تطور SARS-CoV-484 وأدخلناها في القوالب: طفرة T2K الموجودة في سلالات Delta AY وOmicron، وطفرة S478N الموجودة في Omicron الأنساب (الشكل التخطيطي. 3a)¹⁰. تم تقييم جميع المجسات الـ 24 استجابة لتضخيم كل من القوالب الـ 12. شكل 3b يُظهر مجموعة فرعية من هذه النتائج، خصيصًا للمسابير المصممة لاستهداف طفرة 484 K الموجودة في المركبات العضوية المتطايرة بيتا وغاما¹⁰. مع تقليل قوة NHR وزيادة موطئ القدم، يظل الكشف عن قالب المطابقة التامة (الخط الأحمر الصلب) قويًا ويصبح المسبار أكثر حساسية للقوالب التي تحتوي على عدم تطابق 1 (خطوط متقطعة) و2 (خطوط منقطة). يوضح هذا قدرتنا على هندسة علم الطاقة المسبار للحصول على نتائج محددة للغاية وملزمة للهدف. بناءً على هذه النتائج، اخترنا المخطط النشط 2 لتحقيقات تمييز SNV والمخطط 5 لتحقيقات قوية.

لقد صممنا مسبارين قويين يستهدفان التسلسل الجيني للقفيصة النووية لـ SARS-CoV-2 وSARS-CoV-1. للتأكد من إمكانية التمييز بين تسلسلات مسببات الأمراض هذه باستخدام مجسات قوية مع البقاء متسامحًا مع الطفرات، ابتكرنا 2 قوالب لا تحتوي إما على عدم تطابق، أو 8 من 1 عدم تطابق، أو كلاهما غير متطابقين معًا (الشكل 2 أ). 3c، راجع المواد والأساليب). تختلف المنطقة المختارة لاكتشاف SARS-CoV-1 وSARS-CoV-2 بين التسلسلين المستهدفين بمقدار 2 طفرات: على هذا النحو، تم اختيار عدم التطابق في القالب بناءً على هذه الاختلافات. على هذا النحو، فإن قالب SARS-CoV-8 الذي يحتوي على حالتين غير متطابقتين يحتوي فقط على 2 اختلافات بالنسبة إلى تسلسل SARS-CoV-2، مما يسلط الضوء على تطبيق واقعي لأهمية الضبط الدقيق للمسابير من أجل الحساسية مقابل الخصوصية. شكل 3d يظهر نتائج هذه الاختبارات. في جميع الحالات، لم نلاحظ أي تفاعل متبادل بين مجسات وقوالب SARS-CoV-1 وSARS-CoV-2: تم اكتشاف SARS-CoV-1 RNA فقط بواسطة مسبار SARS-CoV-1، وSARS-CoV-2 ولم يتم اكتشاف الحمض النووي الريبي (RNA) إلا بواسطة مسبار SARS-CoV-2. يمكن أيضًا اكتشاف القوالب التي تحتوي على أي من الطفرتين بشكل لا لبس فيه بواسطة كل مسبار مناسب، مع تأثير إحدى الطفرتين بشكل أكثر وضوحًا على الأداء من الأخرى. وبالمثل، لا يزال يتم اكتشاف القوالب التي تحتوي على كلتا الطفرتين معًا على الرغم من تعرض الأداء للخطر قليلاً بسبب تفضيل أقل نشاطًا في إزاحة ذراع التبريد.

من خلال دراساتنا المستهدفة لعلم طاقة المسبار، أثبتنا قدرتنا على هندسة المسابير بدقة للحصول على المفاضلة المطلوبة بين الحساسية والنوعية. تتمتع المجسات التمييزية لـ SNV بعلميات الطاقة التي تتطلب تطابقًا تامًا لإزاحة ذراع التبريد، في حين تكون المجسات القوية أكثر اختلاطًا في ربطها بالأهداف مع القدرة على اكتشاف أمبليكون يحتوي على ما يصل إلى طفرتين. يمكن تطبيق النطاق النشط الذي اكتشفناه لضبط المجسات حسب الحاجة من مخطط الطاقة 1 إلى مخطط الطاقة 6 للسماح باكتشاف الأهداف بالعدد المطلوب من حالات عدم التطابق من تسلسل المسبار.

أداء تحقيقات قوية وتمييزية SNV

لإثبات إثبات المفهوم الخاص بتصميم المسبار القابل للضبط بدرجة عالية، أنشأنا لوحة كاملة من المسابير القوية والمجسات التمييزية لـ SNV. تسلط لوحتنا الضوء على فائدة المجسات القوية من خلال فحص جميع الفيروسات التاجية السبعة المعروفة بأنها تصيب البشر (HCoVs 7E وHKU229 وNL1 وOC63 وMERS-CoV وSARS-CoV-43 وSARS-CoV-1) بالإضافة إلى الأنفلونزا أ و ب⁸. بالإضافة إلى ذلك، توضح اللوحة الخاصة بنا وظيفة مجسات التمييز بين فيروسات SNV باستخدام 14 مسبارًا و3 أمبليكونات تغطي 5 مواقع شائعة الطفرات في جين سبايك SARS-CoV-2 للسماح بالتمييز بين المتغيرات المثيرة للقلق (417، 452، 484، 501، و 614؛ الشكل. S2)^9,10,11.

لتقييم أداء المجسات القوية في مقايسة RT-caPCR الخاصة بنا للكشف عن الأهداف الحساسة، أجرينا 65 اختبار RT-caPCR باستخدام عينات وسائط النقل الفيروسي السلبية لفيروس كورونا (VTM) التي تغطي مجموعة من التركيبة السكانية للمرضى (الجداول S1-S4) معزز بالحمض النووي الريبوزي (RNA) الاصطناعي من كل من الفيروسات التاجية البشرية السبعة، إما تم شراؤها من Twist Bioscience أو تم تصنيعها داخليًا باستخدام النسخ المختبري (IVT) من شظايا الجينات (الجدول S5). تم عزل الحمض النووي الريبي (RNA) وتنقيته من هذه العينات السريرية المفتعلة باستخدام طريقة الاستخلاص المعتمدة على الخرز¹³ نظرًا للأسبقية لاستخدام هذه المنهجية لاستخراج الحمض النووي الريبي (RNA) في سير العمل التشخيصي لـ SARS-CoV-2¹⁴ وتم استخدامه كمدخل لنظامنا. شمل هذا الاختبار أيضًا كلا من التحكم في الاستخراج (الحمض النووي الريبي (RNA) من البكتيريا MS2 الذي ارتفع إلى العينة المفتعلة قبل التنقية) والتحكم في التضخيم (التحكم الإيجابي الداخلي (IPC) RNA الذي ارتفع إلى مزيج تفاعل RT-caPCR). ما لم ينص على خلاف ذلك، تلقت التجارب هنا ما يقرب من 10⁶ نسخ من MS2 RNA و10⁷ نسخ من الحمض النووي الريبي الفيروسي. تم إجراء تفاعل RT-caPCR في 40 دقيقة باستخدام 5,000 جزيء من RNA للتحكم في IPC، وعينة RNA المستخرجة، و11 زوجًا تمهيديًا تغطي جميع الأهداف وعناصر التحكم.

وقد تم تحليل بيانات RT-caPCR لتحديد الأهداف الفيروسية الموجودة في كل عينة، وفي حالة SARS-CoV-2، ما هو المتغير المحدد الموجود (الشكل XNUMX أ). 4). الشكل 4a يُظهر تشغيلًا تمثيليًا باستخدام متغير SARS-CoV-2 Omicron كهدف RNA. تظهر جميع المجسات القوية للتمييز الفيروسي باللون الأحمر بينما تظهر مجسات تمييز SNV باللون الأزرق. تظهر عناصر التحكم في الاستخراج والتضخيم باللون الأخضر. تتوافق نقاط التحقيق الإيجابية والسلبية مع تحقيقات غير مروي تماما أو مروي تماما باستخدام تسلسلات لم يتم تضمين أي الاشعال أو القالب وتظهر باللون الرمادي. يمكن تلخيص هذا النوع من البيانات في مخطط مضغوط كما هو موضح في الشكل XNUMX. 4b: يتم عرض جميع المنحنيات الإيجابية المتوقعة على المخطط الأيسر، وتظهر جميع المنحنيات السلبية المتوقعة على المخطط الأيمن. في حين أن هناك مستوى صغير من النشاط خارج الهدف في بعض المجسات الخاصة بـ SNV، فإن مقارنة منحنيات المسبار الخاصة بـ SNV على الهدف (484 A، 452 L، 501Y-Om، 417 N، و614 G) مع SNV- الأخرى تؤكد تحقيقات محددة أن المجسات المستهدفة تستجيب بقوة أكبر في جميع الحالات، كما تم تقييمها بالعين وكذلك من خلال خوارزمية التمييز SNV المستندة إلى مشتقات مضان (انظر المواد والأساليب والأساليب التكميلية). نلاحظ ذلك، نظرًا للحمل الطفري العالي لمتغير Omicron مقارنة بالمتغيرات الأخرى¹¹، قمنا بتصميم تسلسل مسبار 484 A ليشمل أيضًا طفرات S477N وT478K الموجودة في هذا المتغير لتحسين الاكتشاف¹⁰. وبالمثل، يتضمن مسبار 501Y-Om الفريد طفرات Q493R وG496S وQ498R الموجودة خصيصًا في متغير Omicron. تم تقديم مسبار خاص بالمتغير الفرعي BA.2 من سلالة Omicron (501Y-Om2) لاحقًا. هذا المسبار مطابق لتسلسل 501Y-Om ولكنه يفتقر إلى طفرة G496S¹⁰.

a مثال على النتائج من تشغيل RT-caPCR للكشف عن متغير SARS-CoV-2 Omicron المثير للقلق. مجسات الكشف الفيروسي القوية باللون الأحمر، ومسابير تمييز SNV باللون الأزرق، وعناصر التحكم في الاستخراج والتضخيم باللون الأخضر، والضوابط الإيجابية والسلبية باللون الرمادي. يمثل كل منحنى شدة بقعة صفيف المسبار المقابلة في كل نقطة زمنية على الصور الـ 60 المكتسبة، والتي تم تطبيعها إلى ألمع نقطة في الصفيف. b ملخص النتائج المقابلة للتشغيل a. يتم عرض جميع الإيجابيات المتوقعة (عناصر التحكم في الاستخراج والتضخيم، والتعرف الفيروسي على الهدف، وجميع مجسات تمييز SNV على الهدف) في المخطط الأيسر، في حين يتم عرض جميع المجسات السلبية المتوقعة (جميع المجسات الفيروسية وتمييز SNV الأخرى، كما هو موضح في الرسم البياني). وكذلك الضوابط السلبية) تظهر في المؤامرة اليمنى. c نتائج الكشف الفيروسي لفيروس كورونا البشري 229E، وفيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية (MERS-CoV)، وSARS-CoV-1 بالتنسيق الموضح في (b). d. ينتج تمييز SNV عن قالب متغير لـ SARS-CoV-2 Delta بالتنسيق المحدد أعلاه.

صورة بالحجم الكامل

الشكل 4c يُظهر نتائج تمثيلية مضغوطة من 3 عمليات تشغيل لثلاثة قوالب مختلفة من مسببات الأمراض الفيروسية: فيروس كورونا البشري 3E، وMERS-CoV، وSARS-CoV-229. تُظهر جميع العينات الثلاثة اكتشافًا واضحًا لهدف الحمض النووي الريبي الفيروسي باستخدام مجسات تحديد مسببات الأمراض القوية، ولا يوجد نشاط مسبار تحديد هوية الفيروس خارج الهدف، ووجود جميع عناصر التحكم.

طاولات ومكاتب  1 يلخص نتائج التعرف الفيروسي من جميع التجارب الصالحة. قد يؤدي التنافس على موارد تفاعل PCR (على سبيل المثال، البوليميراز، dNTPs) إلى منع تضخيم أهداف عدد النسخ الأقل، لذلك يعتبر إجراء الاختبار صالحًا إذا تم اكتشاف أحد مسببات الأمراض الفيروسية وتم اكتشاف 1 على الأقل من عنصري التحكم (MS2 وIPC) أو لم يتم اكتشاف أي مُمْرِض فيروسي ولكن تم اكتشاف كلا عنصري التحكم. كانت 2 من العينات عبارة عن عناصر تحكم سلبية، والتي تضمنت فقط RNAs للتحكم في MS11 وIPC. وفي جميع هذه العينات الـ 2، تم اكتشاف كل من IPC وMS11 (2%). تم تحديد 100 عينة من أصل 36 عينة من فيروس SARS-CoV-36 (2%) كما تم تقييمها عن طريق اكتشاف مسبار القفيصة النووية لـ SARS-CoV-100. تُظهر أيضًا فيروسات كورونا البشرية المتبقية (2E وNL229 وOC63 وHKU43) بالإضافة إلى أهداف SARS-CoV-1 وMERS-CoV حساسية عالية، مع اكتشاف بنسبة 1% لجميع الأهداف. تساهم كل من عملية الربط التمهيدي وإزاحة المجسات بوساطة الأمبليكون في خصوصية اللوحة، والتي كانت 100% عبر جميع الأهداف. هنا، يتم حساب الخصوصية كنسبة من السلبيات الحقيقية المكتشفة بشكل صحيح. باختصار، لم يتم اكتشاف أي قالب في مسبار قوي غير الذي تم تصميمه خصيصًا له.

الشكل 4d يُظهر عرضًا تمثيليًا يسلط الضوء على قدرة اختبار RT-caPCR الخاص بنا على تحديد هدف RNA بالإضافة إلى توفير دقة النوكليوتيدات الفردية من خلال إظهار الكشف عن المتغيرات الفيروسية بالتزامن مع تحديد العامل الممرض لمتغير SARS-CoV-2 Delta. في حين يُظهر المسبار 452 L نشاطًا كبيرًا خارج الهدف، فمن الواضح أن اكتشافه أقل كفاءة من مسبار 452 R المستهدف (المنحنى الأزرق بأعلى كثافة في المخطط الأيسر). وبالتالي، تسمح مجسات تمييز SNV بالتمييز الواضح بين متغيرات SARS-CoV-2 التي تختلف فقط من خلال عدد قليل من الطفرات الفردية.

طاولات ومكاتب  2 يلخص أداء المجسات الخاصة بـ SNV لمتغيرات SARS-CoV-2 عبر 36 تجربة. عدد الاكتشافات المتوقعة يساوي عدد عمليات التشغيل التي تم تضمين قالب يعرض تلك الطفرة فيها، في حين أن عدد السلبيات المتوقعة هو عدد عمليات التشغيل التي لم يتم تضمين القالب المقابل لها. الإيجابيات الحقيقية هي عمليات التشغيل التي كان مسبار الاهتمام فيها هو المسبار المهيمن الخاص بـ SNV لموقع الطفرة هذا (كما تم تقييمه خوارزميًا)، والسلبيات الحقيقية هي تلك العمليات التي لم تكن كذلك. في تشغيل واحد، نلاحظ أن المسبار 614 G كان محجوبًا بواسطة جسيم غريب (غبار)، وبالتالي فإن إجمالي هذه الأهداف هو 35، بدلاً من 36. وبصرف النظر عن 484E، تظهر جميع المجسات حساسية بنسبة 90٪ على الأقل. يمكن تفسير الأداء الضعيف للمسبار 484E جزئيًا بوجود طفرة SNV (طفرة T478K) في الأمبليكون لمتغيرات دلتا. تظهر جميع المجسات الأخرى خصوصية بنسبة 100٪، حيث أن الأمبليكون سوف يحل دائمًا بشكل تفضيلي محل المُخمد المطابق الخاص به على واحد مع طفرة، على افتراض أن علم الطاقة على الهدف متساوٍ.

تسلط هذه البيانات معًا الضوء على قدرة المجسات القوية والمسابير التمييزية لـ SNV على العمل جنبًا إلى جنب لتحديد هدف الحمض النووي الريبي (RNA) الموجود بسرعة (مع المسبار القوي) وتوفير دقة النوكليوتيدات الفردية (مع المسبار التمييزي SNV).

تقييم الحد الأقصى للكشف عن RT-caPCR

أجرينا بعد ذلك سلسلة من التجارب لتحديد الحد الأقصى لاكتشاف مقايسة RT-caPCR الخاصة بنا. في جميع الاختبارات السابقة في الشكل. 4، مدخلات الفيروسية من 10⁷ تم رفع الجزيئات إلى VTM قبل الاستخراج، على غرار تقديرات ذروة الحمل الفيروسي لمرضى Omicron وDelta^15,16. قمنا هنا بقياس LOD الخاص بمقايستنا عن طريق تغيير عدد نسخ الإدخال من الحمض النووي الريبي الفيروسي والحفاظ على نسخ التحكم كما هي. باستخدام الحمض النووي الريبي (RNA) المنقى الذي تم الحصول عليه من Twist Bioscience أو تم تصنيعه داخليًا من أجزاء الجينات عبر IVT، حققنا LOD مكون من 1,000 جزيء لجميع الفيروسات التاجية السبعة. وتظهر النتائج التمثيلية في الشكل. S3. في كلا الشكلين. S3أ و S3b، نجد أنه يمكننا بنجاح اكتشاف ما يصل إلى 1,000 جزيء لكل تفاعل لهدف واحد باستخدام كلا عنصري التحكم (HCoV 229E؛ الشكل XNUMX). S3أ) ولمتغير SARS-CoV-2 مع كلا عنصري التحكم (Omicron؛ الشكل XNUMX). S3b) ، وهي كمية أقل من 3 أوامر من حيث الحجم المستخدمة لاختبار VTM عند استخدام RNA المنقى. عندما يختلف وجود هدف واحد فقط، كما في الشكل. S3أ، نجد تأخيرًا واضحًا في وقت العتبة لكل ترتيب من حيث الحجم لهذا الهدف فقط، في حين أن عنصري التحكم متسقان عبر عمليات التشغيل. هذا الاتجاه أقل وضوحًا بالنسبة لـ SARS-CoV-2، وهو أمر متوقع نظرًا لأن هذا الهدف يتطلب تضخيمًا متزامنًا لـ 2 أمبليكونات ووحدتي تحكم. يبدو أن التنافس على الموارد الأنزيمية وdNTPs يعطل الاتجاه الواضح الذي لوحظ بالنسبة للأهداف أحادية الأمبليكون. في التين. S3c، تم إجراء سلسلة التخفيف عن طريق تغيير كمية إدخال الحمض النووي الريبي (RNA) إلى خط أنابيب الاستخراج لمتغير Omicron. هنا أيضًا، نرى الكشف وصولاً إلى أدنى قيمة تم اختبارها (إدخال 10,000 جزيء في خطوة استخراج الحمض النووي الريبي (RNA) مع ما يقرب من 1,000 جزيء يدخل في خطوة RT بسبب الخسائر أثناء الاستخراج وعدم استخدام حجم الشطف الكامل البالغ 25 ميكرولتر في التفاعل) والتأخير المتوقع في التضخيم كدالة لتركيز المدخلات.

الكشف عن أهداف متعددة في عينة واحدة

بعد أن أثبتنا نجاح مقايسة RT-caPCR ذات المسبار القابل للضبط في تحديد أهداف الحمض النووي الريبي (RNA) باستخدام مجسات قوية (كل فيروس) مع خصوصية نيوكليوتيدات فردية مع مجسات تمييز SNV (متغيرات SARS-CoV-2)، اكتشفنا بعد ذلك كيفية إجراء اختبارنا عندما تقييم المدخلات الأكثر تعقيدًا عن طريق محاكاة عينات العدوى المشتركة التي تحتوي على أهداف متعددة للحمض النووي الريبي (RNA). هنا، مبلغ الإدخال 10⁵ تم رفع جزيئات كل قالب مباشرة إلى تفاعل RT-caPCR بدون خطوات استخراج VTM. قمنا أيضًا بتوسيع اختبار RT-caPCR الخاص بنا لاختبار المزيد من أهداف الحمض النووي الريبي (RNA) من خلال تضمين 3 مجموعات تمهيدية إضافية و4 مجسات لاختبار الأنفلونزا A وB (2 يستهدفان جين بروتين المصفوفة M1 للأنفلونزا A¹⁷ و2 يستهدفان البروتين غير البنيوي 1 (nsp1) في سلالتي ياماغاتا وفيكتوريا للأنفلونزا ب¹⁸). تم اختبار هذا الاختبار المكون من 14 plex لجميع الأهداف الأربعة الجديدة للتأكد من فعاليته (الشكل 4 أ). S4).

قمنا بتقييم كل من 3 قوالب فيروسية مختلفة بمفردها وكذلك في 3 مجموعات مختلفة: SARS-CoV-2 Deltavariance + HCoV229E (الشكل XNUMX). 5a)، متغير دلتا لـ SARS-CoV-2 + سلالة FluB Yamagata (الشكل XNUMX). 5b) ، ونسب SARS-CoV-2 + HCoV229E + FluB Yamagata (الشكل XNUMX أ). 5c). يتم تقديم البيانات كصور تتبع فلورسنت مضغوطة كما هو موضح أعلاه مع تحقيقات إيجابية متوقعة في اللوحة اليسرى وتحقيقات سلبية متوقعة في اللوحة اليمنى. في جميع عمليات التشغيل، لاحظنا السلوك المتوقع: تبلغ مجسات قوية (تحديد الفيروس) عن وجود جميع قوالب مسببات الأمراض المضمنة، وتحدد مجسات تمييز SNV (تحديد المتغير) بشكل صحيح متغير دلتا مع مستويات منخفضة من نشاط المسبار خارج الهدف في جميع أنحاء العالم. 5 مواقع SNV. يعد المسبار 484E هو الأضعف أداءً، ويرجع ذلك على الأرجح إلى عدم التطابق المذكور أعلاه في منطقة مجال هذا المسبار. بالإضافة إلى ذلك، في بعض التجارب، كان أداء التحكم في استخراج MS2 ضعيفًا بسبب التنافس على الموارد بين 8 أمبليكونات مختلفة. نلاحظ أيضًا أن عمليات التشغيل هذه تتضمن فقط نسخة متماثلة واحدة لكل من عنصري التحكم MS1 وIPC، بدلاً من 2 كما في الشكل 2. 4، حيث كانت هذه لوحة محدثة تتضمن مسبار 501Y-Om2. توضح هذه البيانات قدرة تقنيتنا على إجراء تقييم دقيق للعينات الأكثر تعقيدًا التي تحتوي على أهداف متعددة من الحمض النووي الريبي (RNA) ذات الاهتمام، مما يعرض تنوع الفحص.

a ينتج القالب الفردي عن متغير دلتا SARS-CoV-2 وفيروس كورونا البشري 229E بالإضافة إلى عينة "العدوى المشتركة" بما في ذلك كلا القالبين. b ينتج القالب الفردي عن متغير دلتا لـ SARS-CoV-2 وسلالة ياماغاتا للأنفلونزا B، إلى جانب عينة من العدوى المصاحبة تتضمن كلا القالبين. c. نتائج هدف واحد من نفس الأهداف كما في a و b، بالإضافة إلى عينة من العدوى المصاحبة تتضمن القوالب الثلاثة جميعها.

صورة بالحجم الكامل

• محتوى مدعوم من تحسين محركات البحث وتوزيع العلاقات العامة. تضخيم اليوم.
• PlatoData.Network Vertical Generative Ai. تمكين نفسك. الوصول هنا.
• أفلاطونايستريم. ذكاء Web3. تضخيم المعرفة. الوصول هنا.
• أفلاطون كربون، كلينتك ، الطاقة، بيئة، شمسي، إدارة المخلفات. الوصول هنا.
• أفلاطون هيلث. التكنولوجيا الحيوية وذكاء التجارب السريرية. الوصول هنا.
• المصدر https://www.nature.com/articles/s42003-023-05346-4