Mutasyon NPM1 NPM1'in sitoplazmik sekestrasyonuyla sonuçlanır^C+ benzersiz bir ekspresyon paternini koruyan protein HOXA/B genler ve MEIS1 AML lökomogenezini kolaylaştırmak için kromatin hedef bölgelerine doğrudan bağlanarak onkogen [1,2,3]. Bununla birlikte, altta yatan moleküler mekanizmalar NPM1^C+güdümlü gen düzenleyici ağlar ve lökomogenez belirsizliğini koruyor. Yabani tip (WT) NPM1/NPM1'den beri^C+-CTCF ile ilişkilidir ve CTCF kümesini sabitleyerek CTCF aracılı döngüleri etkileyebilir [4, 5], uzun süredir NPM1'in^C+ mislocalization, CTCF aracılı gen ekspresyonunu değiştirebilir. NPM1'in yanlış yerelleştirilmesinin olup olmadığını test ediyoruz^C+ fare kemik iliği (BM) Lin'i karşılaştıran Hi-C ile sitoplazmaya CTCF aracılı üç boyutlu (3D) topolojik olarak ilişkili alanları (TAD'ler) değiştirir^-cKit⁺ (LK) WT'den saflaştırılmış kök ve progenitörle zenginleştirilmiş hücreler ve NPM1^C+NPM1 için indüklenen -KI hayvanları^C+ 4 aylık ifade (Tablo S1 listelenen kitler, yapılar, hücreler, antikorlar). Koşullu ifade eden fareler NPM1^C+ BM'de genişlemiş dalak, lökositoz ve trombositopeni ile karakterize uzun bir gecikme ile miyeloproliferatif neoplazma/miyelodisplazi benzeri bir durum geliştirir.6, 7]. Bunu doğruladık NPM1^C+ cKI anormal şekilde etkinleştirildi hoca/Hoxb ve meis1 RNA-seq ve ATAC-seq tarafından görüldüğü gibi bir kromatin erişilebilirliği kazancıyla çakışan genler (Şekil XNUMXa). S1A, B) [1, 8] NPM1^C+ ekspresyonu, 46 TAD'lik bir artışa ve 31 TAD'lik bir azalmaya yol açtı (Şekil XNUMX). 1A). Artan TAD'ler, yaklaşık %434'i (18 gen) üzerinde ekspresyonu artan genlerle örtüşen 78 geni kapsıyordu. NPM1^C+RNA-seq ile ölçülen -cKI (Şek. 1B, tepe). Bu örtüşen genler esas olarak NPM1'dir.^C+- transkripsiyonu, ön/arka modellemeyi, homeobox genlerini ve hücre döngüsünü düzenleyen yolaklarda yer alan imza genleri (Şekil XNUMX). 1C, tepe). tarafından güçlendirilmiş en iyi TAD'ler NPM1^C+-cKI dahil hoca/b, ve Pbx3 lokus (Şek. 1D-F). Bu genlerin çoğu, benzersiz NPM1'de özel olarak yer alır.^C+güdümlü lösemik transkripsiyon programı [1, 8]. Buna karşılık, azalan TAD'ler, aşağıdakiler gibi hücre döngüsü kinaz inhibitörlerini (CDKI'ler) içermiştir: Cdkn1a (p21) geni (Şek. 1G). Değiştirilmiş TAD'ler veya alt TAD'ler, halka açık fare CTCF ChIP-seq veri seti (GSM918744) ile entegre ettiğimizde CTCF bağlanması ile tanımlandı; 1D-G, Kırmızı ok başları). Beklendiği gibi, kromatin erişilebilirliği hoca/b ve Pbx3 lokuslar koordineli olarak arttı (Şek. S1B, 1H). NPM1 ışığında^C+ doğrudan CTCF ile etkileşime girer ve kromatin hedeflerine bağlanır [2, 3, 5], NPM1^C+ ve CTCF, NPM1'i yeniden modellemek için koordine edebilir^C+-değişmiş kromatin erişilebilirliği ve onkojenik gen ifade imzaları ile sonuçlanan imza gen TAD'leri.

A Fare BM HS/PC TAD'lerinin üst üste binmesi ve NPM1^C+ WT kullanılarak Hi-C testi ile tanımlanan KI HS/PC TAD'ler ve NPM1^C+ NPM1 olan cKI fare BM LK hücreleri^C+ 8 haftalık hayvanlarda 4 ay süreyle indüklendi. B Arttırılmış veya azaltılmış TAD kapsayan genin ve yukarı regüle edilmiş veya aşağı regüle edilmiş genlerin üzerine RNA sekansı ile örtüşmesi NPM1^C+ Sırasıyla BM HS/PC'lerde KI. C Üst üste binen geliştirilmiş veya azaltılmış TAD kapsayan genin ve üzerine RNA-seq tarafından yukarı regüle edilmiş veya aşağı regüle edilmiş genlerin GO terim analizi NPM1^C+ Sırasıyla BM HS/PC'lerde KI. NPM1^C+ 8 haftalık hayvanlarda 4 ay süreyle indüklendi. D Fare kromozomunun 6 bölgesini içeren Hi-C etkileşimli haritalar hoca WT'yi karşılaştıran lokus ve NPM1^C+ KI fare BM HS/PC'ler. MEL hücrelerinde halka açık CTCF ChIP-seq verileri (GSM918744), Hi-C verileriyle en üste entegre edildi. Not: Değiştirilmiş TAD'lerin veya alt-TAD'lerin (kırmızı ok başları) sınırlarında CTCF bağlanması. E Fare kromozomunun 11 bölgesini içeren Hi-C etkileşimli haritalar Hoxb WT'yi karşılaştıran lokus ve NPM1^C+ KI fare BM HS/PC'ler. MEL hücrelerinde halka açık CTCF ChIP-seq verileri (GSM918744), Hi-C verileriyle en üste entegre edildi. Not: Değiştirilmiş TAD'lerin veya alt-TAD'lerin (kırmızı ok başları) sınırlarında CTCF bağlanması. F Hi-C etkileşim haritası Pbx3 WT'yi karşılaştıran lokus ve NPM1^C+ BM HS/PC'lerde KI. MEL hücrelerinde halka açık CTCF ChIP-seq verileri (GSM918744), Hi-C verileriyle en üste entegre edildi. Not: Değiştirilmiş TAD'lerin veya alt-TAD'lerin (kırmızı ok başları) sınırlarında CTCF bağlanması. G Hi-C etkileşim haritası Cdkn1a WT'yi karşılaştıran lokus ve NPM1^C+ BM HS/PC'lerde KI. MEL hücrelerinde halka açık CTCF ChIP-seq verileri (GSM918744), Hi-C verileriyle en üste entegre edildi. Not: Değiştirilmiş TAD'lerin veya alt-TAD'lerin (kırmızı ok başları) sınırlarında CTCF bağlanması. H ATAC-seq kromatin erişilebilirliği Pbx3 gen lokusu WT'yi karşılaştırdı ve NPM1^C+ BM HS/PC'lerde KI.

Tam boy görüntü

Daha sonra OCI-AML3 hücrelerini vektör bakım WT ile transfekte ettik NPM1 nükleer NPM1'i eski haline getirmek için cDNA (NPM1^OE) veya NPM3'i bloke etmek için OCI-AML50 hücrelerini 1 gün boyunca 1 nM XPO3 inhibitörü (XPO1i), selinexor ile tedavi etti^C+ sitoplazmik dışa aktarma ve nükleer NPM1'in restorasyonunun tersine dönüp dönmediğini test edin NPM1^C+-ilişkili HOX ifade imzası ve TAD oluşumu. İmmünofloresan boyama, XPO1i veya NPM1^OE NPM1'in nükleer lokalizasyonuna neden oldu ve CTCF ile kolokalizasyonunu arttırdı (Şekil XNUMXb). 2A). NPM1'in nükleer tutulması azaltıldı BENİM C, MEIS1, ve HOX gen ekspresyonu, CDKI'ler artarken, CDKN1A ve CDKN2A genler (Şek. 2B), transkriptomik GO analizi ile tutarlı (Şekil XNUMX). S2A, B).

A NPM1 ve CTCF lokalizasyonunun immünofloresan boyaması ve XPO1i tedavisi veya WT NPM1 ekspresyonu üzerine ilişki. Not: Kullanılan NPM1 antikoru hem WT'yi hem de NPM1'i tanıdı^C+ mutant. B RNA-seq analizinin ısı haritası, OCI-AML1 hücrelerinde WT NPM1 aşırı ekspresyonu veya XPO3i tedavisi üzerine yukarı regüle edilmiş ve aşağı regüle edilmiş genleri gösterir. C WT OCI-AML3 hücrelerinden tanımlanan TAD'lerin örtüşmesi ve NPM1^OE Hi-C tahlili ile OCI-AML3 hücreleri. D Arttırılmış veya azaltılmış TAD kapsayan genin ve yukarı regüle edilmiş veya aşağı regüle edilmiş genlerin üzerine RNA sekansı ile örtüşmesi NPM1^OE OCI-AML3 hücrelerinde. E içeren insan kromozomu 6 bölgelerinin bir kısmında Hi-C etkileşimli haritalar CDKN1A WT, XPO1i ile tedavi edilen veya NPM1^OE OCI-AML3 hücreleri. İnsan K562 hücrelerinde halka açık CTCF ChIP-seq verileri, Hi-C verileriyle (GSM1010820) en üste entegre edildi. Not: Değiştirilmiş TAD'lerin veya alt-TAD'lerin (kırmızı ok başları) sınırlarında CTCF bağlanması. F içeren insan kromozomu 9 bölgelerinin bir kısmında Hi-C etkileşimli haritalar CDKN2A/CDNK2B WT'yi karşılaştıran genler, tedavi edilen XPO1i veya NPM1^OE OCI-AML3 hücreleri. G Hi-C etkileşim haritası HOXB WT, XPO1i'yi karşılaştıran lokuslar veya NPM1^OE OCI-AML3 hücreleri. İnsan K562 hücrelerinde halka açık CTCF ChIP-seq verileri, Hi-C verileriyle (GSM1010820) en üste entegre edildi. Not: Değiştirilmiş TAD'lerin veya alt-TAD'lerin (kırmızı ok başları) sınırlarında CTCF bağlanması. H NSG farelerinin hayatta kalması (n = 5) WT ile nakledilen veya NPM1^OE OCI-AML3 hücreleri. Veriler ortalama ± SD olarak sunulur. *p ≤ 0.05; **p ≤ 0.01; ***p ≤ 0.001.

Tam boy görüntü

Daha sonra, WT, XPO1i ile işlenmiş veya NPM1^OE OCI-AML3 hücreleri ve Hi-C verilerimizi K562 hücrelerinde (GSM1010820) oluşturulan mevcut CTCF ChIP-seq profilleriyle entegre etti. NPM1^OE CTCF sınırları tarafından tanımlanan değiştirilmiş 96 TAD. Bunlardan 55 TAD azaltılırken, 41 TAD artırıldı. NPM1^OE (İncir. 2C). Benzer şekilde, XPO1i tedavisi 97 CTCF tanımlı TAD'yi değiştirmiştir (59 azalmış TAD ve 38 artmış TAD, veriler gösterilmemiştir). Transkriptomik verileri, XPO1i ile işlenmiş veya NPM1^OE OCI-AML3 hücreleri. Üzerine NPM1^OE, yukarı regüle edilmiş TAD'lerde bulunan genlerin% 24'ü, RNA-seq tarafından belirlenen transkripsiyonel olarak yukarı regüle edildi (Şekil XNUMXb). 2D, üst) ve ağırlıklı olarak hücre döngüsü, hücre farklılaşması, apoptoz, DNA hasarı ve onarımı ve transkripsiyon düzenlemesinde yer aldılar (Şekil XNUMXa). S2C, sol). Yukarı regüle edilmiş TAD'lerde bulunan genlerin sadece% 2.4'ü transkripsiyonel olarak aşağı regüle edilmiştir (Şekil XNUMXb). S2D, Sol). Öte yandan, azaltılmış TAD'lerin kapsadığı genlerin %16'sı, ekspresyon seviyelerine göre önemli ölçüde aşağı regüle edildi (Şekil XNUMXb). 2D, alt) ve HOX'a dahil olan yollar, kanserdeki yollar, PI3K-AKT sinyali, Wnt sinyali, ERK1/ERK2'nin pozitif regülasyonu, transkripsiyonel regülasyonu, hücre döngüsü ve hücre proliferasyonunun pozitif regülasyonu açısından zenginleştirildi (Şekil XNUMXa). S2C, Sağ). Aşağı regüle edilmiş TAD'lerde bulunan genlerin sadece% 4.5'i transkripsiyonel olarak yukarı regüle edildi (Şekil XNUMXb). S2D, Sağ). XPO1i tedavisi, çok benzer TAD'leri ve transkriptomik değişiklikleri ortaya çıkarır (Şekil XNUMXb). S2E, F). Böylece, NPM1^C+güdümlü TAD değişikliği, NPM1 için kritik olabilir^C+ imza gen ifadesi.

Özellikle, Hi-C verileri, yukarı regüle edilmiş ilk on TAD'nin CDKI'leri kodlayan genleri kapsadığını ortaya çıkardı, p21, p15, p16, ve p27, azaltılmış ilk on TAD, hem XPO1i'de hem de XPOXNUMXi'de HOXB'yi içerirken NPM1^OE (İncir. 2E-G). Bu değiştirilmiş TAD'ler veya alt TAD'ler, K562 hücrelerinden (GSM1010820) CTCF ChIP-seq verileriyle entegre ettiğimizde, CTCF'nin değiştirilmiş TAD'lerin veya alt TAD'lerin sınırlarına bağlandığı CTCF bağlanması ile tanımlanır (Şekil XNUMXb). 2E-G; Kırmızı ok uçları). İlginç bir şekilde, CDKI genleri, LSC proliferasyonu ve hücre döngüsü ilerlemesinin kontrolünde yer alan MYC-MIZ-1 transkripsiyon ekseni tarafından düzenlenir.9].

NPM1 nükleer relokalizasyonunun kısmen genom TAD yeniden yapılanmasını indüklediğini daha fazla desteklemek için, 3, 1, 0, 1, 3 ve 6 saat boyunca XPO24i ile işlenmiş OCI-AML48 hücreleri ile zamana bağlı deneyler yaptık. NPM1'in nükleer lokalizasyonunda önemli bir artış gözlemledik.^C+ WB ile 24 saatlik tedaviden sonra (Şek. S3A) ve immünofloresan boyama (Şek. S3B, C). Zaman kursu 3 C testi, CTCF döngülerinin ön HOXB genlerini kapsadığını ortaya çıkardı (HOXB1-HOXB5) NPM3'i bloke ettikten 1 saat sonra önemli ölçüde bozuldu^C+ sitoplazmik lokalizasyon, CTCF'nin aracılık ettiği ilmekli etkileşimler CEBPA/G NPM1'in bloke edilmesi üzerine genler hemen arttı^C+ sitoplazmik translokasyon (Şek. S3D, Masa S2 tüm primerleri/probları listeledi). Koordineli olarak, CDKI'lerin ifade seviyeleri ve CEBPA genler, yalnızca sırasıyla 24 saat ve 3 gün XPO1i tedavisi üzerine yukarı regüle edildi (Şek. S3E), TAD yeniden düzenlemesinin gen ekspresyonu değişikliklerinden önce geldiğini düşündürür.

MIZ-1'in dahil olmak üzere hedef genlerini aktive ettiği öne sürülmüştür. CDKN1A ve CDKN2B MYC ile transforme edilmiş kanser hücrelerinde NPM1 ve p300 ile ilişki kurarak, MYC ve MIZ-1'in birleşmesi NPM1 ve p300'ü iter ve anormal proliferasyona yol açar [10, 11]. Nükleer NPM1'in restorasyonunun, MIZ-1 transkripsiyon devresini, NPM1 ile etkileşime girme lehine MYC'den ayırarak baskıdan CDKI'lerin aktivasyonuna değiştirip değiştirmediğini de test ettik. MIZ-1 seviyesi, XPO1i tedavisi sonrasında nispeten tutarlı kalsa da veya NPM1^OE, bu müdahaleler, tedavi edilmemiş OCI-AML1 hücrelerine kıyasla çekirdekte NPM1 ile etkileşime giren MIZ-3'i destekledi (Şekil XNUMXb). S4A, alt). Sonuç olarak, MIZ-1 ile ilişkili p300 miktarı artarken, baskı için gerekli olan MYC ile ilişkili bir H1K9-metiltransferaz olan MYC ve G3a'ya bağlanan MIZ-9, NPM1'in nükleer retansiyonu üzerine belirgin şekilde azaldı (Şek. S4A). RT-qPCR ve RNA-seq, birkaç MIZ-1 hedefinin ifadesinin, CDKI ve CEBP genler, önemli ölçüde arttı (Şek. 2B, S3E, S4B). ChIP-qPCR ayrıca, bu lokuslara MYC ve G9a alımının, sabit MIZ-1 kromatin bağlanmasına kıyasla önemli ölçüde azaldığını ortaya çıkardı (Şekil XNUMXb). S4C-E), NPM1 ve p300 alımı, XPO1i tedavisi üzerine önemli ölçüde artarken veya NPM1^OE (İncir. S4F, G). Sonuç olarak, aktif H3K27ac kromatin işaretleri arttı (Şek. S4H) H3K9me2 baskıcı kromatin işaretleri, bu MIZ-1 hedef genlerinde önemli ölçüde azalırken (Şekil XNUMXa). S4I) kontrol IgG ile karşılaştırıldığında (Şek. S4j), Ancak, WT-NPM1 veya NPM1 olup olmadığını ayırt edemiyoruz.^C+ düzenler CDKI ve CEBP NPM1'in nükleer tutulması üzerine genler, çünkü kullanılan antikor her iki formu da tanıdı.

Kullandığımız NPM1 antikoru, WT'yi mutant proteinden ve bunların CDKI ve CEBP gen düzenlemesindeki rolünü ayırt edemese de, WT ve XPO1i ile muamele edilmiş OCI-AML3 hücrelerinin Bru-seq verilerini yakın zamanda yayınlanan verilerden analiz etmek [2] ayrıca yeni ortaya çıkan transkriptlerin CDKN1A ve CEBPA genler, XPO1i tedavisi ile tutarlı bir şekilde geliştirilmiştir (Şekil XNUMXa). S4K), NPM1'in nükleer restorasyonunun anormal TAD topolojisini tersine çevirdiğini ve hücre döngüsü kontrolünü ve miyeloid farklılaşmasını eski haline getirmek için MYC-MIZ-1 eksenini değiştirdiğini destekler. Bununla birlikte, NPM1'in nasıl olacağı henüz belirlenmemiştir.^c+/NPM1, onkogenik ve miyeloid farklılaşma yolunu diferansiyel olarak aktive etmek için farklı kromatin bölgelerine hedeflendi. NPM1'in MIZ-1 ile etkileşime girdiği ve kromatin bağlı CRM1/XPO1'in NPM1'i işe aldığı göz önüne alındığında^C+ üstüne HOX küme [2, 3, 10, 12]. MIZ-1 veya CRM1/XPO1'in NPM1 veya NPM1'i yönlendirdiğinden şüphelenmek mantıklıdır.^C+ sırasıyla amaçlanan kromatin hedeflerine. Ayrıca HOX ile ilişkili lncRNA'lar, SICAK İPUCU ve HOXBLİNC, NPM1'de anormal şekilde etkinleştirildi^C+-NPM1'de de rol oynayabilen AML hücreleri^C+güdümlü onkojenik HOX gen ekspresyonu [8, 13, 14].

Miyeloid TF'ler, CEBPA ve CEBPD ile birlikte CDKI'lerin yukarı regülasyonu ile tutarlı olarak, NPM1'in nükleer retansiyonu, miyeloide özgü yüzey belirteçleri CD3b ve CD11'ün artan ekspresyonu ile görülen OCI-AML14 hücre farklılaşmasını destekledi (Şekil XNUMXb). S5A-C). Ayrıca, NPM1'in nükleer tutulması, S fazındaki hücre ve G1 / M faz geçişindeki hücre pahasına G2 fazındaki hücrelerin oranını tutarlı bir şekilde arttırdı (Şekil XNUMXb). S5D), gelişmiş apoptoz ile çakıştı (Şek. S5E) ve azalmış hücre proliferasyonu (Şek. S5F). Not olarak, XPO1i, OCI-AML3 hücre büyümesini ve farklılaşmasını p53'ten bağımsız bir şekilde bozar [15]. NPM1'in çekirdeklerinde restore edilip edilmediğini daha da test ediyoruz. NPM1^C+ AML hücreleri, lösemogenezi ve AML fare modellerinin in vivo hayatta kalmasını etkiler, 1 x 10 nakledildi⁶ WT, NPM1^OE OCI-AML3 hücreleri NSG farelerine. WT OCI-AML3 hücreleri ile nakledilen tüm hayvanlar, nakilden yaklaşık 38 gün sonra ölürken, OCI-AML3 hücreleri alan fareler, NPM1^OE 54-58 gün arasında hayatta kaldı (Şek. 2H). Bu nedenle, nükleer NPM1 lokalizasyonu, AML'nin bir ksenogreft fare modelinde lösemogenezi hafifletir. NPM1^C+, belki de NPM1'i engelliyor^C+güdümlü TAD topolojisi ve imza gen ifadesi ve hücre döngüsü kontrolünü ve miyeloid farklılaşmasını geri yükleme.

• SEO Destekli İçerik ve Halkla İlişkiler Dağıtımı. Bugün Gücünüzü Artırın.
• PlatoData.Network Dikey Üretken Yapay Zeka. Kendine güç ver. Buradan Erişin.
• PlatoAiStream. Web3 Zekası. Bilgi Genişletildi. Buradan Erişin.
• PlatoESG. Otomotiv / EV'ler, karbon, temiz teknoloji, Enerji, Çevre, Güneş, Atık Yönetimi. Buradan Erişin.
• Blok Ofsetleri. Çevre Dengeleme Sahipliğini Modernleştirme. Buradan Erişin.
• Kaynak: https://www.nature.com/articles/s41375-023-01942-9