توليف النانوبوت

تم إعداد الروبوتات النانوية كما هو موضح سابقًا³³. باختصار، تم تصنيع MSNPs باستخدام طريقة Stöber المعدلة⁴¹، تفاعل ثلاثي إيثانولامين (35 جم)، ماء عالي النقاء (20 مل) وبروميد سداسي ميثيل الأمونيوم (CTAB؛ 570 مجم) عند 95 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع التحريك. تمت إضافة رباعي إيثيل أورثوسيليكات (1.5 مل) لاحقًا قطرة قطرة؛ تُرك الخليط ليتفاعل لمدة ساعتين عند درجة حرارة 2 درجة مئوية، وتم جمع MSNPs الناتج عن طريق الطرد المركزي وغسله في الإيثانول (ثلاث مرات، 95g، 5 دقائق). لإزالة قالب CTAB، تم وضع MSNPs تحت الارتجاع في الميثانول الحمضي (1.8 مل حمض الهيدروكلوريك، 30 مل ميثانول) لمدة 24 ساعة. بعد ذلك، تم جمع MSNPs بواسطة الطرد المركزي وغسلها ثلاث مرات في الإيثانول (2,500g، 5   دقيقة) قبل دمج تعديل الأمين عن طريق إضافة APTES (6   ميكرولتر لكل ملجم من MSNP) إلى MSNPs (1   مجم   مل^-1) في محلول إيثانولي 70٪ عند 70 درجة مئوية، مع التحريك بقوة لمدة ساعة واحدة. MSNPs-NH₂ تم جمعها وغسلها ثلاث مرات في الإيثانول وثلاث مرات في الماء بواسطة الطرد المركزي (ثلاث مرات، 1,150g، 5 دقائق). MSNPs-NH₂ تم إعادة تعليقها في برنامج تلفزيوني بتركيز 1 ملغم مل^-1 ويبلغ الحجم الإجمالي 900 ميكرولتر، ويتم تنشيطه باستخدام الجلوتارالدهيد (100 ميكرولتر) لمدة 2.5 ميكرولتر في درجة حرارة الغرفة. تنشيط MSNPs-NH₂ تم جمعها وغسلها في برنامج تلفزيوني ثلاث مرات بواسطة الطرد المركزي (1,150g، 5 دقيقة)، معلَّق مرة أخرى في محلول اليورياز (3 مجم مل^-1) و PEG غير المتجانسة (1 ميكروغرام PEG لكل ملغ من 5   كيلو دالتون HS-MSNPs-NH₂) في برنامج تلفزيوني، وتفاعل لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تم بعد ذلك جمع الروبوتات النانوية الناتجة وغسلها ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني بواسطة الطرد المركزي (1,150g، 5 دقائق) قبل إعادة تعليقها في تشتت AuNPs، المُعد كما هو موضح سابقًا⁵¹، وتركها تتفاعل لمدة 10 دقائق، وغسلها جيداً بواسطة الطرد المركزي (ثلاث مرات، 1,150g، 5 دقائق).

توزيع الحجم الهيدروديناميكي والشحن السطحي لـ MSNPs و MSNPs-NH₂، تم تحديد الروبوتات النانوية والروبوتات النانوية المزينة بـ AuNP باستخدام نظام تشتت الضوء الديناميكي Wyatt Mobius و Malvern Zetasizer على التوالي. وفي جميع الحالات كان التركيز 20 ميكروجرام/مل^-1 ووقت الاستحواذ 5 ثوانٍ، باستخدام ثلاثة أشواط لكل تجربة. تم إجراء ثلاثة قياسات لكل نوع الجسيمات.

توليف FITC MSNPs

تم تحضير خليط من FITC (2 ميكروجرام) وإيثانول (5 ميكرولتر) وAPTES (400 ميكرولتر) وتقليبه لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، تم اتباع البروتوكول الموصوف مسبقًا لتخليق MSNP، فيما عدا أننا أضفنا رباعي إيثيل أورثوسيليكات (1.25 ميكرولتر) قطرة قطرة مع خليط FITC-APTES (250 ميكرولتر). كانت خطوات التشغيل للحصول على الروبوتات النانوية التي تحمل علامة FITC كما هو مذكور أعلاه.

توليف AuNPs

تم تصنيعها AuNPs باستخدام طريقة المبلغ عنها³³. باختصار، تم تنظيف جميع المواد باستخدام الماء الملكي الطازج، وشطفها جيدًا بالماء، وتجفيفها بالهواء. وفي وقت لاحق، 1 ملم AuCl₄ تم تسخين المحلول إلى نقطة الغليان أثناء التحريك في دورق دائري مدمج في نظام الارتجاع. بعد ذلك، تمت إضافة 10 مل من محلول سترات الصوديوم (30.8 ملم)، وتم غلي المحلول لمدة 20 دقيقة، مما أدى إلى ظهور لون أحمر. تم بعد ذلك السماح للمحلول بالتبريد إلى درجة حرارة الغرفة مع التحريك لمدة ساعة واحدة. تم تخزين AuNPs الناتج في الظلام وتم إجراء التوصيف باستخدام المجهر الإلكتروني للإرسال.

النشاط الأنزيمي

النشاط الأنزيمي للروبوتات النانوية ¹⁸الروبوتات النانوية و ¹³¹تم قياس الروبوتات النانوية باستخدام الفينول الأحمر. وللقيام بذلك، يتم استخدام 2 ميكرولتر من الروبوتات النانوية (1 ملجم / مل^-1) إلى طبق 96 بئرًا وخلطه مع 200 ميكرولتر من محاليل اليوريا المختلفة (0، 50، 100، 200 ميكرومتر) باللون الأحمر الفينول 1.1 مم. تم قياس الامتصاص عند 560 نانومتر مع مرور الوقت عند 37 درجة مئوية.

ديناميات حركة النانوبوت من خلال المجهر الضوئي

تم الحصول على مقاطع فيديو بصرية للروبوتات النانوية باستخدام مجهر Leica Thunder، إلى جانب كاميرا Hamamatsu CCD عالية السرعة وهدف ×1.25. لهذا الغرض، تم طرد الروبوتات النانوية وإعادة تعليقها في 50 ميكرولتر من PBS (التركيز النهائي 20 ميكروجرام مل).^-1). بعد ذلك، تمت تعبئة طبق بيتري بـ 3 مل من PBS أو محلول 300 مم من اليوريا (في PBS) وتم ملاحظته تحت المجهر. قطرة 5 ميكرولتر مع الروبوتات النانوية (20 ملجم / مل^-1) إلى طبق بيتري المملوء بالسائل وتم تسجيل مقاطع الفيديو بمعدل 25 إطارًا في الثانية. تم تحليل توزيعات كثافة بكسل الفيديو في عائد الاستثمار على فترات زمنية مدتها 15 ثانية باستخدام برنامج ImageJ.

وضع العلامات الإشعاعية للروبوتات النانوية باستخدام [¹⁸F] F-PyTFP

توليف [¹⁸F] F-PyTFP

[¹⁸F] تم تصنيع F-PyTFP في وحدة Neptis xSeed (تطبيقات الكيمياء الإشعاعية المحسنة)، باتباع الطريقة التي تم الإبلاغ عنها مسبقًا³³.

توليف ¹⁸الروبوتات النانوية التي تحمل علامة F

تم تصنيف الروبوتات النانوية بـ [¹⁸F]F-PyTFP، على أساس الإجراء المحدد مسبقًا مع تعديلات طفيفة³³. باختصار، 200 ميكرولتر من محلول النانوبوت (1 ميكروجرام / مل^-1) بالطرد المركزي (10 دقيقة، 13,853g) ، تم إعادة تعليقه في 10 ميكرولتر من PBS (1 ميكرومولار، درجة الحموضة 8)، وحضنت مع 4 ميكرولتر من [¹⁸F] F-PyTFP في الأسيتونيتريل (حوالي 37 MBq) لمدة 35 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة، تم تخفيف خليط التفاعل بالماء (200 ميكرولتر) وتم تنقيته بواسطة الطرد المركزي (5 ميكرومتر، 13,853g). تم بعد ذلك شطف الحبيبات الناتجة ثلاث مرات بالماء قبل قياسها في معاير الجرعة (CPCRC-25R، Capintec). تم حساب العائد الكيميائي الإشعاعي على أنه النسبة بين كمية النشاط الإشعاعي الموجودة في الروبوتات النانوية بعد الغسيل والكمية الأولية للنشاط الإشعاعي. كانت النقاء الكيميائي الإشعاعي بعد التنقية ≥99٪، كما هو محدد بواسطة التحليل اللوني للطبقة الرقيقة الراديوية (راديو TLC) باستخدام ورق كروماتوجرافيا iTLC-SG (Agilent Technologies) وثنائي كلورو ميثان والميثانول (2: 1) كمرحلتين ثابتة ومتحركة، على التوالي. تم تحليل لوحات TLC باستخدام قارئ TLC (MiniGITA، Raytest).

استقرار ¹⁸الروبوتات النانوية

استقرار ¹⁸تم تحديد الروبوتات النانوية التي تحمل علامة F باستخدام الوسائط التالية: (1) 300 ملم من اليوريا، (2) الماء، و(3) بول من الحيوانات الحاملة للورم. ¹⁸تم تحضين الروبوتات النانوية التي تحمل علامة F (10 ميكرولتر) مع المحلول المقابل (100 ميكرولتر) لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، تم فصل الروبوتات النانوية والطاف عن طريق الطرد المركزي وجمعهما، وقياس النشاط الإشعاعي في معاير الجرعة (CPCRC-1R).

وضع العلامات الإشعاعية للروبوتات النانوية باستخدام ¹³¹I

تم إجراء عملية المعالجة باليود الإشعاعي للروبوتات النانوية اليورياز عن طريق احتضان الروبوتات النانوية بمادة قابلة للحقن.¹³¹I] محلول NaI (925 MBq ml^-1; جنرال إلكتريك للرعاية الصحية). باختصار، 400 ميكرولتر من محلول اليورياز النانوبوتي (1 ميكروجرام   مل^-1) تم الطرد المركزي (13,853g، 5 دقائق)، معلَّق مرة أخرى في 100 ميكرولتر من PBS (10 مللي مولار، درجة حموضة 7.4) وحضنت بـ 25 ميكرولتر أو 185 ميكرولتر من الحقن القابل للحقن.¹³¹I] NaI (حوالي 42.55 أو 277.5 ميجابايت كيو، على التوالي) لمدة 30 دقيقة، اعتمادًا على النشاط النهائي المطلوب. بعد الحضانة، تمت تنقية خليط التفاعل بواسطة الطرد المركزي (13,853،XNUMXg، 5 دقائق). تم غسل المادة المترسبة الناتجة ثلاث مرات بالماء (100 ميكرولتر). تم تحديد النشاط الإشعاعي في الطاف والرواسب باستخدام معاير الجرعة (CPCRC-25R)، وتم تحليل كلا الكسرين بواسطة راديو TLC، كما هو الحال بالنسبة ¹⁸الروبوتات النانوية.

تطوير النموذج الحيواني

تمت صيانة الفئران والتعامل معها وفقًا لتوجيهات المجلس الأوروبي 2010/63/UE والمبادئ التوجيهية الداخلية. تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل لجنة الأخلاقيات biomaGUNE التابعة لـ CIC والسلطات المحلية (Diputación Foral de Guipuzcoa، PRO-AE-SS-276). أعمى تحليل الصور (كل من PET والتصوير بالرنين المغناطيسي) نحو التوزيع الجماعي للحيوانات.

تم إنشاء نموذج الفئران المثلي لسرطان المثانة عن طريق إعطاء خلايا MB49 داخل الوريد (خط خلايا سرطان المثانة الفأري) إلى فئران أنثى C57BL/6JRj (عمرها 8 أسابيع، جانفييه). بالنسبة للتجارب التي تهدف إلى تحديد تراكم الورم (أربع مجموعات؛ التفاصيل أدناه)، تم تلقيح ستة حيوانات لكل مجموعة، على النحو المحدد باستخدام التحليل الدقيق، مع الافتراضات التالية: الدقة المطلوبة، 20٪؛ المتوقع SD، ± 20٪؛ الثقة 95%؛ خسارة الحيوانات 20% بالنسبة لتجارب الفعالية العلاجية (ست مجموعات؛ التفاصيل أدناه)، تم تضمين عشرة حيوانات في كل مجموعة، كما تم حسابها باستخدام نموذج الطالب ذو الذيل الواحد. t-اختبار الفرق بين وسيلتين مستقلتين، مع الافتراضات التالية: فرضية العدم، العلاج لا يؤثر على نمو الورم؛ α، 0.05؛ 1 − β، 0.95؛ SD، ±50%؛ الفروق المتوقعة بين المجموعات 50%؛ خسارة الحيوانات 20% بما أن التجربة أجريت على دفعتين لأسباب تشغيلية، فقد تم تضمين مجموعة مراقبة واحدة في كلا الدفعتين (الجدول XNUMX). 2)، وبعد ذلك تم تجميع جميع الحيوانات. لإنشاء الورم، تم تخدير الفئران عن طريق استنشاق 3٪ من الأيزوفلورين في O النقي₂ ويتم الحفاظ عليها بنسبة 1.0-1.5% من الأيزوفلورين في 100% O₂. بعد ذلك، تم إفراغ المثانة، وإحداث آفات كيميائية على الظهارة البولية عن طريق غرس 50 ميكرولتر من البولي-l- اللايسين (سيجما ألدريتش) من خلال قسطرة قياس 24 لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، تم إفراغ المثانة مرة أخرى وخلايا MB49 (10⁵ تم غرس الخلايا) في DMEM عالي الجلوكوز (100 ميكرولتر) لمدة ساعة قبل إزالة القسطرة وإفراغ المثانة عن طريق تدليك البطن. طوال التجارب، تمت مراقبة الفئران ووزنها لمراقبة الصحة والرفاهية. تم تطبيق نقطة النهاية البشرية إذا تجاوز فقدان الوزن 1% أو على أساس الأعراض السريرية، وفقًا لمعايير الطبيب البيطري المسؤول.

تتبع حجم الورم

أجريت دراسات التصوير بالرنين المغناطيسي بعد 7 و14 يومًا من تحريض الورم، باستخدام الماسح الضوئي 7 T Bruker BioSpec USR 70/30 (Bruker BioSpin) المجهز بإدخال متدرج BGA-12S يبلغ 440  mT m^-1 ومرنان 112/086 QSN (T12053V3) للترددات الراديوية¹⁴ ناقل الحركة، وملف سطح دماغ الفئران (T11205V3) لاستقبال التردد اللاسلكي (كلاهما يعمل عند 300 ميجاهرتز). تم تخدير الحيوانات باستخدام الأيزوفلورين (4% للتحريض و1.5% للصيانة في 50% O₂/50% ن₂ خليط) ووضعها على مهد متوافق مع MR. تمت مراقبة درجة حرارة الجسم ومعدل التنفس بشكل مستمر باستخدام جهاز مراقبة متوافق مع MR (طراز 1030 SA، أدوات الحيوانات الصغيرة)، ومتصل بنظام سخان هواء القوارض الصغيرة للحفاظ على درجة حرارة الجسم. بعد الحصول على صور مرجعية، تم استخدام تسلسل تصوير مرجح للانتشار قائم على الصدى المغزلي لتصوير الأورام، باستخدام المعلمات التالية: وقت الصدى (T_E) = 22.3  مللي ثانية، وقت التكرار (T_R) =  2,500  مللي ثانية، n = 2 متوسطات، صورة واحدة مقاس A0 (الصورة الأساسية مع b = 0 s  مم^-2) وصورة DW واحدة تم الحصول عليها باستخدام تدرجات الانتشار في الاتجاه (1، 0، 0) مع مدة تدرج δ = 4.5 ms وفصل متدرج Δ = 10.6  مللي ثانية، العطاء b = 650 s  مم^-2، 16 ×   16 ملم² مجال الرؤية، وحجم مصفوفة الصورة يبلغ 160 ×   160 نقطة، و20 شريحة متتالية بسمك 0.5 مم (بدون فجوة، يتم الحصول عليها في الوضع المشذّر) وعرض نطاق ترددي يبلغ 192.9 هرتز لكل بكسل. لتصور الأورام، تمت معالجة الصور لاحقًا باستخدام برنامج ImageJ، وتقسيم الصور المكتسبة بتدرج انتشاري (b = 650 s  مم^-2) من قبل تلك المكتسبة دون (b = 0 s  مم^-2)، وتطبيق مرشح غاوسي ثلاثي الأبعاد (σ_x = σ_y = σ_z =  0.7) إلى النتيجة. تم تحديد الأورام يدويًا لتحديد حجمها.

في التوزيع الحيوي في الجسم الحي

في اليوم 15 بعد تحريض الورم، تم اختيارهم بصورة عشوائية الفئران إلى أربع مجموعات للحصول على توزيعات متجانسة متوسط ​​حجم الورم بين المجموعات. تم الحصول على فحوصات PET-CT (الماسحات الضوئية MOLECUBES β وX-CUBE) لمدة 3 ساعات بعد إعطاء 100 ميكرولتر من الدواء داخل الوريد ¹⁸F-BSA (المجموعتان 1 و 2) أو ¹⁸الروبوتات النانوية F-urease (المجموعتان 3 و4) بتركيز 200 ميكروغرام مل^-1، باستخدام الماء (المجموعتان 1 و 3) أو 300 ملم من اليوريا في الماء (المجموعتان 2 و 4) كوسيلة (الجدول 1). للحصول على الصور، تم تحريض الحيوانات بالتخدير (5٪ إيسوفلوران في الأكسجين النقي) ووضعها في وضع ضعيف قبل تدليك منطقة البطن لإخلاء المثانة. وبعد ذلك مباشرة، المقابلة ¹⁸روبوتات نانوية تحمل علامة F (¹⁸F-BSA/¹⁸تم غرس F-urease في الماء / اليوريا) في المثانة من خلال قسطرة قياس 24 واحتضانها لمدة ساعة واحدة، قبل إزالة القسطرة، وإفراغ المثانة وترك الفئران للتعافي من التخدير. في t = 3  ساعات بعد الإعطاء، تمت إعادة تخدير الحيوانات وتم الحصول على صور PET ثابتة لكامل الجسم لمدة 10   دقيقة، متبوعة بالأشعة المقطعية. تم إعادة بناء صور PET باستخدام خوارزمية إعادة بناء تعظيم توقع المجموعة الفرعية ثلاثية الأبعاد مع تصحيحات عشوائية ومبعثرة وتوهين. تم تسجيل صور PET-CT لنفس الماوس وتحليلها باستخدام أداة معالجة الصور PMOD. تم الحصول على قطع من تركيز النشاط الإشعاعي مقابل الوقت عن طريق إنشاء حجم من الاهتمام في منطقة المثانة العلوية باستخدام أداة كفاف ثلاثية الأبعاد وقياس النشاط (تصحيح الاضمحلال) بالكيلوبيكريل لكل عضو. تم تصحيح النتائج من خلال تطبيق عامل المعايرة ومن ثم تطبيعها بواسطة حجم الورم المشتق من التصوير بالرنين المغناطيسي.

دراسات خارج الجسم الحي

التحليلات النسيجية

بعد الانتهاء من جميع عمليات التصوير، تم تحديد المثانات (n =  3 لكل مجموعة) من الحيوانات الحاملة للورم والحيوانات السليمة تمت إزالتها في ظروف معقمة وتم تثبيتها على الفور في 4٪ من الفورمالديهايد. بعد ذلك، تم دمج المثانات في البارافين قبل أخذ مقاطع بحجم 2-3 ميكرومتر لتلطيخ الهيماتوكسيلين-أيوزين. تم الحصول على صور تمثيلية من جميع شروط الفحص النسيجي.

تحليل ICP-MS

تم إجراء القياسات على جهاز Thermo iCAP Q ICP-MS (Thermo Fisher Scientific) إلى جانب جهاز أخذ العينات التلقائي ASX-560 (CETAC Tech). وبعد الانتهاء من جميع عمليات التصوير، تم قتل الحيوانات واختيار المثانات (n = 2 لكل مجموعة؛ أربع مجموعات) تم جمعها وهضمها في 1 مل من HNO₃:حمض الهيدروكلوريك (خليط 4:1). تم غلي التشتت حتى تذوب الأعضاء تمامًا. بعد ذلك، تم تبريد المحلول إلى درجة حرارة الغرفة وتحليله باستخدام ICP-MS لتحديد تركيز Au في كل عينة، وتحويل النتائج إلى نسب مئوية من الجرعة المحقونة لكل جرام من الأنسجة (%ID g^-1).

الكيمياء المناعية والتصوير المجهري متحد البؤر

بالنسبة لتحليلات الكيمياء المناعية، تلقت الحيوانات الحاملة للورم روبوتات نانوية تحمل علامة FITC في الماء أو 300 ملم من اليوريا (n = 4 لكل مجموعة)، كما هو موضح أعلاه، لدراسات PET-CT. بالإضافة إلى ذلك، كانت الحيوانات الحاملة للورم والتي لا تحتوي على روبوتات نانوية بمثابة مجموعة مراقبة (n = 2). في جميع الحالات، تم جمع المثانات وتجميدها وتقطيعها إلى أقسام بحجم 10 ميكرومتر والتي تم تثبيتها على الفور في 10٪ فورمالدهايد لمدة 15 دقيقة، وغسلها بـ 10 ميكرومتر PBS ثم حضنتها في 50 ميكرومتر NH₄Cl في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق قبل الشطف مرة أخرى مع برنامج تلفزيوني. تم إجراء النفاذية باستخدام الميثانول: الأسيتون (1: 1) لمدة 5 دقائق عند درجة حرارة الغرفة و0.1٪ تريتون في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق. بعد غسل PBS، تم تشبع العينات بمحلول 5٪ BSA – 0.5٪ توين في PBS لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة باستخدام الماوس المضاد لـ FITC (1: 1، Abcam) في 100٪ BSA -5% توين. تم غسل المقاطع ثلاث مرات باستخدام 0.5 ملي مولار PBS لمدة 10 دقائق واحتضانها لمدة 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الجسم المضاد الثانوي Alex Fluor 30 IgG المضاد للفأر (مجسات جزيئية، تقنيات الحياة، 647: 1) في 1,000٪ BSA - 5٪ توين في PBS، تم غسلها مرة أخرى في PBS (0.5   ×   3   دقيقة) وتم تركيبها باستخدام مجموعة ProLong المضادة للتلاشي مع 5،4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI؛ مجسات جزيئية، تقنيات الحياة). تم الحصول على الصور باستخدام مجهر Leica STELLARIS 5 متحد البؤر (UPV / EHU Scientific Park) بإعدادات متطابقة لجميع الأقسام: التكبير × 10 مع تصوير البلاط والخياطة (عادةً مجال رؤية 4   ×   5). كانت نوافذ خط الليزر والكشف 405 نانومتر و440-503 نانومتر لـ DAPI و489 نانومتر و494-602 نانومتر لليزر الأبيض FITC و653 نانومتر و660-836 نانومتر للليزر الأبيض Alexa647.

المقاصة البصرية

بعد التروية باستخدام بارافورمالدهيد 4% وPBS، تمت إزالة عينات المثانة وتثبيتها بشكل أكبر في بارافورمالدهيد 4% طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية، ثم تم تضمينها في محقنة سعة 5 مل مع أغاروز منخفض نقطة الانصهار بنسبة 0.8% لتشكيل كتلة أسطوانية وتمكين عملية سهلة. تركيب في كوفيت الكوارتز. تم تجفيف الكتلة بأكملها تدريجيًا باستخدام الميثانول: H₂O عند 4 درجة مئوية (30%:70% لمدة 1 h، 50%:50% لمدة 1 h، 70%:30% لمدة 1 h، 100%:0% لمدة 1 h، ثم 100% ميثانول طوال الليل ومرة ​​أخرى لمدة 4 h) وأخيراً مغمورة في كحول البنزيل - بنزوات البنزيل (BABB) كمحلول مطابق لمعامل الانكسار للتصوير. لإجراء مقارنات مختبرية بين الروبوتات النانوية FITC الخضراء والجزيئات الحمراء التجارية، استخدمنا DiagNano (التشخيص الإبداعي) جسيمات السيليكا الفلورية الحمراء النانوية، قطرها 1 ميكرومتر، ومقاومة لإزالة BABB.

التألق الذاتي والتصوير SLS المستقطب

تم إجراء تصوير الصفائح الضوئية على نظام MacroSPIM، وهو نظام مخصص لتصوير الأعضاء بالكامل تم تطويره في IRB Barcelona^44,45. باختصار، يتم تضمين العينات في كتلة agarose، ويتم مسحها مع العينة وتصويرها داخل ومبومو الكوارتز. استخدم التصوير الفلوري الذاتي أشعة الليزر عند 488 أو 561 أو 638 نانومتر لتوصيل الإضاءة من خلال عدسة أسطوانية مزدوجة لونية مقاس 50 مم (ACY254-050-A، Thorlabs). لتقليل القطع الأثرية الشريطية، يتم محور ورقة الضوء باستخدام الماسح الضوئي الرنان SC-10 (EOPC) على طول تلسكوب 4f مع عدسات مزدوجة لونية مقاس 322288322 مم G100 (QI Optic Photonics). يتم جمع التألق الذاتي للأنسجة من خلال مرشحات الفلورسنت ذات النطاق أو التمرير الطويل ويتم تسجيلها باستخدام كاميرا ORCA Flash v2 (Hamamatsu Photonics). تم إجراء التصوير بمعدل ×9.6 مع تكبير ×8 وعدسة ×2 وعدسة أنبوبية ×0.6. تمت تسوية اللوحة الضوئية عبر مجال الرؤية، مما أدى إلى الحصول على دقة محورية تبلغ 5-6 ميكرومتر. تم إجراء التصوير ثلاثي الأبعاد بخطوات تبلغ 3 ميكرومتر. تم إجراء تصوير المثانة بالكامل في 2.5 × 2 أو 3 × 3 XY البلاط، اعتمادا على حجم الجهاز.

تم تحقيق تصوير sLS عن طريق إزالة مرشح التألق أو استخدام أي مرشح ينقل الليزر. أدى تدوير الصفائح الضوئية إلى تقليل ضوضاء بقع الليزر، مما أدى إلى متوسط ​​زمني لتماسك الليزر كما هو موضح سابقًا⁵². تم التحكم في اتجاه استقطاب صفائح الضوء الخطية في الإضاءة عن طريق تدوير لوحة نصف موجة (AHWP05M-600، Thorlabs) قبل الماسح الضوئي المحوري. تم اختيار الإشارة المكتشفة في الاستقطاب باستخدام مستقطب خطي دوار (LPVISC100، Thorlabs) قبل عجلة التصفية في الكشف، مما أدى إلى فقدان كثافة بنسبة> 50٪ في اكتشاف التألق. بينما يتغير توزيع إشارة sLS بشكل عام مع اتجاه المستقطب، تظل إشارة التألق الذاتي للأنسجة غير متأثرة بدوران المستقطب. ينتج عن sLS دقة مكانية تبلغ 2.4   ±   0.3   ميكرومتر في BABB، وهو ما يشبه الدقة في تصوير صفائح الضوء الفلوري (تم تأكيد ذلك عن طريق تركيب وظيفة غاوسية على XY استجابة الصورة لجسيم واحد، الشكل التكميلي 2. 8 لتر – م) وقريبة من الدقة النظرية في الهواء (1.53 ميكرومتر مع فتحة رقمية (NA)   =  0.2 عند أقصى تكبير كلي × 8).

معالجة الصور والتحليل ثلاثي الأبعاد

تمت معالجة الصور وتقسيمها وتحليل مجموعات بيانات الصفائح الضوئية باستخدام ImageJ/Fiji، في حين تم استخدام Figs. 3 و 4 تم إنشاؤها باستخدام Imaris Viewer 9.9 (https://imaris.oxinst.com/imaris-viewer) والفيديو التكميلي 3 تم إنشاؤه باستخدام Imaris 9 (https://imaris.oxinst.com/) (بيتبلان، أكسفورد إنسترومنتس). تمت خياطة مجموعات بيانات الصفائح الخفيفة المبلطة باستخدام MosaicExplorerJ⁵³. تم إجراء تجزئة ثلاثية الأبعاد لأنسجة المثانة باستخدام وحدات ماكرو ImageJ/Fiji المخصصة للتعليقات التوضيحية ثلاثية الأبعاد شبه الآلية لأحجام كبيرة في الوضع الافتراضي. باختصار، يقوم البرنامج النصي الأول، "Macro3"، بتحميل مجموعات صور ثلاثية الأبعاد، ويمكّن المستخدم من التعليق التوضيحي لعائدات الاستثمار في عدة مستويات، ويقوم تلقائيًا باستيفاء عائد الاستثمار لإنشاء أقنعة ثلاثية الأبعاد وتصديرها. تم رسم عائد الاستثمار كل 3 طائرة (كل 1 ميكرومتر) لتسهيل استمرارية التجزئة الجيدة مع الحفاظ على التعليقات التوضيحية عند الحد الأدنى المعقول. يقوم البرنامج النصي الثاني، "Macro3"، بتنفيذ العمليات الرياضية أو المنطقية، مستوى تلو الآخر دون تحميل الأكوام بأكملها في الذاكرة، إما بين أقنعة ثلاثية الأبعاد أو بين قناع ثلاثي الأبعاد والبيانات الأصلية، مما يؤدي إلى حفظ النتيجة كمكدس جديد. تم إنشاء جميع الأقنعة من خلال التعليق على صور التألق الذاتي.

كل من طبقات سطح الورم والأنسجة السليمة (الشكل 1). 3) تم تحديدها باستخدام أدوات العصا واللاسو الخاصة بفيجي على تجويف المثانة في قناع. باستدعاء هذا التكرار الأول BC1، فإن عمليات التشغيل اللاحقة لـ Macro1 تقوم تلقائيًا بتوسيع هذا الكفاف ثلاثي الأبعاد بمقدار بكسل محدد لإنتاج تكرارات قناع جديدة، BC3، BC2 وما إلى ذلك، مع توسعات متزايدة. يتم الحصول على الطبقة الأولى التي تحتوي على كل من الورم والأنسجة السليمة، القناع L3، عن طريق طرح القناع BC1 من BC1 وهكذا، مما ينتج عنه L2 وL2 كطبقات متحدة المركز. تم الحصول على حجم الورم الأقرب إلى التجويف من خلال شرح الورم باستخدام أدوات العصا واللاسو لإنشاء قناع T3، بينما تم اكتشاف طبقة الإحليل الصحي ثلاثية الأبعاد بشكل منفصل في القناع U1. يؤدي طرح U3 من L1 إلى الحصول على الطبقة السطحية للورم، وهكذا: L1 − U1، L2 − U1. على العكس من ذلك، يتم الحصول على الطبقة الأولى من الظهارة البولية عن طريق طرح T3 من L1. جميع الطبقات في الشكل 3 تم تعريفها بسمك 33 ميكرون.

تم استخدام نفس مجموعة وحدات الماكرو والإجراءات (أداة عصا ImageJ، والتآكل الرقمي بمقدار 500 ميكرومتر وما إلى ذلك) لتحديد وتقسيم الجزء الداخلي من أنسجة المثانة ثم تقدير حجم الأنسجة الداخلية للمثانة (الشكل XNUMX أ). 4، انظر أعلاه للحصول على التفاصيل). تم إنشاء رسوم بيانية لكثافة الإشارة المتناثرة في فيجي من خلال الجمع بين الإشارة المبعثرة والقناع.

استخدام RNT ¹³¹الروبوتات النانوية

بين الأيام 8 و15 بعد زرع الورم، تم تقسيم الحيوانات إلى ست مجموعات (المجموعات 1-6)، في محاولة لتحقيق متوسط ​​أحجام الورم مماثلة عبر المجموعات (الجدول 2). بالنسبة للتجارب، تم تحريض الحيوانات بالتخدير (5٪ إيسوفلوران في O النقي₂) ووضعه على ظهره قبل إفراغ المثانة عن طريق تدليك منطقة البطن. بعد ذلك مباشرة، 100 ميكرولتر من العلاج المناسب بتركيز 400 ميكروجرام مل.^-1 (الطاولة 2) تم غرسها في المثانة باستخدام قسطرة قياس 24. بقي العلاج والمركبة (الماء أو اليوريا) في المثانة لمدة ساعة واحدة قبل إزالة القسطرة. تم إفراغ المثانة مرة أخرى عن طريق تدليك البطن وتم تعافي الفئران من التخدير في أقفاصها، واستبدال نشارة الخشب في قفص الحيوانات على مدار 1 ساعة بعد العلاج لإزالة التلوث الإشعاعي.

الفعالية العلاجية يحددها التصوير بالرنين المغناطيسي

تم إجراء دراستين بالتصوير بالرنين المغناطيسي على كل فأر: (1) بين الأيام 7 و14 بعد تلقيح الورم لتوزيع الحيوانات بشكل عشوائي بين المجموعات وقياس أحجام الورم الأولية (المعالجة المسبقة)؛ (2) بين الأيام 16 و 21 بعد تلقيح الورم (بعد العلاج) لتقييم الفعالية العلاجية. تم إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي باستخدام الماسحات الضوئية 7 T Bruker BioSpec و11.7T Bruker BioSpec (كلاهما مع برنامج ParaVision 7)، حسب التوافر. هذا لم يؤثر على النتائج لأن المجال الخارجي ليس بالغ الأهمية للتصوير التشريحي¹⁴. أجريت تجارب التصوير باستخدام نفس معلمات التصوير والمعالجة كما هو موضح أعلاه (تتبع حجم الورم). في حالة الماسح الضوئي 11.7 T، يتكون الإعداد من ملف سطح قلب الفأر للاستقبال وملف حجمي للإرسال. تم تحديد أحجام الورم في كل شريحة من الأحجام المرسومة يدويًا والتي تغطي منطقة الورم.

تحليل احصائي

في دراسات تصوير PET، النسب المئوية للجرعة المحقونة (% ID) والجرعة المحقونة لكل حجم الورم (% ID cm^-3) تمت مقارنتها باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه. تم تحديد الاختلافات بين المجموعات باستخدام اختبار مقارنات توكي المتعددة. تم الحصول على NTV في قسم RNT من أ t-اختبار القيم المفردة. وكان من المفترض أن يكون توزيع البيانات طبيعيا، ولكن لم يتم اختبار ذلك رسميا. تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام GraphPad Prism v.8.

ملخص التقارير

مزيد من المعلومات حول تصميم البحوث متاح في ملخص تقارير حافظة الطبيعة مرتبطة بهذه المادة.

• محتوى مدعوم من تحسين محركات البحث وتوزيع العلاقات العامة. تضخيم اليوم.
• PlatoData.Network Vertical Generative Ai. تمكين نفسك. الوصول هنا.
• أفلاطونايستريم. ذكاء Web3. تضخيم المعرفة. الوصول هنا.
• أفلاطون كربون، كلينتك ، الطاقة، بيئة، شمسي، إدارة المخلفات. الوصول هنا.
• أفلاطون هيلث. التكنولوجيا الحيوية وذكاء التجارب السريرية. الوصول هنا.
• المصدر https://www.nature.com/articles/s41565-023-01577-y