Fare modelleri

X-MET üretmek için kullanılan yabani tip ve transgenik hayvanlar, 22 saatlik aydınlık/karanlık döngüsüne sahip sıcaklık kontrollü (12 °C) bir odada barındırıldı. Tüm hayvan deneyleri, DIEM ve İtalya Ulusal Sağlık Enstitüsü'nün hayvan tesislerinin Kurumsal İnceleme Kurulu'nun (n° 609/2015-PR; n° 864/2020-PR) yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi ve uygun şekilde rapor edildi. ARRIVE yönergeleri ile.

Birincil kültürler ve X-MET üretimi

Kas birincil kültürü ve X-MET üretimi, Carosio ve ark.'da ayrıntılı olarak açıklanan protokol izlenerek gerçekleştirildi.¹⁸. Miltenyi Biotech'in İskelet Kası Ayrıştırma Kiti kullanılarak vahşi tip farelerden (WT) veya transgenik farelerden toplanan arka bacakların mekanik ve enzimatik ayrıştırılmasıyla heterojen bir hücre popülasyonu elde edildi. Ayrışmış hücreler, 70 μm'lik bir hücre süzgecinden filtrelendi ve 1200 rpm'de 15 dakika boyunca santrifüjlendi. Hücreler, büyüme ortamında (GM) (DMEM, %20 at serumu, %3 civciv embriyo ekstraktı, 25 mM HEPES, 4 mM) yeniden süspanse edildi. l-glutamin, %0.1 gentamisin, penisilin/streptomisin) ve kültürdeki miyoblastların zenginleşmesini sağlamak için 30 dakika boyunca arka arkaya iki kez kaplandı. Hücreler yeniden süspanse edildi ve tip I kollajen (Sigma) ile kaplanmış 40,000 mm çaplı bir doku kültürü tabağına 35 hücre/ml konsantrasyonda kaplandı ve %5 COXNUMX'de inkübe edildi₂ 37 °C'de. 5-6 günlük kültürden sonra miyoblastlar, bir farklılaşma ortamı (DM: DMEM, %5 at serumu, 25 mM HEPES, 4 mM) kullanılarak farklılaşmaya teşvik edildi. l-glutamin, %0.1 gentamisin, penisilin/streptomisin). DM ile 2-3 günlük inkübasyondan sonra, iskelet kası birincil hücre tek katmanı, steril bir ucun plakanın periferik alanı etrafında hafifçe hareket ettirilmesiyle katmanlara ayrılır. Delamine edilmiş tek tabaka daha sonra 0.20 mm çaplı paslanmaz çelik Minutiens pimleri (Austerlitz INSECT PINS®) kullanılarak silikon kaplı bir tabak (Sylgard, Dow Corning, Midland, Michigan) üzerine sabitlendi. X-MET iki farklı uzunlukta gerildi: başlangıçtaki delaminasyon uzunluğuna karşılık gelen +%0 (uzatılmamış X-MET) ve başlangıç ​​delaminasyon uzunluğunun 66 ± %1.5'i (+%66) (gerilmiş X-MET). Bu mekanik koşullarda X-MET, kültürde 15 gün sonra morfolojik, fonksiyonel ve moleküler seviyelerde analiz edildi. Genel olarak X-MET, atan miyotüpleri içeren, kendi kendine organize olan silindirik bir yapı sergiler ve ortalama olarak 200 ± 12 mm'lik bir çapa ve (gerilmeden sonra) 2 ± 0.5 cm'lik bir uzunluğa sahiptir.

X-MET mekanik özellik ölçümleri

İlk başta, germe sırasında doku tarafından üretilen pasif kuvvet, uzunluk kontrolü için bir aktüatör/dönüştürücü (Aurora Scientific Inc. 300B) ve bir mikro kuvvet dönüştürücü (Kronex AE801) kullanılarak ölçüldü. LabVIEW 2019'da geliştirilen bir yazılım, esneme sinyali ile kuvvet ölçümü arasındaki senkronizasyonun yanı sıra test parametrelerinin ayarlanmasına da olanak sağladı. Dokunun ilk delaminasyon uzunluğundan başlayarak X-MET, 66 cm/dakika sabit hızla %1.5 ± 1 oranında gerildi ve eş zamanlı olarak doku tarafından üretilen pasif kuvvet ölçüldü. Daha sonra X-MET spontan kasılma kuvveti, hem gerilmemiş hem de gerilmiş X-MET koşulları için yapı delaminasyonundan 15 gün sonra ölçüldü. Ayrıntılı olarak, dokunun bir ucu pimlerle sabit tutuldu ve diğer ucu bir mikro kuvvet dönüştürücüye (Kronex AE801) bağlandı. Kas kasılma aktivitesi, National Instruments veri toplama panosu (DAQ NI-PCI 15) ve Labview 6251'da özel olarak geliştirilen bir yazılım aracılığıyla 2019 saniye boyunca elde edildi. Daha sonra spontan kasılma frekansı, Hızlı Fourier Dönüşümü (FFT) aracılığıyla hesaplandı. Kuvvet ölçüm testinin tüm süresi boyunca X-MET, farklılaşma ortamı içeren bir kültür kabına yerleştirildi ve bir sıcaklık kontrol plakası (Okolab srl, H37) kullanılarak 401 °C sıcaklıkta tutuldu.

RNA ekstraksiyonu ve gerçek zamanlı PCR

Toplam RNA ekstraksiyonu, TriReagentTM (SIGMA) kullanılarak gerçekleştirildi ve çift sarmallı cDNA elde etmek için her bir RNA örneğinin bir mikrogramı, QuantiTec Ters Transkripsiyon kiti (QIAGEN) kullanılarak retrotranskripte edildi. Hprt, Cx-7500, TNNT6, p-MHC, PDE43C, IL-2, IL- için önceden hazırlanmış 1-Karboksifloresein (FAM) etiketli TaqMan tahlili kullanılarak ABI PRISM 6 SDS (Applied Biosystem, ABD) üzerinde bağıl kantitatif PCR gerçekleştirildi. 2, IL-4, IL-10, CCL2, COL3A1, CACNA 1C, RyR2, a-MHC, ANP ve BNP (Applied Biosystem, ABD). Göreceli kantitatif RT-PCR örnek değeri, Hprt mRNA'nın ifadesi için normalleştirildi. MiR-1 ve miR-29b'yi analiz etmek için ekstrakte edilen RNA, mikro-RNA Ters Transkripsiyon KIT (Applied Biosystem) kullanılarak retrotranskripte edildi. Nispi kantitatif PCR, miR7500 (Applied Biosystem, ABD) için önceden hazırlanmış 6-Karboksifloresein (FAM) etiketli TaqMan tahlili kullanılarak ABI PRISM 1 SDS (Applied Biosystem, ABD) üzerinde gerçekleştirildi. Göreceli kantitatif RT-PCR örnek değeri, U6 snRNA'nın ifadesi için normalleştirildi.

RNA-sekans analizi

DM'de 15 gün sonra gerilmiş X-MET'lerden, gerilmemiş X-MET'lerden ve 2 boyutlu birincil hücrelerden Trizol ile RNA izole edildi. Derin dizileme için Uygulamalı Genomik Enstitüsü'ne (Udine, İtalya) bir mikrogram RNA gönderildi. cDNA kütüphaneleri standart Illumina protokolüne uygun şekilde işlendi ve HiSeq2500 (4-plex çalışma, 1 x 50 bp okuma, yaklaşık 30 M okuma/örnek) ile sekanslandı. Okumalar, Tophat10 (⁴⁰;v2.1.1), HTSeq-count (⁴¹; v0.5.4p5). Diferansiyel ekspresyon analizi R (v3.5.1)'de DESeq2 (⁴¹; v1.20.0). Tüm koşullardan gelen sayım verileri, yalnızca tüm örnekler için sayım toplamı 1'den yüksek olanlar tutularak ham sayımlarına göre filtrelendi. Temel Bileşen Analizi (PCA), farklı örnekler arasındaki en fazla %42'lik varyant gene dayanıyordu. Genlerin Benjamini-Hochberg'e göre düzeltilmiş p değeri (FDR) <0.01 ile farklı şekilde ifade edildiği kabul edildi.

İmmünofloresan analizi

X-MET'lerin çapraz ve uzunlamasına kesitlerinde immünofloresan analizi yapıldı. X-MET'ler doku dondurucu ortama gömüldü ve nitrojenle soğutulmuş izopentan içinde anında donduruldu. Numuneler bir kriyostat üzerine monte edildi ve 10 mikron kalınlığında kesitler halinde kesildi. Bölüm %4 PFA ile sabitlendi, %1 BSA ve %0.2 Triton X-100 ile PBS içinde yıkandı, oda sıcaklığında %1 keçi serumu içinde 10 saat süreyle ön inkübe edildi ve aşağıdaki birincil antikorlarla gece boyunca 4 °C'de inkübe edildi: Myosin Heavy Zincir (MyHC) (Sigma-Aldrich), Connexin-43 (Cx-43) (Sigma-Aldrich) ve Kardiyak troponin (Troponin I) (RV-C2 Hibridoma Bankası). Kesitler daha sonra %0.2 Triton X-100 ile PBS içerisinde yıkandı ve oda sıcaklığında 45 dakika boyunca ikincil antikor (Alexa Fluor, Life Technologies) ile inkübe edildi. Çekirdekler, Pibenzimol bisbenzimid H33342 (HOECHST) kullanılarak boyandı. Tüm analizler Zeiss Confocal yazılımı (Zen 3.0 Blue edition) kullanılarak yapıldı.

Boya transfer tekniği

X-MET, kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ile 2 kez yıkandı. Farklılaşma ortamında seyreltilmiş Lucifer sarı CH (0.2 mg/ml) (Molecular Probes) ve rodamin dekstran (0.5 mg/ml) (Molecular Probes) karışımı hazırlandı. Boyaların hücrelere nüfuz etmesine izin vermek için yapı, X-MET'i canlı tutmak ve bir 'çift inkübasyon odası' oluşturmak için önceden hazırlanmış bir slayt üzerine yerleştirildi: X-MET yapısının bir ucunu içeren bölmeye 50 ul Yukarıda ayrıntıları verilen karışımın bir kısmı ilave edilirken, diğer ucu içeren hazneye dokuyu ıslak tutmak için farklılaşma ortamı ilave edildi. X-MET, 10 °C'de, %37 CO5'de XNUMX dakika boyunca inkübe edildi₂, üç kez PBS ile yıkandı ve ardından eş odaklı mikroskopi ile analiz edildi. X-MET'in yaşayabilirliğini doğrulamak ve boyanın aktarımını izlemek için hızlandırılmış bir analiz yapıldı. Görüntüler, Ar/ArKr ve HeNe lazerleriyle donatılmış bir Leica konfokal mikroskobu (lazer taramalı TCS SP2) ile 10X objektif kullanılarak elde edildi. Lazer çizgisi Lucifer sarısının uyarılması için 488 nm ve rodamin dekstranın uyarılması için 633 nm idi. Floresans, Lucifer sarısı için 500/540 nm'de ve rodamin dekstran için 640/680 nm'de toplandı. Floresan yoğunluğu Leica yazılımı kullanılarak hesaplandı.

Hücre içi kalsiyum düzeylerinin belirlenmesi

FURA-2AM göstergesi_ Hücre içi kalsiyumu [Ca²⁺]i Geçici, gerilmemiş X-MET (X-MET %0) ve başlangıç ​​delaminasyon uzunluğunun %66'sında gerilmiş X-MET (X-MET %66), 35 mm tabaklarda kültürlendi ve 3.5 μmol/ içeren kültür ortamında inkübe edildi. L 2-[6-[bis[2-[(Asetiloksi)metoksi]-2-oksoetil]amino]-5-[2-[2-[bis[2-[(asetiloksi)metoksi]-2-oksoetil]amino ]-5-metilfenoksi]etoksi]-2-benzofuranil]-5-oksazolkarboksilik asit (asetiloksi)metil ester (FURA-2-AM, Invitrogen, Carlsbad, California, ABD), 30 °C'de 37 dakika süreyle. Daha sonra ortam, Hank'in dengeli tuz çözeltisi (Sigma-Aldrich, St.Louis, Missouri, ABD) ile durulandı. Tabaklar, ters çevrilmiş bir floresan mikroskobunun (Nikon TE2000E, Nikon Instruments, İtalya) desteği üzerine, 37 ° C'de soğutulmuş bir şarj bağlantılı cihaz kamerasına (12B kaskad, Roper Scientific, Ottobrunn, Almanya) bağlı bir kültür odasına yerleştirildi. Örnekleri dönüşümlü olarak 340 ve 380 nm'de (Photon Technology International, New Jersey, ABD) aydınlatmak için rastgele erişim monokromatörü kullanıldı ve emisyon, 510 nm emisyon filtresi kullanılarak tespit edildi. Görüntüleri elde etmek için Metafluor® yazılımı (Universal Imaging Corporation, Downington PA, ABD) kullanıldı. Her deneyin sonunda, hücre içi Ca'nın maksimum düzeyde arttırılmasıyla kalibrasyon elde edildi.²⁺2 μmol / L iyonomisin (Streptomyces conglobatus, Sigma'dan iyonomisin kalsiyum tuzu) ile bağımlı FURA-5-AM floresansı ve ardından bir CaXNUMX'de minimum floresansın kaydedilmesi²⁺-ücretsiz ortam⁴².

INDO-1AM göstergesi_INDO-1 AM (Invitrogen I1226), 1 mM konsantrasyonda yüksek kaliteli yeni açılmış DMSO'da yeniden oluşturuldu ve Ca100'de XNUMX μM'lik nihai konsantrasyonda kullanıldı.²⁺/Mg²⁺ ücretsiz PBS. Sulandırıldıktan sonra ışıktan korundu ve donma-çözülmeyi önlemek için -20 °C'de saklandı. Numuneler (X-METs %0 15 DM ve X-METs %66 15 DM) PBS içerisinde üç kez yıkandı. Daha sonra kas yapıları boyunca yavaş yavaş INDO-1 AM eklendi ve numuneler 30 °C'de 37 dakika süreyle inkübe edildi. Sonunda X-MET'ler üç kez PBS ile yıkandı ve konfokal mikroskopi ile analiz edildi. Tespit, Ca1'de 475 nm'den değişen INDO-XNUMX'in çift emisyonu dikkate alınarak gerçekleştirildi.²⁺Boya Ca ile doyurulduğunda 400 nm'ye kadar serbest ortam²⁺⁴³. Tüm analizler Zeiss Confocal yazılımı (Zen 3.0 Blue edition) kullanılarak yapıldı.⁴³.

Protein ekstraksiyonu ve Western Blot

Numuneler lizis tamponunda homojenleştirildi (Tris-HCL, pH 7.5/20 mM, EDTA/2 mM, EGTA/2 mM, Sükroz/250 mM, DTT/5 mM, Triton-X/%0.1, PMSF/1 mM, NaF) /10 mM, SOV4/0.2 mM, Kokteyl Proteaz İnhibitörleri/1x (Sigma-Aldrich). Her bir lizattan eşit miktarda protein (70 μg) (daha önce Bradford tahlili ile ölçülmüş) SDS poliakrilamid jelinde (%4-15 CriterionTM) ayrılmıştır. TGX Stain-FreeTM Protein Gel, Bio-Rad) ve Trans-Blot ® TurboTM Transfer Sistemi (program: 2.5 A, 25 V, 20 dakika) kullanılarak bir nitroselüloz membrana (Trans-Blot Turbo transfer paketi, Bio-Rad) aktarılır. Membran daha sonra bir ara yükleme kontrolü olarak Ponceau (%0.005 asetik asit içerisinde %1) ile boyandı, daha sonra oda sıcaklığında 5 saat boyunca TBS-%1 Tween içerisinde %1 yağsız kuru süt ile bloke edildi ve daha sonra gece boyunca 4°C'de inkübe edildi. Cx-43 için birincil antikor (Sigma-Aldrich) ile °C. Membran daha sonra TBS-%5 Tween'de 15, 15, 5 ve 1 dakika boyunca dört kez yıkandı, ardından spesifik bir peroksidaz konjuge ikincil antikorla inkübe edildi. Oda sıcaklığında 45 dakika. TBS-%10 Tween ile 1 dakikalık üç yıkamanın ardından membran, üreticinin endikasyonlarına göre geliştirilmiş kemilüminesans sistemi (ChemiDoc Imaging System, Bio-Rad) ile analiz edildi. Elde edilen sinyal, bir biyo-görüntü analiz sistemi (Image LabTM Yazılımı) kullanılarak tarama dansitometrisi ile ölçüldü. Sonuçlar, ilgili arka planlar çıkarıldıktan sonra kontrollere (GAPDH) kıyasla göreceli entegre yoğunluk olarak ifade edilir.

AFM deney kurulumu ve veri analizi

Esneklik ölçümleri, akışkan ortamda çalışacak şekilde prob tutucuyla donatılmış Bruker Dimension Icon Atomik Kuvvet Mikroskobu (Bruker, Santa Barbara, CA) kullanılarak yapıldı. Numuneler, pimleri yerinde tutmak için bir PDMS tabakasıyla kaplanmış bir petri kabına sabitlenmiş halde tutuldu, tüm ölçümler sırasında numuneler PDMS yüzeyine yapıştırılmadı. Ölçümler, Bruker'in MLCT-BIO uçları kullanılarak, elastik sabitlere sahip (havada, termal ayar yöntemiyle kalibre edilmiş) fizyolojik tamponda gerçekleştirildi.⁴⁴, her deneye başlamadan önce) 0.0065 ± 0.0005 N/m aralığındadır. Her numune, her biri 16 mikron karelik birkaç farklı alanda, saniyede 16 kuvvet eğrisi hızında, 3 x 100 kuvvet eğrisinden oluşan Kuvvet Hacmi haritaları aracılığıyla ölçülmüştür. Kasılmadan rahatsız olan bir sinyal sunan eğrileri analizin dışında tutmak için Bruker NanoScope Analiz yazılımı (Bruker, Santa Barbara, CA) kullanılarak kuvvet eğrilerinin önceden manuel seçimi (görünür incelemeyle) yapılmıştır. numunenin. Sertlik kalibrasyon değeri (aynı zamanda dedektör hassasiyeti olarak da adlandırılır), saf bir petri kabı üzerinde kuvvet eğrilerinin elde edilmesiyle elde edilmiştir. Bu ön adımlardan sonra kuvvet eğrileri, tam işleyişi Dinarelli ve ark.'da açıklanan FC_analiz yazılımı aracılığıyla analiz edildi.⁴⁵. Young modülü değeri, numunelerin Poisson oranı 0.5 ve açılma yarı açısı 35° olan konik uç dikkate alınarak eğrilerin Hertian modeliyle oturtulmasıyla elde edilmiştir. Analize dahil edilen kuvvet eğrilerinin toplam sayısı, gerilmemiş X-MET ve gerilmiş %700 X-MET için sırasıyla 1200 ve 66'dür. İstatistiksel ve grafiksel incelemeler Origin (OriginLab, Northampton, MA) yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

Miyokard enfarktüsünde X-MET implantasyonu

Üç aylık C57BL/6J farelerine izofluran (IsoFlo®) %1.35 + %2 O ile anestezi uygulandı.₂. Mikroskobik görünüm altında, trakeayı kaplayan deri, kas ve dokuyu ayıran orta hat servikal insizyon gerçekleştirdik. Trakeanın kranyal kısmını tutan endotrakeal tüpü mikro cerrahi forseps kullanarak yerleştirdik. Solunum hızı, 110 ila 17 cm H'lik bir inspiratuar basınçla dakikada yaklaşık 18 idi.₂O. Daha sonra sol ön inen (LAD) arterin tıkanması, LAD'nin üstüne 8 mm silikon tüp (0 mm OD) yerleştirilen kalıcı bir 1-2 prolen sütür (Ethicon, Norderstedt, Almanya) kullanılarak gerçekleştirildi. sol atriyum ve LV arasındaki sınırın altında⁴⁶. Operasyon sırasında fareler, vücut sıcaklığının bir ısıtma yastığı kullanılarak 36.8 ila 37.2 °C arasında tutulması için bir rektal prob ile izlendi. Göğüs dördüncü interkostal aralıktan yatay olarak kesildi. Sonunda X-MET'in bir ucu, LAD ligasyonu ameliyatıyla aynı anda hasar bölgesinde ikinci bir ligasyon düğümüyle sabitlendi. İmplantasyon, hasar bölgesinin tamamen X-MET yapısıyla kaplanması sağlanarak gerçekleştirildi ve perikardın kalp duvarının üzerine dikkatlice yerleştirilmesiyle işlem tamamlandı. Daha sonra göğüs 5-0 polipropilen sütür kullanılarak kapatıldı. X-MET'ler, bağışıklık baskılayıcı ilaçların kullanımı hariç, C57BL/6J akraba farelerinden ve UBC/GFP farelerinden elde edildi. LAD'den kırk ve yüz gün sonra iskemi ve miyokardiyal yeniden yapılanmayı değerlendirmek için ekokardiyografik ve histolojik analizler yapıldı.

histolojik analiz

Bütün kalpler %10 formalinle sabitlendi ve 1 mm aralıklarla kesitler alındı. Her slaytta apekste başlayan ve dikiş ligasyonu bölgesinde biten 10 bölüm vardı (yaklaşık 6 slayt). Her slayt, fibroz alanlarını tanımlamak için Masson trikromu ile boyandı veya Hematoksilen ve Eozin (H&E) ile boyandı. Kas lifi membran bütünlüğünü değerlendirmek için farelere, 10 mg/g vücut ağırlığı dozunda PBS içindeki Evans mavi boyasının (EBD, 0.1 mg/mL, Sigma) intravenöz (iv) enjeksiyonu uygulandı. Her deney faresine, boya enjeksiyonundan sonra 20 dakika boyunca sürekli yüzme uygulandı. Enjeksiyondan 24 saat sonra kas örnekleri toplandı. EBD albümine bağlanır ve floresan mikroskobu altında gözlendi.

Ekokardiyografi analizi

Ekokardiyografi için in vivo yüksek çözünürlüklü mikro görüntüleme için doğrusal dizi teknolojisine ve renkli Doppler moduna sahip yüksek frekanslı, yüksek çözünürlüklü bir dijital görüntüleme platformu kullanıldı (Vevo® 3100 Imaging System, FUJIFILM VisualSonics Inc., Toronto, Kanada). Farelerin kardiyovasküler fonksiyonunu değerlendirmek için, bir veterinerin gözetiminde yetenekli bir kardiyolog tarafından yüksek frekanslı bir dönüştürücü probu (VisualSonics MS400, FUJIFILM VisualSonics, Inc., Toronto, Kanada, 18-38 MHz frekans aralığı) kullanıldı. Ameliyattan 4-5 hafta sonra farelere (IsoFlo®) %1.35 + %2 OXNUMX kullanılarak anestezi uygulandı.₂ traş edildi ve elektrikle ısıtılmış bir yüzeye yerleştirildi. M-mod ekokardiyografi ile ventriküler duvar kalınlıkları ve çapları çalışıldı ve fraksiyonel kısalma hesaplandı. Farelerin vücut ısısı bir rektal sonda kullanılarak izlendi ve çalışma bradikardik (yani, < 400 bpm) fareler hariç tutularak bir doğrulama parametresi olarak kalp hızı kullanıldı. Fonksiyonel karakterizasyon tamamlandıktan sonra, anestezi uygulanan fareye servikal dislokasyon yoluyla ötenazi uygulandı ve histolojik ve biyokimyasal analiz için doku toplandı.

İstatistiksel analizler

İstatistiksel analiz GraphPad Prism Yazılımı ile yapıldı. Tüm veriler ortalama ± SEM olarak ifade edilmiştir. Analiz edilen farklı verilere göre aşağıdaki istatistiksel analizler yapılmıştır: parametrik olmayan testler (Mann Whitney Rank Sum testi) ve 1 yönlü ANOVA testi (Bonferroni post-hoc-test, Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ve Fisher'in LSD testi). Farklılıklar p değeri ≤ 0.05 için anlamlı kabul edildi (*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001).

• SEO Destekli İçerik ve Halkla İlişkiler Dağıtımı. Bugün Gücünüzü Artırın.
• PlatoData.Network Dikey Üretken Yapay Zeka. Kendine güç ver. Buradan Erişin.
• PlatoAiStream. Web3 Zekası. Bilgi Genişletildi. Buradan Erişin.
• PlatoESG. Otomotiv / EV'ler, karbon, temiz teknoloji, Enerji, Çevre, Güneş, Atık Yönetimi. Buradan Erişin.
• Blok Ofsetleri. Çevre Dengeleme Sahipliğini Modernleştirme. Buradan Erişin.
• Kaynak: https://www.nature.com/articles/s41598-023-37553-8