Hücre kültürü

Fare ESC hatları (Rex1GFP-d2 ve E14IVc¹³⁷) besleyici içermeyen koşullarda kültürlendi [%0.2 jelatin ile kaplanmış plastik (Sigma, kat. G1890)] ve Accutase (GE Healthcare, kat. L3-4) ile ayrışmanın ardından her 1-10 günde bir 11:007 bölünmüş oranda yeniden kaplandı ) veya %0.25 Tripsin (Life Technologies). Hücreler serumsuz N2B27 bazlı ortamda [DMEM/F12 ve Neurobasal 1:1 oranında, 0.1 mM p-merkaptoetanol, 2 mM L-glutamin, 1:200 N2 ve 1:100 B27 (tüm reaktifler Life Technologies'den temin edilmiştir) kültürlendi )] veya serum içeren KSR ortamı [GMEM (Sigma, kat. G5154), %10 KSR (Life Technologies), %2 FBS (Sigma, kat. F7524), 100 mM β-merkaptoetanol (Sigma, kat. M7522) ile desteklenmiştir. , 1× MEM esansiyel olmayan amino asitler (Invitrogen, kat. 1140-036), 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat (her ikisi de Invitrogen'den)], iki küçük molekül inhibitörü (2i) PD (PD0325901, 1 μM), CH (CHIR99021, 3 μM), Axon'dan (kat. 1386 ve 1408) ve LIF (100 birim/mL, Qkine – Cambridge UK'den satın alınmıştır).

Cedars-Sinai Biomanufacturing Center'dan (Los Angeles, California) satın alınan insan iPSC'leri CS09iHD-109n5 (burada iPSC_Q109 olarak anılır) ve CS14iCTR-21n3 (burada iPSC_Q21 olarak anılır), önceden kaplanmış %0.5 Matrigel (CORNING, kat. 356231) üzerinde tutuldu. ) evde yapılmış E8 ortamındaki plakalar (Chen ve diğerleri, 2011'e göre)¹³⁸) veya mTeSR'de (StemCell Technologies, kat. 05850) 37 °C'de, %5 O², 5% CO². İnsan iPSC'leri, 0.5 mM EDTA (Gibco, kat. AM99260G) ile kümeler halinde ayrıştırıldı ve 1 saat boyunca 6 uM ROCK inhibitörü (Y3-dihidroklorür Axon Medchem, kat. 4) ile her 10-27632 günde bir 1683:24 seyreltme ile yeniden kaplandı. Ortam her gün değiştirildi. Tüm hücre çizgileri mikoplazma negatifti.

iPSC_Q21 ve iPSC_Q109'un genotiplenmesi

iPSC_Q21 ve iPSC_Q109'dan genomik DNA, üreticinin talimatları izlenerek DNeasy Kan ve Doku kiti (Qiagen, kat. 69504) kullanılarak izole edildi ve Nanodrop ND-1000 ile ölçüldü. PCR, Ek Tabloda listelenen primerler kullanılarak gerçekleştirildi 1 ve Mangiarini ve ark.²⁹, HTT ekzon 1'deki polyQ yolunu amplifiye etmek için tasarlanmıştır. 25 μL'lik bir reaksiyon için 200 ng genomik DNA, 0.25 μL Taq Phusion High sadakat (ThermoFisher, kat. F-530L), 2.5 μL Buffer GC 5x + MgCl kullandık² (7.5 mM), 2 μL dNTP (10 mM) ve 1.25 μL Dimetil sülfoksit (DMSO, %100). 3°C'de 94 dakika sonra 35 döngü gerçekleştirdik: 94 dakika boyunca 1°C, 63 saniye boyunca 45°C, 72 dakika boyunca 1°C, ardından 70°C'de 7 dakika süreyle son uzatma. Jel elektroforezi %2.5 agaroz jel üzerinde gerçekleştirildi, 20 μL PCR ürünü Purple Loading Dye 6x (NEB, kat. B7024S) ile yüklendi. β-Aktin yükleme kontrolü olarak kullanıldı. Sonuçlar VWR Imager CHEMI Premium tarafından dijital olarak elde edildi.

HTT ifade eden ESC hatlarının üretilmesi

Q15 ve Q128 hücreleri, sırasıyla 128 veya 15 CAG tekrarına sahip, insan Huntingtin geninin N-terminalini içeren vektörlerin DNA transfeksiyonuyla üretildi (Profesör Elena Cattaneo'nun izniyle). Plazmid DNA'nın gece boyunca doğrusallaştırılması, kısıtlama enzimi PvuI ile gerçekleştirildi. DNA transfeksiyonu için Lipofectamine 2000 (Life Technologies, kat. 11668-019) kullandık ve ters transfeksiyon gerçekleştirdik. 6 kuyulu bir plakanın bir kuyucuğu için 6 ul transfeksiyon reaktifi, 2 µg plazmid DNA ve 300,000 mL ortamda 2 hücre kullandık. Gece boyunca inkübasyonun ardından ortam değiştirildi. Antibiyotik seçimi (Puromisin 1 μg/mL) transfeksiyondan 24 saat sonra başladı.

İlgili genleri stabil bir şekilde ifade eden fare ESC'lerinin üretilmesi

Adayları eksprese eden stabil transgenik fare ESC'leri, HTT eksprese eden hücrelerin VectorBuilder'dan (VectorBuilder Inc, Chicago, IL, ABD), PB transpozaz ekspresyon vektörü pBase (1 μg) ile. Lipofectamine 1'i kullandık ve HD çizgilerinin oluşturulması için anlatıldığı gibi ters transfeksiyon gerçekleştirdik. Antibiyotik seçimi (Higromisin B, 2 μg/mL; Invitrogen, kat. 5) transfeksiyondan 34 saat sonra başladı.

NPC'lerin farklılaşması

iPSC_Q21 ve iPSC_Q109, Li ve diğerleri, 2011'e göre NPC'lere ayrılmıştır.⁹² protokol. %80 birleşme noktasındaki iPSC'ler, Accutase (Gibco, kat. A1110-501) ile tek hücrelerde ayrıştırıldı ve 45,000 hücre/cmXNUMX kaplandı² 8 μM ROCK inhibitörü ile E10 ortamında. 1 gün sonra E8 ortamı, Gelişmiş DMEM/F2 (Gibco, kat. 27-12): Neurobasal (Gibco, kat. 12634-010) (21103:049 oran), BSA 1 mg/mL'den oluşan N1B50 indüksiyon ortamı ile değiştirildi. (Gibco, kat. 15260-037), Glutamax %1 (Gibco, kat. 35050-038), Penisilin/Streptomisin %1 (Gibco, kat. 15140122), N2 Takviyesi 1:200 (Gibco, kat. 17502-048) , B27 Takviyesi 1:100 (Gibco, kat. 17504-044), küçük moleküller insan LIF 10 ng/mL (Qkine, kat. Qk036), SB431542 2 μM (Axon Medchem, kat. 1661), CHIR99021 3 μM ( Axon Medchem, kat. 1386), Bileşik E 0.1 μM (Sigma-Aldrich, kat. 209986-17-4). N2B27 indüksiyon ortamı 7 gün boyunca her gün değiştirildi. 7. günde NPC'ler, Gelişmiş DMEM/F1 (Gibco, kat. 6-2): Neurobasal (Gibco, kat. 27-12) (12634:010 oran)'dan oluşan N21103B049 bakım ortamında 1:1 seyreltmede bölündü. , BSA 50 mg/mL (Gibco, kat. 15260-037), Glutamax %1 (Gibco, kat. 35050-038), Penisilin/Streptomisin %1 (Gibco, kat. 15140122), N2 Takviyesi 1:200 (Gibco, kat. 17502-048), B27 Takviyesi 1:100 (Gibco, kat. 17504-044), küçük moleküller insan LIF 10 ng/ml (Qkine, kat. Qk036), SB431542 2 μM (Axon Medchem, kat. 1661) ile desteklenmiştir. ), CHIR99021 3 μM (Axon Medchem, kat. 1386), EGF 20 ng/mL (R&D, kat. 236-EG) ve FGF2 20 ng/mL (Qkine, kat. Qk002, rekombinant zebra balığı FGF2) ile desteklenmiştir. NPC'ler 6 geçiş boyunca muhafaza edildi. h-iPSC'ler ve NPC'lerin morfoloji verileri, Zeiss Axio Vert A1 FL-LED mikroskobu ile dijital olarak toplandı.

İlgilenilen genleri geçici olarak ifade eden NPC'lerin üretilmesi

DNA transfeksiyonu için 250,000 NPC, Accutase (Gibco, kat. A1110-501) ile tek hücreler halinde ayrıştırıldı ve ters transfeksiyon protokolü izlenerek FuGENE HD Transfeksiyonu (Promega, kat. E1) kullanılarak PB yapıları (2311 μg) ile transfekte edildi. . 12 kuyulu bir plakanın bir kuyusu için, 3.9 µM Y1 [ROCKi, Rho-ilişkili kinaz (ROCK) inhibitörü, Axon Medchem kedisi. 250,000]. Gece boyunca inkübasyonun ardından ortam değiştirildi. Transfeksiyondan 1 saat sonra hücreler, 2 saat boyunca Rotenone 27 uM ile muamele edildi ve daha sonra Şekil 10'de belirtildiği gibi analiz edildi. 8f.

Çoğalma deneyi

Fare ESC'leri, Puromisin 2 μg/mL varlığında KSR + 6iL ortamında bir geçiş için şartlandırıldı. ESC'lerin çoğalması, 15,000 hücrenin 24 oyuklu bir plakaya (7,500 hücre/cmXNUMX) yerleştirilmesiyle değerlendirildi.²) Puromisin 2 μg/mL varlığında KSR + 6iL ortamında. Hücreler %0.25 Tripsin (Life Technologies) ile ayrıştırıldı ve 24 gün boyunca her 4 saatte bir sayıldı.

iPSC'lerin çoğalması, 40,000 tek hücrenin önceden kaplanmış %0.5 Matrigel (CORNING, kat. 356231) 12 oyuklu plakalara (11,428 hücre/cm) kaplanmasıyla ölçüldü²) 8 uM ROCK inhibitörü (Y10-dihidroklorür, Axon Medchem, kat. 27632) ile E1683 ortamında 24 saat süreyle. Ortam her gün değiştirildi. Hücreler Accutase (GE Healthcare, kat. L11-007) ile ayrıştırıldı ve 24 gün boyunca her 4 saatte bir sayıldı.

NPC'lerin çoğalması, 100,000 hücrenin önceden kaplanmış %0.5 Matrigel (CORNING, kat. 356231) 12 oyuklu plakalara (28,571 hücre/cm) kaplanmasıyla ölçüldü²) 2 saat boyunca 27 uM ROCK inhibitörü (Y10-dihidroklorür Axon Medchem, kat. 27632) içeren N1683B24 bakım ortamında. Hücreler Accutase (GE Healthcare, kat. L11-007) ile ayrıştırıldı ve 24 gün boyunca her 4 saatte bir sayıldı.

Stres etkenlerinin tedavisi ve Kristal menekşe (CV) boyama

Şekil 2'deki deneyler için. 2b, 5,000 fare ESC'si 24 oyuklu bir plakaya (2,500 hücre/cmXNUMX) kaplandı²) 2 saat boyunca inhibitörlerin (ve Puromisin 6 μg/ml) varlığında KSR + 48iL ortamında ve CV boyamayla hayatta kalan hücrelerin sayısının ölçülmesiyle puanlandı [CV çözeltisi: %0.05 a/h Kristal Menekşe (Sigma) , %1 formaldehit çözeltisi %37 (Sigma), %1 metanol, %10 PBS] ve ortalama yoğunluğun ölçümü Fiji yazılımı (v2.0.0) ile gerçekleştirildi.

PB-mutagenezi ve ardından stres etkeni tedavileri için hücreler, 2,500 hücre/cm yoğunlukta kaplandı² Puromisin 6 μg/mL içinde ve MG5 (Sigma-Aldrich, kat. C132) veya Tamoksifen (Sigma-Aldrich, kat. T2211) varlığında 2859 gün boyunca seçildi.

Şekil 2'deki deneyler için. 4g, 5,000 hücre, Puromisin 24 μg/mL içeren KSR + 2iL ortamında 3 oyuklu bir plakaya kaplandı. Stres etkenleri (MG132 12.5 nM veya Tamoksifen 13.4 uM) 12 saat sonra ilave edildi. Hayatta kalan hücrelerin skorlanması yukarıda açıklandığı gibi yapıldı.

Ek Şekil 2'deki deneyler için. 4d2,500 hücre, KSR + 48iL ortamında 2 oyuklu bir plakaya kaplandı. Stres etkenleri [Rotenon (Sigma-Aldrich, kat. R8875), Kümen (Sigma-Aldrich, kat. 247502), 5-Azasitidin (Sigma-Aldrich, kat. A1287), MG132 (Sigma-Aldrich, kat. C2211), Bafilomisin ( Sigma-Aldrich, kat. B1793), Staurosporin (Sigma-Aldrich, kat. S6942), Tamoksifen (Sigma-Aldrich, kat. T2859)] 12 saat sonra belirtilen konsantrasyonlarda eklendi. 48 saat sonra hayatta kalan hücreler CV solüsyonuyla boyandı ve hayatta kalan hücrelerin skorlanması yukarıda anlatıldığı gibi yapıldı.

ESC'lerde PB sisteminin elektroporasyonu

Genom çapında tarama için elektroporasyon yoluyla PB aracılı mutajenez gerçekleştirildi. PB vektörleri, TTAA bölgelerine rastgele yerleştirildikten sonra genoma stabil bir şekilde entegre olur. Kullanılan PB pGG134 vektörü (Şekil XNUMX'de gösterilmiştir). 2a) işlev kazanımı ekranları için optimize edildi⁵⁴: MSCV arttırıcı/promotörden ve ardından ekson 1'den bir ek donör bölgesinden oluşur. Foxf2 Yakındaki genlerin aşırı aktivasyonuna izin veren gen. PB 5'-ITR ayrıca zayıf yönlü promoter aktivitesine sahiptir, yani bu yapı genleri her iki yönde de aktive edebilir. Vektör ayrıca, stabil vektör entegrasyonuna sahip hücreleri tanımlamak için kullanılan, DsRed ve Hygromycin direnç genlerinin takip ettiği kurucu bir promoteri içeren ikinci bir kaseti de içerir.

PB vektörünün transpozaz pBase'e oranını ayarlayarak, düşük sayıda entegrasyon olayı elde etmek için koşulları optimize ettik. Tarama prosedürü için, optimize edilmiş miktarda 0.5 μg pGG134 ve 20 μg pBase kullanılarak mutajenez gerçekleştirildi.

Tek bir elektroporasyon için 10⁷ hücreler ve 20.5 µg DNA karıştırıldı ve bir elektroporasyon küvetine (Biorad Gene Pulser Cuvette, kat. 165-2088) yerleştirildi. Hücreler, küvetin Biorad GenePulser'ın (kat. 165-2076) elektroporasyon tutucusuna yerleştirilmesiyle elektroporasyona tabi tutuldu. Kullanılan ayarlar: 250 V, 500 μF, zaman sabiti 5.6 ile 7.5 arasında olmalıdır. Elektroporasyona tabi tutulmuş hücreler küvetlerden yavaşça toplandı ve kaplandı. Antibiyotik seçimi elektroporasyondan 24 saat sonra başladı.

Genomik DNA ekstraksiyonu ve Splinkerette-PCR

Hücreler toplandı ve gece boyunca 56 °C'de lizis tamponu [10 mM Tris-HCl, pH 7.5; 10 mM EDTA; 10 mM NaCl; %0.5 a/h Sarkosil, 2308 mg/mL nihai konsantrasyona kadar proteinaz K (Sigma, kat. P1) ile desteklenmiştir. DNA çökeltileri elde etmek için ertesi gün 2 mL NaCl ve etanol karışımı (30 µL 5 M NaCl, 20 mL soğuk mutlak etanol ile karıştırılmış) ilave edildi. Hücresel ekstraktlar, çözünebilir fraksiyonu çıkarmak için 45 °C'de 4 dakika boyunca santrifüjlendi. Çöken gDNA, 2 mL %70 etanol damlatılarak üç kez durulandı ve son olarak 70 °C milliQ suda yeniden süspanse edildi.

PB entegrasyon haritalaması için Splinkerette-PCR prosedürü Potter ve Luo'dan uyarlanmıştır. ¹³⁹ ve aşağıdaki adımlardan oluşuyordu: a) 2 μg genomik DNA, 10 μL hacimde 10,000 U BstYI (30 U/mL, NEB) ile sindirildi. Reaksiyon 60°C'de gece boyunca inkübe edildi, ertesi gün enzim 80°C'de 20 dakika süreyle inaktive edildi. Splinkerette-PCR için adaptörler, 150 pmol AdapterA ve B primerlerinin tavlanmasıyla üretildi (Ek Tablo) 1) 100 μL'lik son hacimde (10x NEB Tampon 2). Oligolar 65 °C'de 5 dakika süreyle denatüre edildi, ardından soğutuldu; b) Ligasyon, 6x Ligasyon karışımı (Takara), 2 μL sindirilmiş gDNA ve Splinkerette-PCR için 2.5 μL tavlanmış adaptör içeren toplam 0.5 ul hacimde gerçekleştirildi. Ligasyon reaksiyonu, enzim inaktivasyonu için gece boyunca 16 °C'de, ertesi gün 65 °C'de 10 dakika süreyle inkübe edildi. Üreticinin talimatları takip edilerek QIaquick PCR Saflaştırma Kiti kullanılarak adım C'den önce bir saflaştırma adımı dahil edildi. PCR amplifikasyonları için, GC açısından zengin şablonlar veya ikincil yapılara sahip olanlar için önerilen 5x Phusion GC Tamponunda Phusion HF DNA Pol (NEB) kullandık. PCR karışımı 5x GC Tamponu, 10 mM dNTP'ler, DMSO ve Phusion Pol'u içeriyordu; c) İlk tur PCR, 15 μL bağlanmış DNA (veya PB50' ve PB5' transpozon/konakçı bağlantıları için her reaksiyon için %3 bağlama ürünü), her primer için 0.5 μM (Adaptör-PCR1 ve PB5' veya PB3') ile güçlendirildi. -ITR PCR1), 6.5 μL PCR karışımı, 25 μL'lik son hacim. Splinkerette-PCR1 programı: 95 °C, 2 dakika; 95 saniye boyunca 20 °C, 65 saniye boyunca 30 °C, 68 dakika boyunca 2 °C'lik iki döngü; daha sonra 30 saniye boyunca 95 °C, 30 saniye boyunca 60 °C, 30 dakika boyunca 68 °C'lik 2 döngü; daha sonra 68 dakika süreyle 10°C; d) İkinci tur PCR için, 5 μL 1:500 seyreltilmiş PCR1 ürünü, her primer için 0.5 μM (Adaptör-PCR2 ve PB5' veya PB3'-ITR PCR2), 6.5 μL PCR karışımı, 25 μL nihai hacim kullandık . Splinkerette-PCR2 programı: 95 °C, 2 dakika; 95 saniye boyunca 20 °C, 65 saniye boyunca 30 °C, 68 dakika boyunca 2 °C'lik iki döngü; daha sonra 5 saniye süreyle 95°C, 30 saniye süreyle 60°C, 30 dakika süreyle 68°C'lik 2 döngü; daha sonra 25 saniye süreyle 95°C, 30 saniye süreyle 58°C, 30 dakika süreyle 68°C'lik 2 döngü; daha sonra 68 dakika süreyle 10°C; e) PCR2 ürünleri, Antarktik Fosfataz ve Eksonükleaz I (her ikisi de NEB'den) ile işleme tabi tutuldu ve PB5'- veya PB3'-ITR PCR2 primerleri kullanılarak sekanslandı. Primerler ve adaptör dizileri Ek Tabloda listelenmiştir. 1.

Genomik entegrasyon bölgelerinin Yeni Nesil Dizileme analizi

Mutant popülasyonunun tamamından genomik DNA, Gentra Puregene Hücre Kiti kullanılarak ekstre edildi. Kütüphane hazırlığı ve sıralaması daha önce açıklandığı gibi yapıldı¹⁴⁰. Özel bir biyoenformatik hattı, her bir okumanın genomik bir lokusla eşleştirilmesine ve her entegrasyon bölgesinin 20 kb mesafedeki bir genle ilişkilendirilmesine olanak sağladı. Veriler daha sonra Cytoscape yazılımı (v3.8.2) aracılığıyla HD etkileşimli genler ağı halinde düzenlendi.¹⁴¹.

Propidium iyodür (PI) boyama

Üreticinin talimatlarına göre canlı tek fare ESC'leri üzerinde PI boyama yapıldı (Ebioscience, kat. 88-8007-72). PBS'de yıkandıktan sonra 10⁵ canlı hücreler 200 μL 1x Bağlama Tamponunda yeniden süspanse edildi ve 5 μL PI Boyama Solüsyonu (kat. 00-6990) eklendi. Akış sitometri analizi BD FACSCanto kullanılarak yapıldı^TM II sitometresi 1 saat içinde, numuneler karanlıkta 2-8 °C'de saklanıyor. Veriler BD FACSDiva ile analiz edildi^TM (v. 9.0) ve FlowJo (10.8.1) yazılımı. Temsili geçit stratejisi Ek Şekil XNUMX'de mevcuttur. 10a.

ROS ölçüm deneyi

ROS üretimi, tek canlı fare ESC'lerinin ve insan NPC hücrelerinin 2′,7′-diklorodihidrofloresein diasetat (H) ile boyanmasıyla tespit edildi.₂DCFDA; Yaşam Teknolojileri, kedi. D399), aşağıdaki adımları gerçekleştirerek: a) ROS göstergesi, konsantre bir stok çözeltisi (10 mM) hazırlamak amacıyla yeni bir şekilde yeniden oluşturuldu; b) 3-5×10⁵ hücreler toplandı, c) bir kez 500 μL PBS ile yıkandı ve d) 300 μM boya nihai çalışma konsantrasyonu sağlamak üzere probu içeren 0.5 μL PBS içerisinde yeniden süspanse edildi; e) hücreler karanlıkta 37 dakika boyunca 10°C'de inkübe edildi; f) boyama solüsyonunun çıkarılmasından sonra numuneler g) iki kez PBS içerisinde yıkandı. Örnekler bir BD FACSCanto kullanılarak akış sitometrisi ile toplandı^TM II sitometre veya BIO-RAD S3e Hücre Sıralayıcısı ve analiz BD FACSDiva ile yapıldı^TM (v. 9.0), ProSort^TM (v. 1.6) ve FlowJo (10.8.1) yazılımı. Temsili geçit stratejisi Ek Şekil XNUMX'de mevcuttur. 10b-c.

Ek V boyama

İlgili gen ile geçici olarak transfekte edilen ve 30 saat boyunca Rotenone 24 μM ile tedavi edilen canlı NPC'ler, üreticinin talimatlarına göre Annexin V ile boyandı (Ebioscience, kat. 88-8007-72). Hücreler bir kez PBS'de, ardından bir kez 1x Bağlama Tamponu (kat. 00-0055) içinde yıkandı. 5×10⁵ hücreler 200 μL 1x Bağlama Tamponu içerisinde yeniden süspanse edildi ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 17 μL florokrom konjuge Annexin V (kat. 8007-10) ile inkübe edildi. Hücreler daha sonra 500 μL 1x Bağlama Tamponu içerisinde yıkandı. Son olarak hücreler, 200 μL 1x Bağlama Tamponu içerisinde yeniden süspanse edildi. Akış sitometri analizi, BIO-RAD S3e Hücre Ayırıcı kullanılarak 1 saat içinde gerçekleştirildi ve örnekler karanlıkta 2-8 °C'de saklandı. Veriler ProSort ile analiz edildi^TM (v. 1.6) ve FlowJo (10.8.1) yazılımı. Temsili geçit stratejisi Ek Şekil XNUMX'de mevcuttur. 10c.

Western lekeleme

Hücreler soğuk PBS içinde yıkandı ve lizis tamponunda (50 mM Hepes pH 7.8, 200 mM NaCl, 5 mM EDTA, %1 NP40, %5 gliserol) toplandı, taze olarak 1 mM DTT, proteaz inhibitörü (Roche, kat. 39802300) ile desteklendi ) ve fosfataz inhibitörü (Sigma-Aldrich, kat. P5726). Numuneler bir sonikatörde (Diagenode Bioruptor) ultrasona maruz bırakıldı ve süpernatanı hazırlamak için 15,871 rcf'de 10 dakika santrifüj edildi. Protein konsantrasyonu Bradford ölçümüyle belirlendi. Şekil XNUMX'deki deneyler için. 1b, 2g, 4d ve Ek Şekil. 1dToplam protein (10 µg), %4-12 Nupage MOPS akrilamid jeli (Life Technologies, kat. BG04125BOX/BG00105BOX) üzerinde fraksiyonlara ayrıldı ve bir Transfer çözeltisi (00010 mM Tris) içinde bir PVDF membranı (Millipore, kat. IPFL50) üzerine elektroforetik olarak aktarıldı. -HCl, 40 mM glisin, %20 metanol, %0.04 SDS). Membranlar daha sonra oda sıcaklığında 5 saat boyunca TBST (170 g NaCl, 6405 g Tris-HCl, %8 Tween2.4/litre, pH 0.1) içindeki %20 Yağsız Kuru Süt tozu (BioRad; 7.5-1-MSDS) ile doyuruldu. ve gece boyunca 4 °C'de anti-HTT (klon 1HU-4C8) veya anti-GAPDH (klon 6C5) birincil antikoru (Ek Tablo) ile inkübe edildi 2). Membranlar daha sonra TBST'de %1 süt içerisinde seyreltilmiş bir peroksidaz ile konjuge edilmiş ikincil antikorlarla inkübe edildi. Membranları inkübe etmek için Pico SuperSignal West kemilüminesan reaktifi (Thermo Scientific, kat. 34078) kullanıldı ve görüntüler ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare) tarafından dijital olarak elde edildi. Kırpılmamış jeller ve sayısal değerler Kaynak veri dosyasında sağlanır.

Fareler servikal dislokasyon yoluyla kurban edildi ve dokular, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, %1 Nonidet P-40, 1 mM EDTA, 20 mM NaF, 2 mM Na içeren lizis tamponunda homojenleştirildi.₃VO₄ ve 1:1000 proteaz inhibitör karışımı (Sigma-Aldrich) ve sonikasyona tabi tutuldu. Ek Şekil XNUMX'deki deney için. 1b, 50 µg WT faresi, R6/2 faresi, Q15 hücreleri ve Q128 hücrelerinin toplam protein lizatı, elle dökülen %5-11 akrilamid istifleme jeline yüklendi ve aşağıdaki antikorlarla inkübe edildi: anti-HTT (klon EM48) ve anti -GAPDH (Ek Tablo 2). Ek Şekil 2'deki deneyler için. 8a, d, e ve g, 40 ug toplam protein lizatı aşağıdaki antikorlarla immünoblotlandı: anti-GFP, anti-ACTIN (klon 8H10D10), anti-HTT (klon EM48), anti-TUBULIN (klon B-5-1-2) (Ek Tablo) 2). Membranlar yukarıda açıklandığı gibi işlendi. Görüntüler, VWR Imager CHEMI Premium veya ChemiDoc XRS+ (model no: Universal Hood II) ile Image Lab Yazılımı, BioRad (v. 6.1) ile dijital olarak elde edildi. Miktar belirleme, yükleme kontrolünde (GAPDH, ACTIN veya TUBULIN) arka plan çıkarma ve normalleştirme ile Fiji 2.9.0 kullanılarak yapıldı. Kırpılmamış jeller Kaynak veri dosyalarında sağlanır.

İmmünoflöresan

Fare ESC'lerinde MTF1 tespiti için immünofloresan, fibronektin (Merck, kat. FC010) kaplı cam lamellere kaplanmış hücreler üzerinde gerçekleştirildi. Hücreler oda sıcaklığında 4 dakika boyunca PBS içerisinde %8775 formaldehit (Sigma-Aldrich, kat. F10) içerisinde sabitlendi, PBS içerisinde yıkandı, oda sıcaklığında PBS + %10 Triton X-0.1 (PBST) içerisinde 100 dakika süreyle geçirgenleştirildi ve bloke edildi oda sıcaklığında 3 dakika boyunca PBST + %16050 at serumu (HS; Gibco, kat. 122-45) içerisinde. Hücreler, birincil antikorlarla gece boyunca 4 ° C'de inkübe edildi (birincil ve ikincil antikor ayrıntıları için Ek Tabloya bakınız) 2) PBST + HS'nin %3'ü. PBST ile yıkandıktan sonra hücreler, oda sıcaklığında 45 dakika boyunca ikincil antikorlarla (Alexa, Life Technologies) inkübe edildi. Çekirdekler DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol; Sigma-Aldrich, kat. F6057) ile boyandı. Görüntüler Leica SP5 konfokal mikroskoplarla elde edildi. Görüntü analizi Fiji 2.9.0 kullanılarak yapıldı. Nükleer ve sitoplazmik yoğunluğun ölçümü CellProfiler yazılımı (v4.1.3) ile yapıldı. Kısaca çekirdekler DAPI boyama ile tespit edildi. Sitoplazma, çekirdeklerin 10 piksel kadar radyal olarak genişletilmesiyle keyfi olarak tanımlandı. MTF1 sinyalinin entegre nükleer yoğunluğunun, MTF1 sinyalinin hücresel entegre yoğunluğuna (çekirdek + sitoplazma) oranı hesaplandı ve çizildi.

İnsan iPSC'leri ve NPC'leri üzerinde immünofloresan analizi, oyuklardaki %1 Matrigel kaplı cam lamellerde gerçekleştirildi. Hücreler oda sıcaklığında 4 dakika boyunca PBS içerisinde %8775 formaldehit (Sigma-Aldrich, kat. F10) içerisinde sabitlendi, PBS içerisinde yıkandı, oda sıcaklığında PBST içerisinde 1 saat süreyle geçirgenleştirildi ve PBST + %5 HS (Gibco, Katalog 16050-122) 5 saat oda sıcaklığında bekletildi. Hücreler, birincil antikorlarla gece boyunca 4 ° C'de inkübe edildi (birincil ve ikincil antikor ayrıntıları için Ek Tabloya bakınız) 2) PBST + HS'nin %3'ü. PBS ile yıkandıktan sonra hücreler, oda sıcaklığında 45 dakika boyunca ikincil antikorlarla (Alexa, Life Technologies) inkübe edildi. Çekirdekler DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol; Sigma-Aldrich, kat. F6057) ile boyandı. Görüntüler Zeiss LSM900 Airyscan 2 konfokal mikroskoplarıyla elde edildi. Görüntü analizi Fiji 2.9.0 kullanılarak yapıldı.

RNA izolasyonu, ters transkripsiyon ve kantitatif PCR

Hücresel lizat için RNA, Total RNA Purification Kit (Norgen Biotek, kat. 37500) kullanılarak izole edildi ve tamamlayıcı DNA (cDNA), M-MLV ters transkriptaz (Invitrogen, kat. 500-28025), RNaseOUT (013) kullanılarak 40 ng'den yapıldı. birim/μL), rastgele primerler (200 nM), dNTP'ler (10 mM), Birinci İplik Tamponu 5x, DTT (0.1 M). Zebra balığı larvaları için toplam RNA, fenol-kloroform ekstraksiyonundan yararlanılarak izole edildi. Toplam RNA, standart trizol-kloroform-etanol ekstraksiyon prosedürü için üreticinin talimatları izlenerek TRIzol Reaktifi (Life Technologies, kat. 10) kullanılarak 15596026 hayvandan oluşan havuzlardan izole edildi. RNA çökeltme adımının verimini artırmak için protokol tarafından önerildiği gibi RNaz içermeyen glikojen kullanıldı. 2 μg toplam RNA, Superscript III Ters Transkriptaz (Invitrogen, kat. 18080044) ve oligo(dT)18 primerlerinin (500 μg/mL) bir karışımı kullanılarak cDNA'ya ters kopyalandı; dNTP karışımı (10 mM); DTT (0.1 M); 5x Birinci Şerit Tamponu; RNaseOUT (40 birim/μL).

Gerçek zamanlı PCR için SYBR Green Master karışımı (Bioline, kat. BIO-94020) kullanıldı. Primerler Ek Tabloda ayrıntılı olarak açıklanmıştır 3. Tüm kantitatif PCR için teknik kopyalar gerçekleştirildi. Fare ESC'leri, insan iPSC'leri ve NPC'leri için, ifadeyi normalleştirmek amacıyla endojen kontrol olarak Gapdh ve GAPDH kullanıldı. Zebra balığının Ct ortalaması boşluk, eef1a1l1, tuba1b ve b2m bu genlerin ekspresyon seviyelerine bakıldığında gösterilen değişkenlik nedeniyle normalizasyon için endojen bir temizlik kontrolü olarak kullanıldı. qPCR verileri QuantStudio™ 6&7 Flex Software 1.0 ve 1.3 sürümüyle elde edildi.

RNA dizilimi: Kitaplığın Hazırlanması

Toplam RNA, Qubit 4.0 florimetrik Test (Thermo Fisher Scientific) kullanılarak ölçüldü. Kütüphaneler, NEGEDIA Digital mRNA-seq araştırma sınıfı sıralama hizmeti (Negedia srl) kullanılarak 125 ng toplam RNA'dan hazırlandı.¹⁴⁰ tek uçlu, 6000 döngü stratejisi (Illumina Inc.) kullanan bir NovaSeq 100 sıralama sisteminde kütüphane hazırlığı, kalite değerlendirmesi ve sıralamayı içeriyordu.

Biyoenformatik iş akışı

Ham veriler, kaliteli filtreleme ve düzeltme, referans genomuna hizalama ve gene göre sayma yoluyla bir temizleme adımını içeren Next Generation Diagnostics srl'nin tescilli NEGEDIA Digital mRNA-seq boru hattı tarafından analiz edildi.^142,143. Genler, 5 örnekten en az 3'ünde toplam sayısı 30'in altında olanlar çıkarılarak sıralandı. Bu filtreyi uyguladıktan sonra, daha ileri analizler için dikkate alınan 11,851 eksprese edilmiş gen belirledik.

Diferansiyel ekspresyon analizi, R ortamında (v. 4.1.0) Bioconductor (v. 3.14) ile DESeq2 R paketinden yararlanılarak gerçekleştirildi. (v.1.34.0)¹⁴⁴ ve edgeR (v. 3.36.0)¹⁴⁵. DESeq2, boyut faktörlerinin tahminini, her gen için dağılım tahminini gerçekleştirir ve iki kuyruklu Wald istatistiği ile negatif binom genelleştirilmiş doğrusal modele uyar. DEG'lerin Q128 ve Q15 arasındaki biyolojik önemi (Şekil XNUMX). 1g), Q128_Mtf1 ve Q128 arasındaki DEG'lerin (Ek Şekil XNUMX). 5b) ve kurtarılan genlerin Mtf1 (İncir. 5c), Enrichr yazılımı (v. 3.0) kullanılarak ve Biyolojik Süreçler (BP) (2021) ve Moleküler Fonksiyon (MF) (2021) kategorilerini içeren Gen Ontolojisi (GO) terim zenginleştirme analizi ile araştırıldı.

Hücre popülasyonu çoğalmasının zenginleştirilmesini gerçekleştirmek (GO:0008283 ve¹⁴⁶) ve apoptoz (R-HSA-109581 ve WP1351) Q128 ve Q15 hücre hatlarında aşırı eksprese eden gen imzaları Mtf1Gen Seti Zenginleştirme Analizi (GSEA) yazılımını (v 4.3.2) kullandık¹⁴⁷. Günlüğe dayalı olarak önceden sıralanmış gen seti listeleri oluşturuldu₂ Q128_Mtf1'e karşı Q128 ve Q15_Mtf1'e karşı Q15 arasındaki diferansiyel ifade analiziyle elde edilen kat değişimi (FC) değerleri.

Motif zenginleştirme analizi, Düzenleyici Genomik Araç Kutusu paketindeki Motif Analizi aracı kullanılarak yapıldı (https://reg-gen.readthedocs.io). Mtf1 MRE, Jaspar veri tabanından elde edildi (9. versiyon, http://jaspar.genereg.net/)¹⁴⁸. "Rgt-motifanaliz eşleştirme" komutu, ilgilenilen tüm genlerin promotör bölgesindeki bağlanma bölgelerini aramak için kullanıldı; daha sonra, ilgilenilen gen kümesindeki bağlanma bölgelerinin oranının şans eseri beklenenden daha yüksek olup olmadığını değerlendirmek üzere bir Fisher kesin testi gerçekleştirmek için "rgt-motifanaliz zenginleştirmesi" kullanıldı.

RNA sıralama verilerinin ve Mtf1 MRE'nin temsili bir biyolojik kopyası, Integrated Genomics Viewer'da (IGV v. 2.16.0) parçalar olarak görselleştirildi ve Şekil XNUMX'de gösterildi. 5h.

Volkan grafikleri ve dağılım grafikleri log ile üretildi₂ FC ve -log₁₀ p-ggpubr R paketindeki ggscatter işlevinden yararlanan değer (v. 0.4.0.5). Isı haritaları, pheatmap R paketindeki (v. 1.0.12) pheatmap işleviyle CPM değerleri kullanılarak yapıldı.

Mtf1 ortologlarının hizalanması

The Mtf1 dizi hizalaması Clustal Omega yazılımı (v1.2.4, https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)¹⁴⁹. Diziler arasındaki özdeşlik, Sequence Manipulation Suite programı kullanılarak hesaplandı (https://www.bioinformatics.org/sms2/ident_sim.html).

Metal analizi

48 saatlik kondisyon tedavisinin ardından 10⁷ Q15 ve Q128 hücreleri toplandı, Eppendorf tüplerinde santrifüjlendi, süpernatan çıkarıldı ve hücre peletleri -80 °C'de saklandı. Analizden hemen önce hücreler eritildi ve konsantre HNOXNUMX içerisinde yeniden süspanse edildi.₃ (%68), her numuneye 1 mL eklendi. Tamamen çözündükten sonra, 2 mL ultra saf su ekledik ve numuneyi, yüksek verimli, yüksek basınçlı bir mikrodalga reaktörü (Ultrawave, Milestone, Bergamo, İtalya) kullanarak mikrodalga ısıtma yoluyla tamamen mineralize ettik. Aynı prosedür, şartlandırma işleminden önce ve sonra kültür ortamına da uygulandı. Metallerin kantitasyonu için kalibrasyon eğrileri, sertifikalı çok elementli ve tek elementli standartlardan (Agilent) yararlanılarak farklı konsantrasyonlarda (0.005-0.010-0.025-0.050-0.100-0.200 ppm) altı standart çözelti hazırlanarak elde edildi. Daha sonra tüm numuneler 0.20 µm'lik bir şırınga filtresinden filtrelendi. Bir Argon plazmasında elde edilen numunelerin atomizasyonu ve iyonizasyonu ile metal analizi, İndüktif Eşleşmiş Plazma – Optik Emisyon Spektrometrisi (ICP-OES, mod 5110, Agilent) ile gerçekleştirildi.

Zebra balığı HD modelinin nesli

HD zebra balığı, insanın ilk eksonunu kodlayan mRNA'nın tek hücreli evre embriyolarına mikroenjeksiyonla üretildi HTT 74Q veya 16Q dahil, çerçeve içi eGFP kodlama dizisine birleştirildi. Q74eGFP ve Q16eGFP, in vitro transkripsiyona izin vermek amacıyla pCS2+ plazmitine klonlandı. pCS2_Mtf1 ve pCS2_mCherry plazmitleri de elde etmek için üretildi Mtf1 ve mCherry HD zebra balığı embriyolarına enjeksiyon için kullanılan mRNA'lar.

İn vitro RNA transkripsiyonu için, 2.5 μg pCS2_Q74eGFP, pCS2_Q16eGFP, pCS2_Mtf1 ve pCS2_mCherry, HF-Not I (New England Biolabs, kat. R37S) ile 3189 °C'de gece boyunca sindirim yoluyla doğrusallaştırıldı. Sindirim hacmi daha sonra DNA Clean & Concentrator kiti (Zymo Research, kat. D4003) ile konsantre edildi ve SP6 RNA polimeraz ile başlıklı transkripsiyon reaksiyonu (mMESSAGE mMACHINETM SP1340 Transkripsiyon Kiti, Thermo Fisher Scientific, kat. AM6) için kullanıldı. DNA şablonunun 2238 °C'de 15 dakika boyunca DNase işlemiyle (Thermo Fisher Scientific, kat. AM37) çıkarılmasından sonra RNA, Fenol-Kloroform ekstraksiyonuyla saflaştırıldı ('RNA izolasyonu, ters transkripsiyon ve kantitatif PCR' paragrafında tartışıldığı gibi). RNA, Nanodrop ND-1000 ile ölçülmüş ve daha sonra ihtiyaca göre %10 Danieau tamponu [8 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSXNUMX] karışımı içinde seyreltilmiştir.₄, 0.6 mM Ca(HAYIR₃)₂, 2.5 mM HEPES, pH 7.6], %10 Fenol Kırmızısı (Merck, kat. 1072410025) ve RNaz içermeyen su.

En düşük ölüm düzeyiyle en yüksek malformasyon oranına neden olan enjeksiyon dozunu seçmek için, 74 ila 150 pg/embriyo arasında değişen artan dozlarda Q1000eGFP mRNA enjekte ettik ve fenotipik olarak 24 hpf embriyo puanladık. Bir ışık mikroskobu altında 250 pg/embriyo dozu belirlendikten sonra, embriyolara in vitro kopyalanmış mRNA'lar enjekte edildi. Mikroenjekte edilen embriyolar daha sonra balık suyuna aktarıldı ve 28 °C'de inkübe edildi. Döllenmemiş yumurtalar mikroenjeksiyondan 4 saat sonra tanındı ve atıldı. 24 hpf iribaş, ışık mikroskobu altında özel iğneler kullanılarak koryondan arındırıldı.

Tam montajlı lekeler

Enjekte edilen embriyolara trikain ile anestezi uygulandı ve %1.5 Metilselüloz veya %2 düşük erime noktalı agaroz içerisinde hareketsiz hale getirildi ve bir Leica M165FC floresan mikroskobu kullanılarak analiz edildi. Konfokal zebra balığı görüntüleri Nikon C2 H600L konfokal mikroskopla elde edildi.

Akridin Portakalı hemi (çinko klorür) tuzu in vivo boyama için (Merck, kat. A6014), 24 hpf embriyonun koryonu giderildi, 6 kuyulu bir plakaya aktarıldı ve kuyucuk başına yaklaşık 2 mL Akridin Portakalı (20 μg/mL) içinde inkübe edildi balık suyunda 15°C'de 28 dakika bekletilir. Daha sonra Akridin çözeltisi çıkarıldı ve embriyolar 1 mL balık suyuyla üç kez yıkandı. Bir floresan mikroskobu ile bir cam slayt üzerinde gözlemlenmeden önce iribaşlara Tricaine ile anestezi uygulandı.

TUNEL tahlili için ApopTag Fluorescein In Situ Apoptoz Tespit Kiti (Merck, kat. S7110) ve kolajenaz (Merck, kat. C9891) kullanıldı. Koşul başına mikroenjeksiyondan 7 saat sonra 30 embriyo bir Eppendorf'a yerleştirildi, Tricaine ile anestezi uygulandı ve gece boyunca 4 °C'de %4 paraformaldehid (PFA) içerisinde sabitlendi. Daha sonra PFA çıkarıldı ve numuneler çalkalanarak PBS ile (3 kez, her biri 10 dakika) yıkandı. Embriyolar %10 ile %100 arasında değişen bir dizi metanol solüsyonuyla dehidre edildi ve gece boyunca -20 °C'de donduruldu. Daha sonra embriyolar bir dizi %70-50-30 metanol solüsyonu ile rehidre edildi ve çalkalanarak 20 dakika boyunca Tween-10 içeren PBS ile yıkandı. Bundan sonra kollajenaz, çalkalanarak 8 dakika süreyle uygulandı ve fazlalık, Tween-20 yıkama adımlarıyla (3 kez, her biri 5 dakika) PBS ile yıkandı. Numuneler çalkalanarak dengeleme tamponunda 1 saat süreyle, ardından TdT çalışma gücünde 2°C'de 37 saat süreyle inkübe edildi. Reaksiyon, numunelerin çalışma gücü Durdurma/Yıkama tamponunda iki kez yıkanmasıyla durduruldu. Daha sonra, çalkalanırken Tween-1'li PBS ile 20 saatlik bir bloke etme aşaması yapıldı ve ardından embriyolar, bir Çalışma Gücü anti-digoksigenin konjugat çözeltisi içinde karanlıkta 4°C'de gece boyunca inkübe edildi. Ertesi sabah antikor çözeltisi çıkarıldı, numuneler PBS ile yıkandı (her biri 4 dakika olmak üzere 10 kez) ve eş odaklı bir mikroskopla analiz edildi. Zebra balığı larvalarının ön yapıları, her biri 70 μm'lik 3.475 yığın halinde, tüm derinliklerini kapsayacak şekilde tarandı. Floresan pozitif alanın toplam alan üzerindeki fraksiyonlarını (yumurta sarısı bölgesi hariç) ölçtük. Nicelik analizleri için tüm görüntüler aynı pozlama parametreleriyle elde edildi ve Fiji yazılımı (v2.9.0) kullanılarak işlendi. İstatistiksel analizler Past (v.4.03) ve Prism (v.9.5.0) ile yapılmıştır.

AAV-PHP.eB vektör enjeksiyonu, fare fenotiplemesi ve doku toplama

AAV-PHP.eB viral partikülleri daha önce açıklandığı gibi Broccoli'nin laboratuvarında üretildi ve titre edildi⁷⁵. Bu viral vektör, aday geni Ef-1ɑ promoterinin kontrolü altında eksprese edecek şekilde değiştirildi Mtf1 veya kontrol olarak eGFP'yi kullanın. Vasküler enjeksiyon, kuyruğu ısıtılmış bir oluğa konumlandıran bir sınırlayıcıda gerçekleştirildi. Kuyruğu alkolle silindi ve ardından damardan enjekte edildi. WT ve R6/2 fareleri gruplar halinde randomize edildi ve 4.2 haftalıkken kuyruk damarından enjekte edildi. Enjeksiyonun ardından tüm fareler haftada iki kez tartıldı. Fenotipleme, genotip ve tedaviden habersiz olarak haftada iki kez gerçekleştirildi. Denge ve motor koordinasyonu Rotarod testi ve Yatay Merdiven Görevi ile değerlendirildi. Toplam DNA, Qiagen DNeasy Kan ve Doku Kitleri (QIAGEN, kat. 9504) kullanılarak hayvan dokularından (korteks ve striatum) izole edildi.

Hayvancılık

Tüm Zebra balığı deneyleri Padova Üniversitesi Biyoloji Bölümü Balık Tesisinde gerçekleştirildi. Zebra balığı larvaları, standart prosedürlere göre 60 °C'de nötr pH'ta balık suyuyla (15 mg Instant Ocean, kat. SS10-28, damıtılmış suyun litresi başına) Petri kaplarında en fazla üç gün tutuldu (http://ZFIN.org).

IRCCS Neuromed'de fare kolonileri kuruldu. Transgenik dişi farelerin R6/2 soyunun üreme çiftleri [tür adı: B6CBA-tgN (HDexon1) 62Gpb/1 J] ile -160 ± 10 CAG tekrarlı genişletme, Jackson Laboratories'den satın alındı. Fareler standart koşullar altında barındırıldı (22 ± 1 °C, %60 bağıl nem, 12 saat aydınlık/karanlık programı, 3-4 fare/kafes, yiyecek ve suya serbest erişim). Erkek R6/2 fareleri (5-6 haftalık), koloni bakımı için dişi B6CBA WT fareleri (5-6 haftalık) ile çaprazlandı; elde edilen WT ve R6/2 fareleri bu çalışmada gerçekleştirilen tüm deneylerde kullanıldı. Bu çalışmada kullanılan farelerin yaş, cinsiyet, tedaviler ve ölçümleri gösteren tam listesi Ek Tabloda rapor edilmiştir. 4. Tüm deneysel prosedürler IRCCS Neuromed Hayvan Bakımı İnceleme Kurulu etik kurulu ve Istituto Superiore di Sanità (ISS izin numarası: 548/2022-PR) tarafından onaylandı ve hayvan deneylerine yönelik 2010/63/AB direktifine göre yürütüldü.

Motor davranış testleri

Tüm davranış testleri, aydınlık/karanlık döngüsünün aydınlık aşamasında gerçekleştirildi. Fareler, belirtilen zaman noktalarında tedaviden önce ve sonra test edildi. Eğitim ve testlerden önce farelere test odası ve ekipmana alışma süresi uygulandı. Tüm fareler, motor davranış ölçümlerini gerçekleştirmeden önce her alet ve görev üzerinde art arda iki gün boyunca eğitim aldı. Fareler, 0.1 dakika boyunca bir rotarod aparatı üzerinde sabit hızda (1 rcf) test edildi. Her fare, denemeler arasında 1 dakika dinlenme ile her biri 1 dakikalık ardışık üç denemede test edildi. Üç denemenin her birinde rotarod üzerinde harcanan zamanın ortalaması alınarak, her fare için toplam süre elde edildi. Yatay merdiven görevinde fareler, basamaklar arasında değişken ve düzensiz aralıklar bulunan yatay bir merdiven boyunca kendiliğinden yürüdüler. Her test oturumunda fare performansı, yerleşik bir ayak sesi puanlama sistemi kullanılarak değerlendirildi¹⁵⁰merdiven basamaklarına ön ayak ve arka bacak yerleşiminin niteliksel ve niceliksel olarak değerlendirilmesine olanak tanır. Tüm motor testleri, analizin tamamı boyunca fare genotipi ve deney grubu konusunda kör olan aynı deneyci tarafından gerçekleştirildi.

Kenetleme analizi

Kenetleme puanı 30 saniye üzerinden belirlenir. Özellikle, fareler 50 cm yükseklikten kuyruklarından asıldı ve uzuv kenetleme tepkisi, herhangi bir uzuvun 2 saniyeden fazla bir süre boyunca gövdeye çekilmesi olarak tanımlandı. Şu puanlar kullanıldı: 0 (kenetlemenin olmaması), 0.5 (herhangi bir uzuvun çekilmesi), 1 (herhangi bir iki uzvun çekilmesi), 1.5 (herhangi bir üç uzvun çekilmesi), 2 (dört uzvun tamamının çekilmesi).

Dihidroetidyum (DHE)

WT ve R6/2 fareleri servikal dislokasyonla öldürüldü. Koku alma soğanları ve omurilik çıkarılarak beyinler çıkarıldı ve kesildi. Geriye kalan beyin işlendi ve parafin mumuna gömüldü, bir RM 10 mikrotom (Leica Microsystems) üzerinde 2245 µm'lik koronal kesitler kesildi ve damıtılmış su içeren 40°C'lik bir su banyosunda yüzdürüldü. Kesitler immünohistokimyaya uygun cam slaytlara aktarıldı ve gece boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakıldı. Numuneler 30 dakika boyunca ksilende parafinden arındırıldı, 100 dakika boyunca %10 alkole aktarıldı ve daha sonra her biri 95 dakika boyunca sırasıyla %70, %50 ve %10 alkole bir kez aktarıldı, PBS içerisinde iki kez yıkandı. Yerinde süperoksit üretimi üretimi, DHE (Sigma-Aldrich, kat. D7008) ile floresans yoluyla tespit edildi. Numuneler, ışıktan korunan nemlendirilmiş bir odada 2 °C'de DHE (37 µM) ile 30 dakika süreyle inkübe edildi. Slaytlar iki kez PBS ile durulandı ve mikroskopta gözlendi. Her boyama için deney grubu başına dört fare kullanıldı ve her hayvan için üç koronal kesit Nikon ECLIPSE Ni mikroskobu ile elde edildi ve NIS-Elements Image Software (v. 4.40, Nikon) ve Fiji yazılımı 2.9.0 ile analiz edildi.

mHTT immün boyamayı toplar

WT ve R6/2 fareleri servikal dislokasyonla öldürüldü. Koku alma soğanları ve omurilik çıkarılarak beyinler çıkarıldı ve kesildi. Geri kalan beyin işlendi ve parafin mumuna gömüldü, bir RM 10 mikrotom (Leica Microsystems) üzerinde 2245 µm koronal kesitler kesildi ve damıtılmış su içeren 40°C'lik bir su banyosunda yüzdürüldü. Kesitler immünohistokimyaya uygun cam slaytlara aktarıldı ve gece boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakıldı. Numuneler 30 dakika boyunca ksilende parafinden arındırıldı, 100 dakika boyunca %10 alkole aktarıldı ve daha sonra her biri 95 dakika boyunca sırasıyla %70, %50 ve %10 alkole bir kez aktarıldı, PBS içerisinde iki kez yıkandı. Antijenik epitopun maskesini ortaya çıkarmak için, sitrat tampon yöntemi kullanılarak antijen geri kazanımı gerçekleştirildi (10 mM sitrat tamponu ile, pH 6.0 ile 95-100 °C'de 15 dakika inkübe edin, ardından slaytları 15 dakika soğumaya bırakın). Slaytlar iki kez PBS ile yıkandı, 0.1 dakika boyunca %10 TBS-Triton içerisinde geçirgenleştirildi, daha sonra oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir odada bloklama tamponu (PBS içerisinde %10 At serumu) ile 1 saat süreyle inkübe edildi. Bloklama tamponu çıkarıldı ve slaytlar, bir fare anti-HTT antikoru (klon EM4, ayrıntılar için bkz. Ek Tablo) kullanılarak gece boyunca 48 ° C'de nemlendirilmiş bir odada inkübe edildi. 2). Üç kez PBS ile yıkandıktan sonra hücreler, oda sıcaklığında, ışıktan korunan nemlendirilmiş bir odada 1 saat boyunca ikincil antikorlarla inkübe edildi. Çekirdekler DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol; Sigma-Aldrich, kat. F6057) ile boyandı. Deney grubu başına dört fare kullanıldı ve her hayvan için üç koronal kesit Nikon ECLIPSE Ni mikroskobu ile elde edildi ve NIS-Elements Image Software (v. 4.40, Nikon) ve Fiji yazılımı 2.9.0 ile analiz edildi.

İstatistikler ve tekrarlanabilirlik

Örneklem büyüklüğünü önceden belirlemek için herhangi bir istatistiksel yöntem kullanılmamıştır ancak örneklem büyüklüklerimiz araştırma alanımızda yaygın olarak kullanılanlarla benzerdir. Hiçbir veri analizlerin dışında tutulmadı. Veri dağılımının normal olduğu varsayıldı ancak bu resmi olarak test edilmedi. P- Tekrarlanan ölçümleri içeren deneyler için değerler (Şekil 1). 1c, İncir. 4f, İncir. 7b (ayrıldı), 7c (solda) ve 7g, İncir. 8d, f, Ek Şekil. 1e, Ek Şekil. 4a,c, Ek Şekil. 8c, Ek Şekil. 9c) Bonferroni düzeltmesi ile İki Yönlü Tekrarlanan Ölçüm ANOVA ile hesaplandı. Hücre çizgileri ile yapılan deneyler için, her hücre popülasyonunun bir kısmını rastgele farklı biyolojik kopyalara ayırdık. İmmün boyama ve akış sitometrisi verilerinin analizi için rastgele alanları veya hücrelerin rastgele fraksiyonunu analiz ettik. Diğer türdeki deneyler rastgele seçilmemiştir. Veri toplama ve analiz, deney koşullarına bağlı olarak yapılmamıştır, ancak veri analizleri aynı parametreler ve yazılımla gerçekleştirilmiştir. Fare motor davranışlarının analizi kör olarak yapıldı. Veri temsili ve istatistiksel analizler, aksi belirtilmediği sürece R yazılımı (v. 4.0.0 ve v. 4.1.0) ve PAST (v4.03) kullanılarak yapıldı. Tüm çubuklar, hata çubukları ve kutu grafikleri şekil açıklamalarında tanımlanmıştır. Biyolojik kopyaların ve bağımsız deneylerin sayısı (her ikisi de >2) şekil açıklamalarında belirtilmiştir. Kullanılan istatistiksel testler şekil açıklamalarında belirtilmiştir. Tüm qPCR deneyleri üç teknik kopya ile gerçekleştirildi. Önemli deneysel sonuçlar 2 bağımsız operatör tarafından elde edilmiştir.

Raporlama özeti

Araştırma tasarımı hakkında daha fazla bilgi Doğa Portföyü Raporlama Özeti bu makaleye bağlantılı.

• SEO Destekli İçerik ve Halkla İlişkiler Dağıtımı. Bugün Gücünüzü Artırın.
• PlatoData.Network Dikey Üretken Yapay Zeka. Kendine güç ver. Buradan Erişin.
• PlatoAiStream. Web3 Zekası. Bilgi Genişletildi. Buradan Erişin.
• PlatoESG. Otomotiv / EV'ler, karbon, temiz teknoloji, Enerji, Çevre, Güneş, Atık Yönetimi. Buradan Erişin.
• Blok Ofsetleri. Çevre Dengeleme Sahipliğini Modernleştirme. Buradan Erişin.
• Kaynak: https://www.nature.com/articles/s41467-023-39552-9