المواد

تم شراء TLR7 / 8 agonist 1 ثنائي هيدروكلوريد من Cayman Chemical. تم الحصول على 1,2،12-Epoxydodecane (C200) من Sigma-Aldrich. تم تخصيص Core 16 من Enamine ، وتم شراء نوى بوليامين أخرى من Sigma-Aldrich و TCI. كان الجسم المضاد CD32 / 11 المضاد للفأر ، والجسم المضاد CD80c المضاد للفأر APC ، والجسم المضاد FITC المضاد للفأر CD86 ، والجسم المضاد CD11 المضاد للفأر PE ، والجسم المضاد CD80c المضاد للإنسان APC ، والجسم المضاد CD86 المضاد للإنسان FITC ، والجسم المضاد CD1 المضاد للإنسان PE. تم شراؤها من Biolegend. فأر IL-12β ELISA غير مصقول ، فأر IL-70p1 غير مصقول ELISA ، فأر ELISA غير مصقول TNF-α ، فأر MCP-1 ELISA غير مصقول ، ELISA غير مصقول IL-12β بشري ، EL-70p10 بشري غير مصقول ELISA ، TNF-α غير مصقول ELISA ، LysoTracker تم شراء Deep Red و LysoTracker Green و DiO و DiR من Invitrogen. تم الحصول على هابتوغلوبين الماوس ELISA والماوس IP-1,2 ELISA من Abcam. XNUMX،XNUMX-ديوليويل-sn-جليسيرو -3 فوسفويثانولامين ، 1,2،XNUMX-ديستييرويل-snتم الحصول على - الجلسرو 3 - الفوسفوكولين ، DMG-PEG والكوليسترول من Avanti Polar Lipids. تم شراء DLin-MC3-DMA و SM-102 من MedChem Express. تم إنتاج luciferase mRNA المُحسَّن من قِبل كودون m1ψ و SARS-CoV-2 diproline-spike (S2P) mRNA عن طريق النسخ في المختبر¹⁴. تم إنتاج luciferase mRNA الموسوم Cy5 في المنزل من خلال دمج Cy5-UTP (TriLink) في تفاعل النسخ في المختبر.

تخليق المادة الدهنية المساعدة

تم تصنيع المادة الدهنية المساعدة C12-TLRa عن طريق تفاعل epoxydodecane (C12) مع ناهض TLR7 / 8 1 ثنائي هيدروكلوريد باستخدام تفاعل فتح الحلقة²⁵. باختصار ، تم إذابة 10 مجم من TLR7 / 8 ناهض 1 ثنائي هيدروكلوريد في 0.8 مل من الإيثانول في قنينة زجاجية بقضيب تحريك مغناطيسي. بعد ذلك ، تمت إضافة 8 ميكرولتر من ثلاثي إيثيل أمين لتحييد الهيدروكلوريد قبل إضافة 20 مجم من C12. تم غلق القارورة ، وتم تقليب الخليط لمدة 48 ساعة عند 80 درجة مئوية. تمت تنقية المنتج الخام بواسطة نظام كومبي فلاش NextGen 300+ اللوني (Teledyne ISCO) مع شطف متدرج من CH₂Cl₂ إلى 75:22: 3 CH₂Cl₂/ MeOH / NH₄أوه (aq.). تم جمع الجزء المطلوب (المحصول ، 44٪). تميزت C12-TLRa بقياس الطيف الكتلي (MS محسوب ، 728.12 ؛ تم العثور عليه [M + 2H]²⁺، 365.25) ومطياف الرنين المغناطيسي النووي. ¹H NMR (400 ميجا هرتز ، DMSO-d₆) δ (جزء في المليون): 7.78 (د ، J = 8.3 هرتز ، 1H) ، 7.57 (مضاعفة المضاعفات ، J = 8.4 ، 1.3 هرتز ، 1H) ، 7.35-7.29 (م ، ساعة واحدة) ، 1 (يوم ، J = 7.9 هرتز ، 2H) ، 7.05-7.00 (م ، ساعة واحدة) ، 1 (يوم ، J = 8.0 هرتز ، 2H) ، 5.84 (ثانية ، 2H) ، 3.61 - 3.47 (م ، 2H) ، 3.44 (ثانية ، 2H) ، 2.90 (طن ، J = 7.7 هرتز ، 2H) ، 2.68 (ف ، J = 1.9 هرتز ، 2H) ، 2.34 (طن ، J = 2.8 هرتز ، 2H) ، 1.69 (خماسي ، J = 7.6 هرتز ، 2H) ، 1.37 (مضاعفة من ثلاثة توائم ، J = 14.9 ، 7.5 هرتز ، 2 هرتز) ، 1.22 (ثانية ، 36 ارتفاع) ، 0.90 - 0.81 (م ، 9 ساعات).

الطريقة العامة لتركيب الدهون المشتقة من البوليامين

تم تفاعل نوى البوليامين مع المولات الزائدة من C12 حسب الحاجة لتشبع الأمينات^25,33. بأخذ C12-113 كمثال ، تم خلط 113 نواة (1 equiv.) مع C12 (4.8 ما يعادله) لمدة 48 ساعة عند 80 درجة مئوية في حالة جيدة. تم استخدام المنتج الخام للفحص الأولي للمكتبة. لتنقية الدهون الأعلى أداءً C12-113 ، تم فصل المنتج الخام كما هو موصوف أعلاه ، وتم جمع المنتج المشبع بالكامل وتحديده بواسطة قياس الطيف الكتلي (MS المحسوب ، 854.49 ؛ تم العثور على [M + 2H]²⁺، 429.13) واستخدمت للتجارب اللاحقة.

المحاكاة الهيكلية لتفاعل ناهض - TLR7

تم تحسين هياكل TLR7 / 8 agonist 1 و C12-TLRa لأول مرة عن طريق محاكاة الديناميات الجزيئية باستخدام مجال القوة CHARMm⁴⁵. تم اشتقاق التركيب البلوري لبروتين TLR7 الدقيق من هيكل مجمع TLR7 / R848 (معرف PDB ، 5 جم) ، وإزالة أي روابط أو جزيئات مذيبة²⁶. تم إجراء المحاكاة الهيكلية بين TLR7 dimer و agonists بواسطة محاكاة CDocker لرسو السفن⁴⁶ والتراكب الهيكلي في الموقع. تم إنشاء تفاعلات محتملة غير تساهمية وجيوب ملزمة ولمحات عامة عن مواقع الربط بين TLR7 dimer والمنبهات المقابلة باستخدام BIOVIA Discovery Studio 2018.

صياغة LNP

تمت صياغة LNPs عن طريق خلط ميكروفلويديك³⁰. باختصار ، مرحلة إيثانول تحتوي على دهون (مع أو بدون استبدال C12-TLRa) ، فسفوليبيد ، كولسترول و DMG-PEG بنسبة مولارية معينة (الجدول التكميلي XNUMX) 1) مع طور مائي (10 ملي محلول سيترات ، درجة الحموضة 3) تحتوي على مرنا بمعدل تدفق 1: 3 وبنسبة وزن ليبيدويد / رنا 10: 1 في جهاز رقاقة موائع جزيئية. تم غسيل LNPs مقابل 1 × PBS في شريط قطع بوزن جزيئي 20 كيلو دالتون لمدة ساعتين ، وتعقيمها من خلال مرشح 2 ميكرومتر وتخزينها عند 0.22 درجات مئوية. تم الحصول على LNPs المسمى DiO أو DIR عن طريق خلط DiO أو DiR (4 مول ٪ من إجمالي الدهون) مع LNPs قبل غسيل الكلى.

توصيف LNP

تم قياس الحجم الهيدروديناميكي و PDI وإمكانات زيتا لـ LNPs باستخدام Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Instruments). تميزت مورفولوجيا LNPs بـ TEM (JEOL 1010) و cryo-EM (Titan Krios ، Thermo Fisher) مع K3 Bioquantum (Gatan). كفاءة تغليف mRNA و pK_a من LNPs باستخدام مقايسة Quant-iT RiboGreen RNA المعدلة (Invitrogen) و 6- (p-toluidinyl) النفتالين- 2- مقايسة حمض السلفونيك ، على التوالي^30,33. تم فحص تركيبات LNP بشكل روتيني عن طريق اختبار Limulus amebocyte lysate (LAL) ، وتم العثور على مستويات الذيفان الداخلي باستمرار لتكون <1 وحدة سم داخلي لكل مل.

ثقافة الخلية والدراسات الحيوانية

تم توفير خط الخلية HEK-Blue mTLR7 من قبل J. Shi في كلية الطب بجامعة هارفارد ، الذي حصل عليه من InvivoGen (# hkb-mtlr7). تمت صيانة هذه الخلايا وفقًا لتعليمات البائع. تم الحصول على خط خلايا Murine macrophage DC2.4 من American Type Culture Collection وتم الحفاظ عليه في وسط Dulbecco المعدل النسر (DMEM) مع 10 ٪ من مصل بقري جنيني ، 100 U مل^-1 بنسلين و 100 ميكروجرام مل^-1 الستربتومايسين. تمت زراعة جميع الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بنسبة 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون₂، واختبارها بشكل روتيني لتلوث الميكوبلازما.

تم إنشاء BMDCs من C57BL / 6 الفئران. باختصار ، تم مسح خلايا نخاع العظام من عظام الفخذ والظنبوب ، وتم تحللها بواسطة محلول الأمونيوم - كلوريد - البوتاسيوم (ACK) لإزالة خلايا الدم الحمراء ثم زرعها في وسط RPMI 1640 مع 10 ٪ من مصل بقري جنيني ، 100 وحدة مل.^-1 بنسلين و 100 ميكروجرام مل^-1 الستربتومايسين ، 1٪ هيبس ، 0.1 ملي β-مركابتوإيثانول ، 20 نانوغرام مل^-1 مورين IL-4 (رقم 214-14 ، PeproTech) و 20 نانوغرام مل^-1 عامل تحفيز مستعمرة الفئران المحببة والبلاعم (# 315-03 ، PeproTech). في اليوم السادس ، تم جمع الخلايا غير الملتصقة وغير الملتصقة للدراسات.

تم إنشاء MoDCs من متبرع متطوع سليم يبلغ من العمر 38 عامًا. تم عزل الخلايا الأحادية من دم فصادة الدم المتبرع به باستخدام كوكتيل RosetteSep Human Monocyte Enrichment Cocktail (# 15068 ، Stemcell Technologies) ، وتم توفيره بواسطة مركز المناعة البشرية في جامعة بنسلفانيا. تم تحفيز هذه الخلايا في MoDCs عن طريق الزراعة في وسط RPMI الكامل مع 20 نانوغرام مل^-1 IL-4 البشري (# 574002 ، Biolegend) و 20 نانوغرام مل^-1 عامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة - البلاعم البشرية (# 572902 ، Biolegend) لمدة 6 أيام. تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة بنسلفانيا (# 705906). تم الحصول على الموافقة المسبقة من المتبرع الذي تم تعويضه عن هذا التبرع بالدم.

تمت الموافقة على جميع بروتوكولات الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية بجامعة بنسلفانيا (# 806540) ، وتم تنفيذ الإجراءات الخاصة بالحيوانات وفقًا لإرشادات رعاية واستخدام حيوانات المختبر في جامعة بنسلفانيا. تم شراء C57BL / 6 إناث الفئران (6-8 أسابيع ، 18-20 جم من وزن الجسم) من مختبر جاكسون.

التسليم في المختبر mLuc

تم زرع خلايا DC أو BMDCs أو MoDCs على صفيحة 96 بئر بكثافة 10,000 لكل بئر طوال الليل ، ثم تم استخدام LNPs المحملة بالـ mLuc لعلاج الخلايا بالجرعات المحددة لمدة 24 ساعة. تم تقييم تعبير Luciferase بواسطة Luciferase Reporter 1000 Assay System (E4550 ، Promega) ، وتم قياس صلاحية الخلية باستخدام اختبار CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (G7572 ، Promega) وفقًا لبروتوكولات الشركة المصنعة. تم الإبلاغ عن تعبير luciferase النسبي كوحدات ضوئية نسبية تم تطبيعها لصلاحية الخلية. تم استخدام mRNA المجاني كعنصر تحكم.

فحص مراسل TLR7

تم اختبار نشاط TLR7-agonistic لـ C12-TLRa على خلايا مراسل HEK-Blue mTLR7 باستخدام HEK-Blue Detection Kit (# hb-det2 ، InvivoGen) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. باختصار ، تم زرع خلايا مراسل HEK-Blue mTLR7 في لوحة 96 بئر بكثافة 40,000 خلية لكل بئر في وسط اكتشاف HEK-Blue يحتوي على تركيزات مختلفة من C12-TLRa. بعد الحضانة لمدة 24 ساعة ، تم قياس الامتصاصية عند 650 نانومتر باستخدام قارئ لوحة (Infinite M200 ، Tecan) وتم تطبيع البيانات للخلايا غير المعالجة. تم استخدام ناهض TLR7 / 8 1 كعنصر تحكم إيجابي. وبالمثل ، تم قياس نشاط TLR7-agonistic لـ LNPs.

امتصاص الخلوية

تم زرع خلايا DC2.4 في أطباق ذات قاع زجاجي 35 مم لمدة 24 ساعة ثم تمت معالجتها باستخدام C12-113 LNP المسمى DiO أو C12-113 / TLRa LNP المسمى DiO بتركيز مرنا قدره 500 نانوغرام مل^-1 لمدة 2 ساعة. كانت الخلايا ملطخة بالتتابع باستخدام LysoTracker Deep Red (100 نانومتر) لمدة 30 دقيقة و Hoechst 33342 (10 ميكروغرام مل).^-1) لمدة 5 دقائق. تم التقاط الصور على الفور باستخدام مجهر مسح ليزر متحد البؤر (LSM 710 ، زايس).

تحليل نضوج التيار المستمر وإنتاج السيتوكين في المختبر

تم زرع خلايا DC2.4 أو BMDCs في لوحة ذات 12 بئراً بكثافة 1 × 10⁶ الخلايا لكل بئر طوال الليل ثم تعامل مع LNPs المحملة بـ SARS-CoV-2 mRNA (500 نانوغرام مل^-1) لمدة 24 ساعة. تم جمع الثقافات الخلوية لـ ELISA لـ TNF-α و IL-12p70 و IL-1β. تم جمع الخلايا وحظرها باستخدام الجسم المضاد CD16 / 32 المضاد للفأر ثم تلطيخها بجسم مضاد CD11c مضاد للفأر APC ، والجسم المضاد CD80 المضاد للفأر FITC والجسم المضاد CD86 المضاد للفأر PE لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية قبل تحليلها بواسطة قياس التدفق الخلوي (BD ، LSR II). وبالمثل ، تم التعامل مع MoDCs. تم جمع الثقافات الخلوية لـ ELISA لـ TNF-α و IL-12p70 و IL-1β. تم جمع MoDCs وتلطيخها باستخدام الأجسام المضادة CD11c المضادة للإنسان APC ، والأجسام المضادة CD80 المضادة للإنسان FITC والجسم المضاد CD86 المضاد للإنسان PE قبل التحليل. تم استخدام الأجسام المضادة وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة مع تخفيف نموذجي عند 1: 100.

تحليل نضوج التيار المستمر وإنتاج السيتوكين في الجسم الحي

تم حصاد اثنين من iLNs من كل فأر في 24 ساعة بعد الحقن من LNPs المحملة بـ SARS-CoV-2 mRNA (5 ميكروغرام من الرنا المرسال لكل فأر) عند قاعدة الذيل وتم تعطيلها ميكانيكيًا باستخدام مدقات معقمة في 0.1 مل من وسط RPMI الكامل في أنبوب 1.5 مل. تم جمع المعلقات الخلوية الناتجة ، وحظرها باستخدام الجسم المضاد CD16 / 32 المضاد للفأر ثم تلطيخها بجسم مضاد CD11c مضاد للفأر APC ، والجسم المضاد FITC المضاد للفأر-CD80 والجسم المضاد CD86 المضاد للفأر PE قبل تحليله بواسطة قياس التدفق الخلوي.

تم جمع الدم في أنابيب فاصل المصل (BD # 365967) من خلال المسار المداري الرجعي في 6 و 24 ساعة بعد التحصين. تم فصل المصل عن الدم بعد فترة حضانة مدتها 30 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة (RT) ، وتم طرد العينات عند 10,000g لمدة 5 دقائق. تم تخزين المصل عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. لتحليل إنتاج السيتوكينات داخل الوعاء اللمفاوي ، تم وضع المعلقات الخلوية الناتجة من iLNs على لوحة 96 بئر بكثافة 10,000 خلية لكل 100 ميكرولتر لكل بئر وتم تربيتها لمدة 8 ساعات. تم جمع المادة الطافية لـ ELISA لـ TNF-α و IL-12p70 و IL-1β مع عينات المصل. بالإضافة إلى ذلك ، تم جمع مصل الدم عند 6 و 24 و 48 ساعة بعد التحصين من أجل ELISA للهابتوغلوبين و IP-10 و MCP-1.

توزيع وترنسفكأيشن من LNPs في الجسم الحي

تم حقن الفئران في قاعدة الذيل باستخدام LNPs المحملة بميلوك بجرعة 5 ميكروغرام من الرنا المرسال لكل فأر. في 6 أو 24 ساعة بعد الحقن ، تم حقن الفئران داخل الصفاق (IP) d- لوسيفيرين ملح البوتاسيوم (150 مجم لكل كيلوجرام (وزن الجسم)) ، وتم إجراء تصوير التلألؤ البيولوجي على نظام التصوير IVIS (PerkinElmer). لتمكين التلألؤ الحيوي المتزامن والتصوير الفلوري ، تم حقن LNPs المسمى بـ DiR ، والمحملة بـ mLuc في الفئران. في 24 ساعة بعد الحقن ، تم حقن الفئران بـ IP d-لوسيفيرين ملح البوتاسيوم والأعضاء الرئيسية و iLNs تم جمعها من أجل التلألؤ الحيوي والتصوير الفلوري.

التحصين في الجسم الحي

تم تحصين الفئران باستخدام LNPs المحملة بـ SARS-CoV-2 mRNA بجرعة 1 أو 5 ميكروغرام من الرنا المرسال لكل فأر مرتين باستخدام إستراتيجية التعزيز الأولي في فترة 3 أسابيع. تم تسجيل وزن الجسم مرتين في الأسبوع أثناء التجربة. تم جمع المصل باستخدام أنابيب فاصل المصل كما هو موضح أعلاه ، وتم تخزينه عند درجة حرارة -20 درجة مئوية واستخدامه في اختبار ELISA وتحييد الفيروس. بعد أسبوعين من التطعيم المعزز ، تم تخدير الفئران وجمع الطحال لتحليل قياس التدفق الخلوي.

تحديد عيار الأجسام المضادة لـ RBD باستخدام ELISA

المنقى SARS-CoV-2 له الموسومة RBD (1 ميكروغرام مل^-1) (Sino Biological ، # 40592-V08H) تم استخدامه لتغليف ألواح البوليسترين الدقيقة عالية الربط Stripwell Corning 96 جيدًا طوال الليل. تم غسل الألواح باستخدام محلول غسيل مؤقت (0.05 ٪ توين 20 / PBS) مرة واحدة ، وتم حظرها لمدة ساعتين عند درجة حرارة الغرفة باستخدام محلول من ألبومين المصل البقري المعطل بالحرارة ، المستنفد IgG ، والخالي من الأنزيم البروتيني (2٪ w / v BSA / PBS ). بعد ذلك ، تم غسل الألواح ثلاث مرات ، وتم تخفيف مصل الفأر بشكل متسلسل في محلول الحجب واحتضانها لمدة ساعتين عند درجة حرارة الغرفة ، تم غسل اللوحات ثلاث مرات قبل إضافة جسم مضاد ثانوي مضاد للفأر مترافق مع الفجل الفجل خاص بإجمالي IgG (2: 2) ، Abcam # ab1) أو الفئات الفرعية (IgG10,000، 97040: 1،1، Abcam، # ab10,000؛ IgG98693c، 2،10,000، Abcam، # ab98722) في حظر المخزن المؤقت. تم تحضين الأطباق لمدة 1.5 ساعة وغسلها ثلاث مرات قبل إضافة 100 ميكرولتر من KPL 3,3،5,5 ′ ، 8،50′-tetramethylbenzidine الركيزة لكل بئر لمدة 2 دقائق. تم إيقاف التفاعل بإضافة 450 ميكرولتر من 190 عيار حمض الكبريتيك ، وتم قياس الامتصاصية عند XNUMX نانومتر باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية SpectraMax XNUMX. تم تعريف عيار تخفيف نقطة النهاية IgG الخاص بـ RBD على أنه أعلى تخفيف للمصل لإعطاء كثافة بصرية أكبر من قيمة الكثافة الضوئية المقطوعة المحددة باستخدام طريقة Frey⁴⁷.

مقايسة تحييد الفيروس الكاذب

تم إنتاج النمط الزائف VSV مع SARS-CoV-2 S لأول مرة³⁶. أجرينا اختبار تحييد الأجسام المضادة باستخدام VSVΔG-RFP SARS-CoV-2. تم زرع خلايا Vero E6 التي تعبر بشكل ثابت عن TMPRSS2 في 100 ميكرولتر DMEM عند 2.5 × 10⁴ خلايا لكل بئر في صفيحة مطلية بالكولاجين 96 بئر. بعد 12 ساعة ، تم خلط عينات المصل المخففة تسلسليًا ذات شقين مع فيروس النمط الكاذب VSVΔG-RFP SARS-CoV-2 (50-200 وحدة تشكيل بؤرة لكل بئر) لترميز ارتفاع D614G أو متغير بيتا أو دلتا واحتضانها لمدة ساعة واحدة عند 1 درجة مئوية. تم أيضًا تضمين الماوس المضاد لـ VSV Indiana G ، 37G8F5 (# Ab11-01401 ، الجسم المضاد المطلق) ، في هذا الخليط لتحييد أي فيروس مرحل VSV-G محتمل بتركيز 2.0 نانوغرام مل^-1. تم بعد ذلك استخدام خليط الجسم المضاد والفيروس لاستبدال الوسائط على خلايا Vero E6 TMPRSS2. في 20 ساعة بعد الإصابة ، تم غسل الخلايا وتثبيتها بنسبة 4 ٪ من PFA قبل التصور على محلل S6 FluoroSpot (CTL). تم تعداد البؤر المصابة الفردية وقورنت القيم مع آبار التحكم بدون جسم مضاد. عيار معادلة تقليل التركيز البؤري 50٪ (FRNT₅₀) على أنه أكبر تخفيف مصل تم فيه تقليل عدد البؤرة بنسبة 50٪ على الأقل بالنسبة لخلايا التحكم المصابة بفيروس النمط الكاذب في غياب مصل الفأر. FRNT₅₀ تم قياس العيارات لكل عينة في نسختين تقنيتين تم إجراؤهما في أيام منفصلة.

تحليل التدفق الخلوي للخلايا T و B.

الخلية تي

تم جمع الطحال ، ومعالجتها كخلايا مفردة ، وتصفيتها باستخدام مصفاة خلية 70 ميكرومتر في RPMI كاملة 1640 وطردها من المركز ، وخلايا الدم الحمراء في محلول تحلل ACK للحصول على تعليق خلية واحدة واضحة. لقياس الخلايا التائية الخاصة بالمستضد ، تم تحفيز مليوني خلية طحالية باستخدام 2.5 ميكروغرام مل^-1 من مجمعات الببتيد SARS-CoV-2 RBD (# PM-WCPV-S-RBD-1 ، JPT) في أنبوب FACS لمدة 6 ساعات عند 37 درجة مئوية ، 5٪ من ثاني أكسيد الكربون₂ مع 2 مجم مل^-1 anti-CD28 (Tonbo # 40-0281-M001) يوفر تحفيزًا مشتركًا. استمرت التحفيز لمدة ساعة واحدة قبل إضافة 1 مجم مل^-1 brefeldin A (Biolegend # 420601) ، 2 ملي مونينسين (Biolegend # 420701) و 5 مجم مل^-1 مضاد لـ CD107a Alexa Fluor 647 (Biolegend # 121610) لمدة 5 ساعات. خدم DMSO كعنصر تحكم سلبي ، ومزيج من 50 مجم مل^-1 phorbol 12-myristate 13-acetate و 1 mg ml^-1 خدم الأيونوميسين كعنصر تحكم إيجابي. بعد ما مجموعه 6 ساعات ، تم غسل العينات باستخدام PBS ، وملطخة بـ Live / Dead Aqua لمدة 5 دقائق ، وتم حظرها باستخدام جسم مضاد CD16 / 32 المضاد للفأر لمدة 20 دقيقة وملطخة خارج الخلية لمدة 30 دقيقة باستخدام الأجسام المضادة (الأشكال التكميلية. 21d و 27d). تم غسل الخلايا في محلول FACS ، وتم إصلاحه ونفاذه باستخدام مجموعة Cytofix / Cytoperm (BD Biosciences # 554714) ، وتم تلوينها داخل الخلايا باستخدام الأجسام المضادة لمدة 30 دقيقة (الأشكال التكميلية. 21d و 27d). بعد تلطيخ الخلايا ، تم غسل الخلايا مرتين وتثبيتها بـ 300 ميكرولتر (1 ٪ PFA) ، وتم الحصول على العينات على BD LSR II المجهزة بأربعة خطوط ليزر و 18 أنبوبًا مضخمًا ضوئيًا. يتم توفير إستراتيجية البوابة وقائمة الأجسام المضادة وأرقام الكتالوج في الأشكال التكميلية. 21 و 27.

خلية الذاكرة ب

تم جمع الطحال ومعالجتها كخلايا مفردة ، وتصفيتها باستخدام مصفاة خلية 40 ميكرومتر في RPMI كاملة 1640 وطردها عند 300g لمدة 5 دقائق تم تحليل خلايا الدم الحمراء باستخدام ACK (دقيقة واحدة) ، وغسلها مرتين وعدها ، وتم تحضين مليوني خلية لكل عينة بجسم مضاد CD1 / 16 المضاد للفأر لمدة 32 دقيقة عند 20 درجات مئوية. تم بعد ذلك غسل الخلايا بمخزن FACS (4 ٪ BSA / PBS) وملطخة لمدة ساعة واحدة باستخدام الأجسام المضادة (الشكل التكميلي S1). 23d). بعد التلوين ، تم غسل الخلايا مرتين وتثبيتها بـ 300 ميكرولتر (1 ٪ PFA) ، وتم الحصول على العينات على BD LSR II المجهزة بأربعة خطوط ليزر و 18 أنبوبًا ضوئيًا. استراتيجية البوابة ، وقائمة الأجسام المضادة ، تحقيقات الفلورسنت RBD¹⁴ وترد أرقام الكتالوج في الشكل التكميلي. 23.

فحص ELISpot

تم مسح نخاع العظم من عظم الفخذ والساق إلى المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية وتم تصفيته من خلال شبكة Nitex مقاس 63 ميكرومتر. تم تحليل خلايا الدم الحمراء في محلول ACK لمدة 5 دقائق على الجليد ، وغسلها مرتين باستخدام محلول FACS. تم حساب الخلايا الناتجة باستخدام Beckman Coulter ViCell. تم طلاء لوحات مرشح HTS IP ، 0.45 ميكرومتر (Millipore Sigma ، MSIPS4W10) ، بمستضد بروتين RBD عند 10 ميكروغرام مل^-1 في المخزن المؤقت لبيكربونات الصوديوم ، الأس الهيدروجيني 9.6 (35 ملي مولار NaHCO₃ و 15 ملي مولار Na₂CO₃) لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. تم بعد ذلك غسل الألواح بـ 200 ميكرولتر من PBS لكل بئر ثلاث مرات وتم حظرها عند 37 درجة مئوية في RPMI كاملة لمدة 30 دقيقة. تم طلاء خلايا نخاع العظام بستة تخفيفات أنصاف تبدأ بمليون خلية نخاع عظمي كلية لكل بئر وحضنت طوال الليل في RPMI كاملة. تم بعد ذلك غسل الألواح باستخدام محلول غسيل مؤقت (1 × PBS + 0.1 ٪ توين 20) خمس مرات ، وأضيف الجسم المضاد للكشف عن الأجسام المضادة IgG المخصب بيولوجيًا (إعلانات الماعز المضادة للفأر IgG البشرية- BIOT ؛ Southern Biotech ، 1030-08) في نهائي تخفيف 3 ميكروجرام مل^-1 في 2 ٪ BSA / PBS وحضنت في RT لمدة 1 ساعة. تم غسل الألواح مرة أخرى خمس مرات ، وتمت إضافة الستربتافيدين - الفوسفاتيز القلوي (1: 20,000 تخفيف في 2 ٪ BSA / PBS) قبل الحضانة عند درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. تم بعد ذلك غسل الألواح خمس مرات باستخدام محلول غسيل مؤقت ، وتمت إضافة 50 ميكرولتر لكل بئر 5-برومو-4-كلورو -3-إندوليل فوسفات / نيترو بلو محلول كلوريد تترازوليوم (Sigma ، # B1911 ، 100 مل) لمدة 10 دقائق تقريبًا أو حتى تتطور البقع في ذلك الوقت يخمد التفاعل باستخدام 100 ميكرولتر 1 مولار من محلول فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة. بعد شطف الألواح بـ HXNUMX منزوع الأيونات₂O وتجفيفها طوال الليل ، تم مسحها ضوئيًا وعدها باستخدام محلل S6 FluoroSpot.

الإحصاء والتكاثر

يتم تقديم جميع البيانات على أنها تعني ± sd للطالب t- تم تطبيق اختبار أو تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) متبوعًا باختبار Tukey للمقارنة بين مجموعتين أو بين مجموعات متعددة باستخدام Graphpad Prism 7.0 ، على التوالي. P <0.05 اعتبرت ذات دلالة إحصائية. يتم تكرار كل تجربة ثلاث مرات على الأقل بشكل مستقل مع نتائج مماثلة ، ويتم تقديم مجموعة البيانات التمثيلية.

ملخص التقارير

مزيد من المعلومات حول تصميم البحوث متاح في ملخص تقارير حافظة الطبيعة مرتبطة بهذه المادة.

• محتوى مدعوم من تحسين محركات البحث وتوزيع العلاقات العامة. تضخيم اليوم.
• PlatoData.Network Vertical Generative Ai. تمكين نفسك. الوصول هنا.
• أفلاطونايستريم. ذكاء Web3. تضخيم المعرفة. الوصول هنا.
• أفلاطون السيارات / المركبات الكهربائية ، كربون، كلينتك ، الطاقة، بيئة، شمسي، إدارة المخلفات. الوصول هنا.
• BlockOffsets. تحديث ملكية الأوفست البيئية. الوصول هنا.
• المصدر https://www.nature.com/articles/s41565-023-01404-4