إعداد المواد وتوصيفها

تم تخفيف محلول GO المائي في الماء منزوع الأيونات للحصول على 0.15 ملغم مل.^-1 يتم ترشيح المحلول والفراغ من خلال غشاء النيتروسليلوز بمسام يبلغ حجمها 0.025 ميكرومتر، مما يشكل طبقة رقيقة من GO. تم بعد ذلك نقل الفيلم الرقيق إلى الركيزة المستهدفة باستخدام النقل الرطب في الماء منزوع الأيونات والتليين الحراري الإضافي عند درجة حرارة 100 درجة مئوية لمدة دقيقتين. تم تقليل مكدس الركيزة للفيلم GO بالحرارة المائية عند درجة حرارة 2 درجة مئوية في الأوتوكلاف القياسي لمدة 134 ساعات لتكوين EGNITE. كانت الركيزة الأساسية لجميع دراسات توصيف EGNITE عبارة عن مربع (3 × 1 cm²) من Si/SiO₂ (400 ميكرومتر/1 ميكرومتر).

XPS

تم إجراء قياسات XPS باستخدام محلل Phoibos 150 (SPECS) في ظروف الفراغ العالي جدًا (الضغط الأساسي، 5 × 10^-10 mbar) مع مصدر أشعة سينية أحادي اللون Al Kα (1,486.74 eV). تم الحصول على أطياف نظرة عامة باستخدام طاقة تمرير تبلغ 50 فولتًا وحجم خطوة يبلغ 1 فولتًا، وتم الحصول على أطياف عالية الدقة باستخدام طاقة تمرير تبلغ 20 فولتًا وحجم خطوة يبلغ 0.05 فولتًا. تبلغ الدقة الإجمالية في تلك الظروف الأخيرة 0.58 فولت، كما يتم تحديدها عن طريق قياس العرض الكامل بنصف الحد الأقصى لـ Ag 3d5/2 ذروة من الفضة المتناثرة. يُظهر تحليل XPS انخفاضًا قويًا بعد المعالجة الحرارية المائية لذروة ثاني أكسيد الكربون (المرتبطة بمجموعات الإيبوكسيد)، ولكن مساهمة صغيرة من C-OH وC=O وC(O)OH بسبب الهيدروكسيل والكربونيلات والكربوكسيل التي تبقى بعد التخفيض. تفكك O1s الذروة تؤكد مثل هذا السلوك. المساهمة الرئيسية في C1s ومع ذلك، تأتي الإشارة بعد التخفيض الحراري المائي sp² المدارات C-C المهجنة^34,57.

حيود الأشعة السينية

قياسات حيود الأشعة السينية (θ-2θ المسح الضوئي) تم إجراؤها في مقياس حيود أبحاث المواد (Malvern PANalytical). يحتوي مقياس الحيود هذا على مقياس أفقي ω-2θ مقياس الزوايا (نصف قطره 320 مم) في هندسة رباعية الدوائر ويعمل باستخدام أنبوب الأشعة السينية الخزفي مع أنود Cu Kα (λ = 1.540598 Å). الكاشف المستخدم هو Pixcel وهو كاشف سريع للأشعة السينية يعتمد على تقنية Medipix2.

رامان الطيفي

تم إجراء قياسات التحليل الطيفي لرامان باستخدام مطياف Witec المجهز بخط إثارة ليزر 488 نانومتر. بالنسبة للقياسات، تم الحصول على أطياف رامان باستخدام هدف 50 × و600 أخاديد لكل نانومتر؛ تم الحفاظ على طاقة الليزر أقل من 1.5 ميجاوات لتجنب تسخين العينة.

TEM

تم تحضير صفيحة شعاع أيون مركزة باستخدام Helios NanoLab DualBeam (LMA-INA) لدراسة المقطع العرضي لعينة EGNITE. تم إجراء التحليلات الهيكلية عن طريق TEM باستخدام مجهر Tecnai F20 الذي يعمل بسرعة 200 كيلو فولت، بما في ذلك HRTEM وتقنيات STEM ذات المجال المظلم الحلقي عالي الزاوية. تم إجراء تجربة STEM-EELS في مجهر Tecnai F20 الذي يعمل عند 200 كيلو فولت، مع فتحة مقاس 5 مم، وطول كاميرا 30 مم، وزاوية تقارب تبلغ 12.7 مراد وزاوية تجميع تبلغ 87.6 مراد. نظرًا لأننا استخدمنا 0.5 فولت لكل بكسل و250 فولت كطاقة البداية في اكتساب الخسارة الأساسية، فإننا لم نحصل على حافة Si K المتوقعة عند 1,839 فولت، وحافة Pt M عند 2,122 فولت، وحافة Au M عند 2,206 فولت. تم الحصول على التركيب الذري النسبي لـ C-O من خلال تركيز انتباهنا على طبقة GO المخفضة وافتراض أن الحواف التي تم تحليلها (C و O في حالتنا) تصل إلى 100٪. وهذا الافتراض صحيح في حالتنا كما هو موضح في معلومات تكميلية خرائط. تم حساب المقطع العرضي لفرق الطاقة باستخدام نموذج Hartree-Slater والخلفية باستخدام نموذج الطاقة المنخفضة.

التوصيل الكهربائي

تم إجراء قياسات الموصلية الكهربائية باستخدام مقياس مصدر Keithley 2400 بتكوين من نقطتين. تتكون العينات المقاسة من أفلام EGNITE مقاس 1 × 1 سم² على رأس SiO₂ المادة المتفاعلة.

تحليل البيانات

تم تحليل حيود الأشعة السينية وبيانات رامان وXPS باستخدام حزم Python 3.7 (Numpy، Pandas، Scipy، Xrdtools، Lmfit، Rampy، Peakutils، Matplotlib). تم حساب المسافة بين المستويات من قياسات حيود الأشعة السينية وفقا لقانون سنيل. بمجرد نقل البيانات إلى المجال المكاني، تم تركيب الحد الأقصى للقمم. أعطت المسافة المقابلة قيمة متوسطة للمسافة بين الطائرات. تم حساب الانحرافات عن تلك القيم المتوسطة من العرض الكامل بنصف الحد الأقصى لتركيبات Lorentzian للقمم في المجال المكاني. تم تحليل قياسات التحليل الطيفي XPS ورامان من خلال تركيب مجموعة من القمم على المواقع المتوقعة للميزات المقابلة. تم الحصول على قيم الموصلية لـ GO و EGNITE عن طريق تركيب I-V المنحنيات المقاسة في قياسات التوصيل الكهربائي لقانون أوم. البيانات هي n = 1 لكل قياس.

تصنيع مجموعة مرنة

يظهر تصنيع الأجهزة في الشكل التكميلي. 4. تم تصنيع الأجهزة على Si / SiO مقاس 4 بوصات₂ (400 ميكرومتر/1 ميكرومتر) رقائق. أولاً، تم لف طبقة PI بسمك 10 ميكرومتر (PI-2611، HD MicroSystems) على الرقاقة وتم خبزها في جو غني بالنيتروجين عند درجة حرارة 350 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تم نقش الآثار المعدنية باستخدام الطباعة الحجرية الضوئية لمقاوم الضوء لعكس الصورة (AZ5214، Microchemicals). تم استخدام تبخر شعاع الإلكترون لترسيب 20 نانومتر من التيتانيوم و200 نانومتر من الذهب، وتم إجراء عملية الإقلاع. استخدمنا فيلم EGNITE يبلغ سمكه حوالي 1 ميكرومتر كمفاضلة بين الأداء الكهروكيميائي ومرونة الصفيف. بعد نقل فيلم GO، تم تبخير شعاع الألمنيوم وتم تحديد المناطق الموجودة أعلى الأقطاب الكهربائية الدقيقة المستقبلية باستخدام مقاوم الضوء السلبي (nLOF 2070، Microchemicals) والانطلاق. بعد ذلك، تم حفر فيلم GO في كل مكان باستثناء الأقطاب الكهربائية الدقيقة المستقبلية باستخدام النقش الأيوني التفاعلي للأكسجين (RIE) لمدة 5 دقائق عند 500 واط وتم حفر أعمدة الألومنيوم الواقية بمحلول مخفف من أحماض الفوسفوريك والنيتريك. بعد ذلك، تم ترسيب طبقة PI-3 بسمك 2611 ميكرومتر على الرقاقة وتم خبزها كما هو موضح سابقًا. تم بعد ذلك تحديد فتحات PI-2611 على القطب الكهربائي الدقيق باستخدام مقاوم الضوء السميك الإيجابي (AZ9260، Microchemicals) الذي كان بمثابة قناع للأكسجين RIE اللاحق. لاحقًا، تم تصميم الأجهزة على طبقة PI، مرة أخرى باستخدام مقاوم الضوء AZ9260 وRIE. تمت بعد ذلك إزالة الطبقة المقاومة للضوء في الأسيتون وتنظيف الرقاقة بكحول الأيزوبروبيل وتجفيفها. أخيرًا، تم نزع الأجهزة من الرقاقة وأصبحت جاهزة لوضعها في أكياس تعقيم لتتم معالجتها حرارياً عند درجة حرارة 134 درجة مئوية في جهاز تعقيم قياسي لمدة 3 ساعات.

التوصيف الكهروكيميائي للأقطاب الدقيقة

تم إجراء التوصيف الكهروكيميائي للأقطاب الكهربائية الدقيقة باستخدام جهاز قياس الجهد Metrohm Autolab PGSTAT128N في 1 × PBS (Sigma-Aldrich، P4417) الذي يحتوي على 10 ميكرومتر من الفوسفات العازلة و 137 ميكروليتر من كلوريد الصوديوم و 2.7 ميكروليتر من كلوريد الصوديوم عند درجة الحموضة 7.4 وباستخدام تكوين ثلاثي الأقطاب. تم استخدام قطب Ag / AgCl (FlexRef، WPI) كمرجع وتم استخدام سلك بلاتيني (Alfa Aesar، 45093) كقطب مضاد.

قبل تقييم الأداء، تم نبض الأقطاب الكهربائية بـ 10,000 نبضة متوازنة الشحن (1 مللي ثانية، 15 ميكرو أمبير). تعرض الأقطاب الكهربائية لبروتوكولات النبض المستمر التي تتم بواسطة 100 دورة قياس الجهد الدوري (−0.9 إلى +0.8  V) عند 50 مللي فولت  s^-1، 20 تكرارًا لـ 5,000 نبضة (1 مللي ثانية) وإعادة تحديد إمكانات الدائرة المفتوحة.

تحليل البيانات

تم تحليل بيانات التوصيف الكهروكيميائي باستخدام حزم Python 3.7 (Numpy، Pandas، Scipy، Pyeis، Lmfit، Matplotlib). تم تركيب بيانات التحليل الطيفي للمقاومة على نموذج كهربائي مكافئ يتكون من مقاومة (R) في سلسلة مع عنصر الطور الثابت (CPE). من هناك، تم تقريب قيمة CPE إلى السعة وتقسيمها على المنطقة الهندسية للإلكترودات الدقيقة للحصول على قيمة مكافئة للسعة البينية لـ EGNITE. تم حساب سعة تخزين شحنة الإلكترودات الدقيقة (CSC) من قياسات قياس الجهد الدوري من خلال دمج النظام الكاثودي والأنودي للتيار المقاس والتطبيع بواسطة معدل المسح. تبلغ سعة تخزين الشحنة الكاثودية والأنودية (cCSC وaCSC) بمعدل مسح 100 مللي فولت لـ EGNITE 45.9   ±   2.4 و 34.6   ±   2.8   mC   سم^-2على التوالي (n = 3). كما ورد بالنسبة للمواد الأخرى⁵⁸، تعتمد الخلايا الجذعية السرطانية التي تم الحصول عليها على معدل المسح (الشكل التكميلي 1). 5). لتقييم وجود تفاعلات تقليل الأكسجين، قمنا بقياس شكل موجة السيرة الذاتية تحت المنحل بالكهرباء المطهر بالنيتروجين⁵⁹ ولم يلاحظوا اختلافات كبيرة في الشكل الموجي (الشكل التكميلي 1). 6). ومع ذلك، فإن نتائجنا لا تعالج بشكل كامل تأثير تفاعلات تقليل الأكسجين في قدرة حقن الشحنة في EGNITE ويجب القيام بعمل إضافي للتحقيق في هذا بشكل صحيح. تم إنشاء سعة حقن شحنة الإلكترودات الدقيقة (CIC) من خلال تحديد سعة النبضة الحالية التي أثارت فرق الجهد (بعد إزالة الانخفاض الأومي) الذي يطابق نافذة الماء الكهروكيميائية للإلكترود (−0.9 V للكاثودي و+0.8 V للأنوديك مقابل Ag/AgCl ) (الشكل التكميلي. 17)⁶⁰.

تحليل احصائي

البيانات تعني ±  sd، n = 18 لـ EIS و n = 3 لقياس الجهد الزمني. بيانات خريطة انحراف الجهد السعوي الكاثودي هي متوسط ​​انحراف الجهد السعوي الكاثودي لحدث واحد لكل شكل نبضة n = 3 أقطاب كهربائية.

تقييم الاستقرار الميكانيكي

صوتنة بالموجات فوق الصوتية

تم وضع مصفوفات أقطاب EGNITE داخل كوب مملوء بالماء في حمام مائي بالموجات فوق الصوتية (Elmasonic P 180H). تم تطبيق الصوتنة عند 37 كيلو هرتز لمدة 15 دقيقة عند 200 واط، وتلاها 15 دقيقة إضافية من الصوتنة عند 37 كيلو هرتز مع زيادة الطاقة إلى 300 واط، وتم الحصول على صور الأقطاب الكهربائية قبل وبعد خطوات الصوتنة.

اختبار الانحناء

إعداد الانحناء (الشكل 1). 2k) يتكون من ثلاثة قضبان أسطوانية؛ تم إنزال الجزء الأوسط (قطره 700 ميكرومتر) للأسفل، مما أدى إلى زوايا انحناء قدرها 131 درجة. تم استخدام ثلاث صفائف ميكروليكترود مرنة لاختبار الانحناء. تحتوي كل مجموعة على 18 قطبًا كهربائيًا دقيقًا يبلغ قطرها 50 ميكرومترًا. تم قياس مصفوفتين بعد 10 و 20 دورة بينما تم قياس جهاز واحد لمدة 10 دورات فقط حيث تعرض للتلف أثناء المناولة بعد القياس. تتكون دورة اختبار الانحناء من تطبيق حمل مدته 10 ثوانٍ بالإضافة إلى 10 ثوانٍ بدون تحميل. تم تشخيص الأجهزة كهروكيميائياً (EIS وCV) قبل وبعد 10 و20 دورة ثني.

التسجيل العصبي القشري

زرع القشرة

تم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية وفقًا لتوصيات مجلس الجماعة الأوروبية والتشريعات الفرنسية لرعاية واستخدام حيوانات المختبر. تمت الموافقة على البروتوكولات من قبل اللجنة الأخلاقية في غرونوبل (ComEth) وأذنت بها الوزارة الفرنسية (رقم 04815.02). فئران سبراغ داولي (ذكر، عمره 4 أشهر، وزنه XNUMX لتر). ~تم تخدير (600 ميكروجرام) عضليًا باستخدام الكيتامين (50 ميكروجرام لكل كجم (وزن الجسم)) وزيلازين (10 ميكروجرام لكل كجم (وزن الجسم))، ثم تم تثبيته على حامل التجسيمي. كشفت إزالة الجمجمة الزمنية القشرة السمعية. تم الحفاظ على الأم الجافية لتجنب إتلاف الأنسجة القشرية. تم حفر ثقب في قمة الرأس لإدخال القطب المرجعي، وتم حفر ثقب ثانٍ، بقطر 7 مم باتجاه الأمام من الأول، لإدخال القطب الكهربائي الأرضي. كانت الأقطاب الكهربائية عبارة عن دبابيس بسمك 0.5 مم تستخدم لمآخذ الدوائر المتكاملة. تم وضعها لإجراء اتصال كهربائي مع الأم الجافية وتثبيتها على الجمجمة باستخدام أسمنت الأسنان. قمنا بعد ذلك بتركيب شريط الإلكترودات الدقيقة السطحية على القشرة السمعية كما هو موضح في الشكل XNUMX. 3b. تحدد أنماط الأوردة القشرة السمعية، في المنطقة 41 من خريطة دماغ كريج للفئران. تم تضخيم الإشارات القشرية في وقت واحد بكسب قدره 1,000 ورقمنتها بمعدل أخذ عينات قدره 33 كيلو هرتز. قام مكبر صوت يقع على بعد 20 سم أمام أذن الجرذ، مقابل القشرة المكشوفة، بتقديم محفزات صوتية. تمت مراقبة المحفزات التي تم تسليمها بواسطة ميكروفون مقاس 0.25 بوصة (Brüel & Kjaer، 4939) تم وضعه بالقرب من الأذن وتم تقديمه في مستوى ضغط الصوت (dB SPL re 20 μPa). نحن نفحص استجابات الكمون المتوسط ​​الإيجابية (السالبة إلى الأعلى) التي يتم استحضارها من خلال النقرات المتناوبة عند 80 ديسيبل SPL، ومحفزات انفجار النغمة عند 70 ديسيبل SPL مع ترددات تتراوح من 5 إلى 40 كيلو هرتز، ووقت صعود وهبوط قدره 5 مللي ثانية و مدة 200 مللي ثانية.

تحليل البيانات

تم تحليل البيانات الفيزيولوجية الكهربية باستخدام حزم Python 3.7 (Numpy، Pandas، Scipy، Neo، Elephant، Sklearn Matplotlib) والمكتبة المخصصة PhyREC (https://github.com/aguimera/PhyREC). آر إم إس. تم حساب القيم باستخدام نافذة منزلقة تبلغ 20 مللي ثانية عند ترددات أعلى من 200 هرتز. تم حساب الطيف الطيفي لمدى يتراوح بين 70 هرتز و1.1 كيلو هرتز. تم حساب PSD على مدى 60 ثانية من التسجيلات المستمرة. بالنسبة لمجموعة أقطاب كهربائية معينة، تم حساب اثنين من PSDs: في الجسم الحي (IV) وبعد الوفاة (PM). يتم التعبير عن نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) بوحدة dB (20 × ln(r.m.s.(IV)/r.m.s.(PM))) ويتم استيفاءها لمدة 20 نقطة متباعدة لوغاريتميًا بين 10  هرتز و1  كيلو هرتز.

تحليل احصائي

البيانات العصبية القشرية الواردة في الشكل 1. 3 مأخوذة من قياسات فردية على حيوان واحد. في التين. 3c، يتم عرض البيانات من 64 أقطاب كهربائية. في التين. 3d، يتم عرض البيانات من قطبين كهربائيين محددين. في التين. 3f، يتم حساب PSD وSNR من 64 قطب كهربائي EGNITE وتظهر على أنها متوسطة ±  s.d. في الشكل التكميلي. 12 ج ، د يتم تقديم البيانات المتوسطة لـ 192 قطبًا كهربائيًا من EGNITE من n = 3 تجارب و60 قطبًا كهربائيًا من البلاتين n = 1 تجربة.

التسجيل العصبي داخل القشرة

زرع داخل القشرة

تم تخدير الحيوانات بخليط من الكيتامين/الزيلازين (75:1، 0.35 مل/28 ميكروجرام IP) وتم الحفاظ على هذه الحالة باستخدام قناع استنشاق يوفر 1.5% من الأيزوفلوران. تم وضع العديد من البراغي الدقيقة في الجمجمة لتثبيت الغرسة، وتم استخدام المسمار الموجود أعلى المخيخ كأرضية عامة. تم زرع المسبار في قشرة الفص الجبهي (الإحداثيات: AP، 1.5 مم؛ ML، ± 0.5 مم؛ DV، .1.7 مم من bregma). تم إجراء عملية الزرع عن طريق طلاء المسبار بالمالتوز (انظر البروتوكول أدناه) لتوفير صلابة المسبار المؤقتة وتسهيل إدخال المسبار. تم إغلاق المسبار بأسمنت الأسنان. تم استخدام موصلات TDT-ZifClip لتوصيل المسبار بالنظام الفيزيولوجي الكهربي عبر كابل مصغر. بعد الجراحة، خضع الفأر لفترة نقاهة مدتها أسبوع واحد حيث تلقى علاجات التسكين (البوبرينورفين) والعلاجات المضادة للالتهابات (ميلوكسيكام). تم تسجيل النشاط العصبي باستخدام نظام Open Ephys متعدد القنوات بمعدل أخذ عينات قدره 1 كيلو هرتز باستخدام مضخم صوت Intan RHD30. تم إجراء تجارب المهام السمعية في صندوق عازل للصوت، مع وجود مكبري صوت بداخله باستخدام بروتوكولات تعتمد على العمل الموصوف مسبقًا⁶¹. يتكون المحفز الصوتي من نقرة ضوضاء بيضاء مدتها 15 مللي ثانية، تتكرر 100 مرة (دورات)، يفصل بين كل منها 5 ثوان (فاصل زمني بين التحفيز). خلال المهمة، كان الحيوان قادرا على التحرك بحرية.

بروتوكول تقوية المالتوز

يتم تسخين محلول مائي من المالتوز حتى نقطة التزجج (T_g) بين 130 و160 درجة مئوية، باستخدام طبق ساخن أو ميكروويف. بمجرد أن يصبح المالتوز لزجًا، يتم الاتصال بالجزء الخلفي من المسبار مع المالتوز فقط. عندما يبرد المالتوز، فإنه يصلب ويصلب المسبار.

تحليل البيانات

تمت تصفية الإشارات العصبية من كل قطب كهربائي دون الاتصال بالإنترنت لاستخراج SUA وLFPs. تم تقدير SUA عن طريق تصفية الإشارة بين 450 و6,000 هرتز وتم فرز المسامير من الخلايا العصبية الفردية باستخدام تحليل المكون الرئيسي باستخدام Offline Sorter v.4 (Plexon). للحصول على LFPs، تم اختزال الإشارات إلى 1 كيلو هرتز، وتم التخلص منها وتصفيتها لإزالة آثار خط الضوضاء (50 هرتز وتوافقياتها) باستخدام نصوص مكتوبة خصيصًا في Python. تم حساب AEP SNR كنسبة لسعة الذروة N1 وsd. لمدة 20 مللي ثانية قبل التحفيز.

تحليل احصائي

البيانات الموضحة في الشكل. 3 ح، ط هي يعني   ±  sd، n = 30 كعدد التجارب المتوسطة. وتظهر البيانات المسجلة من نفس القطب في الأيام 30 و60 و90. ويتم عرض البيانات من حيوان واحد.

التوافق الحيوي القشري المزمن

زرع الأجهزة الجراحية

تم استخدام ما مجموعه 27 من فئران سبراغ داولي البالغة من الذكور في هذه الدراسة (نهر تشارلز). تم إيواء الحيوانات في درجة حرارة محيطة تبلغ 21   ± 2   درجة مئوية ورطوبة 40-50٪، في دورة ضوء 12 ساعة / 12 ساعة مظلمة. تم إيواء الفئران في مجموعات ومنحها حرية الوصول إلى النظام الغذائي والماء طوال فترة التجربة. تم تنفيذ الإجراءات التجريبية وفقًا لقانون رعاية الحيوان (1998)، بموجب موافقة وزارة الداخلية في المملكة المتحدة وهيئة المراجعة الأخلاقية المحلية لرعاية الحيوان (AWERB). تم تخدير الحيوانات باستخدام الأيزوفلورين (2-3%) طوال مدة الجراحة، وتم رصد عمق التخدير عن طريق اختبار منعكس قرصة إصبع القدم. تم وضع الحيوانات في إطار التجسيمي (Kopf، 900LS)، الموجود فوق بطانية حرارية للحفاظ على درجة حرارة الجسم. ثقب القحف (~تم صنع 5 مم من خط الوسط باستخدام مثقاب أسنان مزود بمثقاب لدغ مقاس 4 مم، وتمت إزالة الجافية ووضع الجهاز القشري على السطح القشري للدماغ. تم إغلاق ثقب حج القحف باستخدام كويك سيل، متبوعًا بأسمنت الأسنان لتأمينه، وإغلاق الجلد بخياطة. تم إعطاء الحقن تحت الجلد من محلول ملحي (1 مل لكل كجم (وزن الجسم)) والبوبرينورفين (0.9 ملجم لكل كجم (وزن الجسم)) لتعويض السوائل المفقودة وتقليل الألم بعد العملية الجراحية، وتم سحب التخدير.

جمع الأنسجة ومعالجتها

تم إنهاء الحيوانات بعد 2 أو 6 أو 12 أسبوعًا من الزرع بطريقة مناسبة لنوع التحليل المطلوب إجراؤه.

علم الأنسجة والكيمياء المناعية

في 2 أو 6 أو 12 أسبوعًا، تم إنهاء الفئران بعد الزرع عن طريق التروية القلبية باستخدام الهيبارين (10 وحدة دولية مل).^-1، سيجما الدريخ) برنامج تلفزيوني، تليها بارافورمالدهيد 4٪ (PFA، سيجما الدريخ) في برنامج تلفزيوني. تم تثبيت العقول لاحقًا في 4٪ PFA لمدة 24 ساعة، ثم نقلها إلى 30٪ سكروز في PBS لمدة 48 ساعة على الأقل قبل التجميد في الأيزوبنتان. تم بعد ذلك تخزين العقول عند درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى يتم تجميدها عند درجة حرارة 25 ميكرومتر. تم بعد ذلك تلوين الأنسجة باستخدام جزيء محول ربط الكالسيوم المتأين 1 (Iba-1) لتحديد مستوى تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة. باختصار، تم حظر أقسام الأنسجة باستخدام مصل الماعز بنسبة 5% في برنامج تلفزيوني مع 0.1% Triton-X لمدة ساعة واحدة قبل الحضانة طوال الليل عند درجة حرارة 1 درجات مئوية باستخدام الجسم المضاد الأساسي المضاد لـ Iba-4 (1: 1، 1,000-019؛ واكو). تم بعد ذلك تلوين المقاطع بجسم مضاد ثانوي، مضاد للأرنب Alexa Fluor 19741 (594:1، A-400؛ Thermo Fisher) لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة. تم تركيب الشرائح باستخدام ساترة باستخدام وسائط التثبيت المضادة للتلاشي Prolong Gold مع 11012،1-diamidino-4,6-phenylindole (Thermo Fisher). غطى المسبار مساحة 2 × 3 mm² على السطح القشري للدماغ. غطت أقسام الأنسجة المختارة للتلوين طول هذه المنطقة بمقدار 3.2 ملم. تم تصوير الشرائح باستخدام ماسح الشرائح المجهري 3DHistech Pannoramic-250 بمعدل 20 × وتم تحليل الصور باستخدام CaseViewer v.2.4 (3DHistech). لتقييم تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة، تمت تغطية مساحة 3.2 ملم، مع تحليل صورة واحدة كل 100 ميكرومتر. تم التقاط الصور بتكبير 8.5 × والتي توضح بالتفصيل قسمًا من موقع المسبار الفوقي القشري، على بعد 3 ملم من الخط الأوسط للدماغ، ويشمل المنطقة الموجودة أسفل موقع المسبار مباشرةً.

معالجة الصور

تمت معالجة بيانات الفحص المجهري باستخدام خوارزمية لتوصيف النمط الظاهري للخلايا الدبقية الصغيرة (الشكل التكميلي S1). 13). تم تحليل تنشيط Microglial باستخدام CellProfiler* المخصص (Broad Institute، v.3.1.9 من https://cellprofiler.org/) خط انابيب. أولاً، تم استخدام وحدة EnhanceOrSuppressFeatures لتعزيز الهياكل الخيطية مثل الخلايا العصبية من خلال تطبيق طريقة تعزيز الأنبوبة. من الصور المحسنة، تم تجزئة الخلايا باستخدام وحدة IDidentPrimaryObjects. تشير القياسات الأولية للخلايا إلى أن نطاق قطر الكائن المناسب يتراوح بين 3 إلى 40 بكسل. تم تجاهل الكائنات الموجودة خارج نطاق القطر هذا أو التي تلامس حافة الصورة. تم تجزئة الخلايا باستخدام استراتيجية العتبة التكيفية من فئتين من Otsu مع حجم نافذة تكيفي يبلغ 50 بكسل. تم إدخال الكائنات التي تم تحديدها بواسطة وحدة DefentPrimaryObjects إلى وحدة MeasureObjectSizeShape لحساب الخصائص الضرورية لتصنيف الخلايا. في وحدة ClassifyObjects، تم تحديد الفئة التي سيتم بناء التصنيفات عليها لتكون AreaShape، وتم تحديد المدى باعتباره القياس المقابل. تم تصنيف الخلايا على أنها 'المنشط" أو "غير المنشط" بناءً على خاصية المدى، وهي نسبة المساحة التي تشغلها الخلية إلى المساحة التي يشغلها المربع المحيط بها. تم تبرير نهج التصنيف هذا من خلال حقيقة أن الخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة لها أجسام خلوية كبيرة ولا تحتوي على عمليات، وبالتالي تشغل نسبة أكبر بكثير من الصناديق المحيطة بها مقارنة بنظيراتها غير النشطة. وأخيرًا، تم استخدام وحدتي CalculateMath وExportToSpreadsheet لحساب وإخراج الإحصائيات المطلوبة.

تحليل احصائي

مجموعات البيانات هي n =  3 لكل نوع جهاز (زرع PI فقط (PI)؛ PI مع الذهب المصنَّع بشكل دقيق (ذهبي)؛ وPI مع الذهب المصنَّع بدقة وEGNITE (EGNITE) في جميع النقاط الزمنية) باستثناء الذهب لمدة 6 أسابيع وهو n = 2 لبيانات ELISA. تم الجمع بين نصفي الكرة الأرضية المقابل في كل نقطة زمنية لإعطاء n = 9 عند 2 و 12 أسبوعًا بعد الزرع و n = 8 بعد 6 أسابيع من الزرع. تم تحليل البيانات باستخدام برنامج GraphPad Prism v.8. تم الانتهاء من التحليل الإحصائي باستخدام تحليل التباين ثنائي الاتجاه (ANOVA) مع اختبار توكي للمقارنات المتعددة حيثما كان ذلك مناسبًا؛ P تم اعتبار <.0.05 أمرًا مهمًا.

ELISA

بعد فترة الزرع، تم إنهاء الحيوانات عن طريق خلع عنق الرحم. تم استخراج أنسجة المخ من نصفي الكرة الأيمن والأيسر من الدماغ، وتم تجميدها في النيتروجين السائل وتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى. تم تحلل الأنسجة باستخدام محلول تحلل NP-40 (150 ميكرومتر كلوريد الصوديوم، 50 ميكرومتر تريس-كل، 1٪ بديل Nonidet P40، Fluka، درجة الحموضة المعدلة إلى 7.4) تحتوي على مثبط الأنزيم البروتيني والفوسفاتيز (Halt Protease وPhosphatase Inhibitor Cocktail، Thermo Fisher)، تليها تعطيل ميكانيكي للأنسجة (TissueLyser LT، Qiagen). تم بعد ذلك طرد العينات لمدة 10 دقائق عند 5,000 دورة في الدقيقة، وتخزين المادة الطافية عند درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى استخدامها مرة أخرى. تم تشغيل لوحة التهاب الفئران LEGENDplex (رقم الكتالوج 740401، BioLegend)، وهي مجموعة ELISA متعددة الإرسال قائمة على الخرز، لتحديد كمية السيتوكينات التالية؛ IL-1α، IL-1β، IL-6، IL-10، IL-12p70، IL-17A، IL-18، IL-33، CXCL1 (KC)، CCL2 (MCP-1)، محفز مستعمرة المحببات-البلاعم عامل الإنترفيرون γ وعامل نخر الورم. تم تشغيل المجموعة وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة، مع تحميل البروتين بحجم ثابت قدره 15 ميكرولتر. بعد الحضانة مع طاف، تم تشغيل الخرز على مقياس التدفق الخلوي BD FACSVerse، وتم تحليل البيانات باستخدام برنامج تحليل البيانات LEGENDplex.

التحفيز العصبي

زرع داخل الأوعية

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل اللجنة الأخلاقية لجامعة برشلونة المستقلة وفقًا لتوجيهات مجلس المجتمعات الأوروبية 2010/63/EU. تم إيواء الحيوانات عند درجة حرارة 22   ±   2   درجة مئوية تحت دورة ضوء 12   ساعة / 12   ساعة مظلمة مع توفر الطعام والماء مجانًا. العصب الوركي لدى إناث فئران سبراغ-داولي المُخدرة (250-300 جم، ~تم تعريض أقطاب TIME (عمرها 18 أسبوعًا) جراحيًا وتم زرع أقطاب TIME بشكل مستعرض عبر العصب الوركي بمساعدة إبرة مستقيمة متصلة بخيط حلقة 10-0⁴⁶. تمت مراقبة العملية تحت مجهر التشريح للتأكد من الموضع الصحيح للمواقع النشطة داخل حزم العصب (الشكل 1 أ). 4b). أثناء التجارب، تم الحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان باستخدام وسادة التدفئة.

تم إجراء تحفيز العصب من خلال تطبيق قطارات من نبضات تيار ثنائية الطور لمدة ثابتة تبلغ 100 ثانية لكل مرحلة وزيادة السعة من 0 إلى 150 ميكرو أمبير في خطوة واحدة أو 1 ميكرو أمبير عند 3 هرتز لمدة 3 ثانية (Stimulator DS33، Digitimer) من خلال EGNITE المختلفة. أقطاب كهربائية دقيقة. في الوقت نفسه، تم تسجيل CMAPs من عضلات GM وTA وPL باستخدام أقطاب إبرة صغيرة (طولها 4 مم، وقطرها 13 مم، وأقطاب إبرة من الفولاذ المقاوم للصدأ A-0.4-03BEP، Bionic) موضوعة في كل عضلة.⁶². تم وضع القطب النشط على عضلة البطن والمرجع على مستوى الوتر. تم تضخيم تسجيلات تخطيط كهربية العضل (× 100 لـ GM و TA، × 1,000 لـ PL؛ ومكبرات الصوت P511AC، Grass)، وتصفية تمرير النطاق (3   هرتز إلى 3   كيلو هرتز) ورقمنتها باستخدام نظام تسجيل PowerLab (PowerLab16SP، ADInstruments) عند 20   كيلو هرتز.

تحليل البيانات

تم قياس سعة كل CMAP من خط الأساس إلى الحد الأقصى للذروة السلبية. تم تطبيع قياسات ذروة الجهد إلى الحد الأقصى لسعة CMAP التي تم الحصول عليها لكل عضلة في التجربة. تم حساب مؤشر الانتقائية (SI) لكل موقع نشط كنسبة بين سعة CMAP الطبيعية لعضلة واحدة، CMAP_i، ومجموع سعة CMAP الطبيعية في العضلات الثلاث، باتباع الصيغة SI_i = nCMAP_i/∑nCMAP_j، عند الحد الأدنى لسعة تيار التحفيز التي أثارت الحد الأدنى من الاستجابة العضلية ذات الصلة وظيفيًا (يتم تعريفها على أنها 5٪ على الأقل من سعة CMAP لإحدى العضلات فيما يتعلق بأقصى سعة CMAP لتلك العضلات التي تم تحديدها مسبقًا). بعد ذلك، تم اختيار المواقع النشطة ذات أعلى SI لكل من العضلات الثلاث لتكون SIs لكل عضلة في تجربة معينة.

التوافق الحيوي المزمن داخل العصب

بعد إجراء تم الإبلاغ عنه مسبقًا^50,63، العصب الوركي لدى إناث فئران سبراغ داولي المخدرة (250-300 جم، ~تم الكشف عن أجهزة التوافق الحيوي في الجسم الحي مع أو بدون EGNITE طوليًا في الفرع الظنبوبي للعصب الوركي (عمره 18 أسبوعًا) وتم زرعها طوليًا في الفرع الظنبوبي للعصب الوركي (n =  6-8 لكل مجموعة). باختصار، يتم ثقب العصب عند التثليث بإبرة مستقيمة متصلة بخيط حلقة 10-0 (STC-6، Ethicon)؛ يسحب الخيط الطرف على شكل سهم لشريط القطب الكهربائي المنحني. يتم قطع الطرف لإزالة الخيط، ويتم ثني أطراف كل ذراع قليلاً لتجنب سحب الجهاز. تم اختيار الغرسة الطولية لأنها تتيح دراسة أفضل لاستجابة الجسم الغريب داخل العصب⁵⁰.

تقييم وظائف الأعصاب والحيوان

تم تقييم الحيوانات أثناء متابعة ما بعد الزرع عن طريق التوصيل العصبي، وقياس النبض، واختبارات حركة مسار المشي.⁶². بالنسبة لاختبارات التوصيل، تم تحفيز العصب الوركي للكفوف المزروعة والمقابل بواسطة أقطاب الإبرة عند الشق الوركي وتم تسجيل CMAP للعضلة PL على النحو الوارد أعلاه. تم قياس الكمون وسعة CMAP. بالنسبة لاختبار قياس الصفائح الدموية، تم وضع الفئران على منصة شبكية سلكية وتم تطبيق محفز ميكانيكي غير ضار باستخدام طرف معدني متصل بمقياس الطحالب الإلكتروني Von Frey (Bioseb). تم قياس عتبة مسبب للألم (القوة بالجرام التي سحبت عندها الحيوانات مخلبها) من الكفوف المزروعة مقابل الكفوف المقابلة. بالنسبة لاختبار مسار المشي، تم طلاء السطح الأخمصي للقدمين الخلفيتين بالحبر الأسود وترك كل فأر يسير على طول الممر. تم جمع آثار الأقدام، وحساب المؤشر الوظيفي الوركي⁶².

علم الانسجة

بعد أسبوعين أو 2 أسابيع، تم إمداد الحيوانات بـ PFA (8٪)، وتم حصاد الأعصاب الوركية وتثبيتها وحفظها بالتبريد ومعالجتها للتحليل النسيجي. لتقييم FBR، تم قطع الأعصاب الوركية إلى مقاطع عرضية بسماكة 4 ميكرومتر باستخدام ناظم البرد (Leica CM15). تم تلطيخ العينات بالأجسام المضادة الأولية للمحاور العصبية المايلينية (مضاد RT190 لتسمية الخيط العصبي 97K، 200:1؛ بنك الورم الهجين للدراسات التنموية) والبلاعم (anti-Iba-200، 1:1؛ واكو). بعد ذلك، تم تحضين الأقسام لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع الأجسام المضادة الثانوية للحمار المضاد للفأر Alexa Fluor 500 والحمار المضاد للأرنب Alexa Fluor 1 (488: 555، Invitrogen). تم اختيار مقاطع تمثيلية من الجزء المركزي من الزرعة في العصب الظنبوبي، وتم التقاط الصور باستخدام مجهر الفلورسنت (Eclipse Ni، Nikon) المتصل بكاميرا رقمية (DS-Ri1، Nikon) وتم إجراء تحليل الصور باستخدام برنامج ImageJ (المعاهد الوطنية الصحة). تم قياس كمية الخلايا الإيجابية Iba-200 في كامل منطقة العصب الظنبوبي وتم قياس سمك كبسولة الأنسجة على أنها متوسط ​​المسافة لكل جانب من جوانب الزرع إلى أقرب محاور عصبية.

تحليل احصائي

للتحليل الإحصائي للبيانات، استخدمنا ANOVA أحادي أو ثنائي الاتجاه متبوعًا باختبار Bonferroni اللاحق للاختلافات بين المجموعات أو الأوقات. تم استخدام برنامج GraphPad Prism للتمثيل والتحليل الرسومي. تم أخذ الأهمية الإحصائية في الاعتبار عندما P <0.05.

ملخص التقارير

مزيد من المعلومات حول تصميم البحوث متاح في ملخص تقارير حافظة الطبيعة مرتبطة بهذه المادة.

• محتوى مدعوم من تحسين محركات البحث وتوزيع العلاقات العامة. تضخيم اليوم.
• PlatoData.Network Vertical Generative Ai. تمكين نفسك. الوصول هنا.
• أفلاطونايستريم. ذكاء Web3. تضخيم المعرفة. الوصول هنا.
• أفلاطون كربون، كلينتك ، الطاقة، بيئة، شمسي، إدارة المخلفات. الوصول هنا.
• أفلاطون هيلث. التكنولوجيا الحيوية وذكاء التجارب السريرية. الوصول هنا.
• المصدر https://www.nature.com/articles/s41565-023-01570-5