Mel-PLGA NP'lerin hazırlanması

Mel-PLGA NP'lerin sentezi için tek adımlı nanoçökeltme-çözücü buharlaştırma yöntemi kullanıldı²⁶. Yirmi mg PLGA (P2191, laktit:glikolit (50:50), mol ağırlığı 30,000–60,000, Sigma Aldrich, ABD) aseton (bir ml) içinde çözüldü; ve iki mg Mel (73-31-4, mol ağırlığı 232.28, Sigma Aldrich, ABD) ilave edildi ve ardından organik fazı oluşturmak için yarım saatlik santrifüjleme yapıldı [%2 (ağırlık/hacim)]. Oluşan organik faz damıtılmış H'ye enjekte edildi.₂O yarım saat boyunca sürekli karıştırılarak; ardından asetonun buharlaştırılması (vakum altında 37°C'de) yapıldı.

Mel-PLGA NP'lerin karakterizasyonu

Üretilen Mel-PLGA NP'ler dondurularak kurutularak elde edildi ve 4°C'de saklandı. Hazırlanan nanopartiküllerin şekli transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile gözlemlendi. Malvern.

Nanopartiküllerin boyutunu ve zeta potansiyelini belirlemek için Zetasizer cihazı kullanıldı.

Mel-PLGA NP'lerin kapsülleme verimliliği (%EE) ve ilaç yüklemesi (%DL)²⁶

Mel-PLGA NP'lerdeki Mel miktarı, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile belirlendi. Burada Mel-PLGA NP'ler aseton içinde çözüldü ve ardından kapsüllenmiş Mel'i serbest bırakmak için ultrason uygulandı. PLGA'yı çökeltmek için çözelti yirmi dakika boyunca 3000 rpm'de santrifüjlendi. Süpernatantta çözünen Mel, NP'lerdeki kapsüllenmiş kütleyi temsil ediyordu. Mel-PLGA NP'lerden Mel salımı, bir ml NP'nin dokuz ml fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.4) ile seyreltilmesiyle belirlendi; ardından 37°C'de çalkalayıcıda inkübasyon yapıldı. 0, 20, 40, 60, 80 ve 100. saatlerde çözeltinin 300 ul'si çıkarıldı (aynı hacimde PBS ile değiştirildi) ve 3000 rpm'de 30 dakika boyunca santrifüjlendi. %EE ve %DL aşağıdaki denklemlerle hesaplandı:

Mel-PLGA NP'lerin in vitro etkileri

Mel-PLGA NP'lerin in vitro antioksidan etkisi ²⁷

Hazırlanan Mel-PLGA NP'lerin antioksidan kapasitesi, 1-difenil-1-pikril hidrazil [DPPH (2, Sigma Aldrich, ABD)] aracılığıyla serbest radikal temizleme etkilerinden değerlendirildi. Basitçe, farklı NP konsantrasyonları (281,689'dan 3.9 μg/ml'ye kadar) bir ml DPPH/etanol çözeltisi (1000 mM) ile karıştırıldı, çalkalandı ve 0.1°C'de 30 dakika beklemeye bırakıldı. Absorbans, referans madde olarak askorbik asit kullanılarak 25 nm'de ölçüldü. DPPH temizleme etkinliği% = [(A₀-A₁)/A₀]× 100. Numune absorbansı A idi₁kontrol reaksiyonu absorbansı A iken₀.

Mel-PLGA NP'lerin in vitro sitotoksisite etkisi

Mel-PLGA NP'lerin kullanımının güvenliği, in vivo kullanılmadan önce in vitro olarak incelenmiştir. Caco2 hücreleri (Sigma Aldrich, ABD), 37 °C'de %5 CO2 ve %95 bağıl nemde, NaHCOXNUMX ile desteklenmiş Dulbecco'nun değiştirilmiş Eagle ortamında (DMEM) kültürlendi.₃ (2.2 g/l), d-glikoz (4.5 g/l), %1 esansiyel olmayan amino asitler, %10 fetal sığır serumu, 100 IU/ml penisilin ve 0.1 mg/ml streptomisin (kültür sürecinde kullanılan tüm materyaller) Sigma Aldrich, ABD'den satın alınmıştır). İn vitro sitotoksisite deneyi Alaa ve arkadaşlarına göre gerçekleştirildi.²⁸. 100 ul/oyuk 10⁵ Doku kültürü plakalarındaki Caco2 hücreleri, hücre tek katmanlarının gelişmesine izin vermek için 37 °C'de 24 saat inkübe edildi. Ortamın boşaltılmasından sonra, tek katmanları yıkamak için bir yıkama ortamı kullanıldı. Mel-PLGA NP'lerin dereceli konsantrasyonları, NP'lerin RPMI ortamıyla birleştirilmesiyle üretildi. Üretilen NP seyreltisi 0.1 ml'ye seyreltildi, oyuklara eklendi ve daha sonra 24 saat daha beklemeye bırakıldı. Gözlere 20 mg/ml konsantrasyonda 3 ul MTT (4,5-(2-dimetiltiazol-2-il)-5-5-difeniltetrazolyum bromür) verildi. MTT karışımını sağlamak için plakalar beş dakika boyunca çalkalandı, ardından dört saat boyunca 37°C'de %5 COXNUMX ile inkübe edildi₂. Geliştirilen formazanın çözünmesi için plakalara 200 µl dimetil sülfoksit (DMSO) uygulandı. 560 nm'de absorbans (doğrudan formazana bağlı olan) ölçüldü.

Mel-PLGA NP'lerin in vitro pıhtılaşma etkisi²⁹

Hazırlanan Mel-PLGA NP'lerin pıhtılaşma aktivitesi, in vivo uygulandığında etkilerini tahmin etmek için test edildi. Mel-PLGA NP'lerin antikoagülan aktivitesi, heparinin kontrol olarak kullanıldığı 37°C'de pıhtılaşma süresinin saniye cinsinden ölçülmesiyle değerlendirildi. Üreticinin tavsiyelerine göre protrombin zamanı (PT) ve kısmi tromboplastin zamanı (PTT) reaktifleri (37°C'de 5 dakika önceden inkübe edilmiş) kullanıldı. Kısaca, sıçan plazması (900 ul) ve çeşitli Mel-PLGA NP konsantrasyonları (100 ul) veya salinde çözünmüş heparin birleştirildi. Test üç kez tamamlanarak pıhtılaşma süresi kaydedildi.

Mel-PLGA NP'lerin in vitro anti-inflamatuar (hemoliz inhibisyonu) etkisi

Mel-PLGA NP'lerin anti-inflamatuar etkisi, Anosike ve arkadaşlarına göre hemoliz inhibisyon testi ile belirlendi..³⁰. Taze sıçan heparinize kanı (5 mi), 2500 rpm'de 15 dakika süreyle santrifüjlendi; bundan sonra, elde edilen pellet izotonik tampon (süpernatan hacmine eşdeğer) ile çözüldü. Farklı dozlarda Mel-PLGA NP'ler (100'den 1000 μg/ml'ye kadar), hipotonik bir çözelti oluşturmak için 5 ml damıtılmış su ile birleştirildi. NP'lerin aynı dozajları izotonik bir çözelti (5 mi) ile birleştirildi; ve indometasin kontrol olarak kullanıldı. NP çözeltileri ve kontrol, üretilen eritrosit süspansiyonundan 0.1 ml aldı; bu daha sonra 37 rpm'de üç dakika santrifüj edilmeden önce 1500 °C'de bir saat süreyle inkübe edildi. 540 nm'de süpernatantta salınan hemoglobini ölçmek için bir spektrofotometre kullanıldı ve hemoliz inhibisyonunun yüzdesi şu formül kullanılarak tahmin edildi: hemoliz inhibisyonu (%) = 1−[(OD_b−OD_a)/(OD_c−OD_a)]× 100. OD_a izotonik bir çözeltide numune absorbansı anlamına geliyordu, OD_b hipotonik bir çözeltide numune emilimi ve OD için_c Hipotonik bir çözeltide absorbansın kontrol edilmesi için.

Hayvanlar ve deney tasarımı

200 g ağırlığında ve sekiz haftalık erkek Sprague Dawley sıçanları, Ulusal İlaç Kontrol ve Araştırma Örgütü'nün (Kahire, Mısır) hayvan evinden satın alındı. Tüm deneysel prosedürler, laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımına ilişkin uluslararası kurallara uygun olarak gerçekleştirildi ve ARRIVE yönergelerine uyuldu. CCL5 kaynaklı karaciğer hasarının tedavisinde NP'lerin etkinliğini test etmek için iki doz Mel-PLGA NP (10 ve 4 mg/kg) in vivo olarak incelendi; ve ayrıca gerekli terapötik dozu bulmak. Ayrıca, deney alt gruplarında iki doz serbest Mel (5 ve 10 mg/kg) kullanılmış ve hazırlanan Mel-PLGA NP'lerin uygulanan Mel miktarını azaltmadaki başarısını kanıtlamak için Mel-PLGA NP'lerin uygulandığı alt gruplarla karşılaştırılmıştır. Sağlıklı kontrol alt grupları, kritik bir karşılaştırma ve istatistiksel analiz elde etmek için CCL4 kaynaklı karaciğer hasarı olan alt gruplar olarak tasarlandı. Bu nedenle hayvanlar, sağlıklı (H) ve CCL4-karaciğer yaralı (I) olmak üzere iki gruba ayrıldı; her grup beş alt gruba ayrıldı (beş sıçan/alt grup):

• Sağlıklı (H) grubu:

  H kontrolü GI: negatif sağlıklı kontrol fareleri.

  H Mel (5 mg/kg) GII: 5 mg/kg Mel alan sağlıklı kontrol fareleri.

  H Mel (10 mg/kg) GIII: 10 mg/kg Mel alan sağlıklı kontrol fareleri.

  H Mel-PLGA NP'leri (5 mg/kg) GIV: 5 mg/kg Mel-PLGA NP alan sağlıklı kontrol sıçanları.

  H Mel-PLGA NP'leri (10 mg/kg) GV: 10 mg/kg Mel-PLGA NP alan sağlıklı kontrol sıçanları.

• CCL4-karaciğer yaralanmalı (I) grup:

  Tedavi edilmemiş GI'yi kontrol ediyorum: CCL4 kaynaklı karaciğer hasarı olan tedavi edilmemiş sıçanlar (pozitif kontrol).

  I Mel (5 mg/kg) GII: 4 mg/kg Mel ile tedavi edilen CCL5 kaynaklı karaciğer hasarına sahip sıçanlar.

  I Mel (10 mg/kg) GIII: 4 mg/kg Mel ile tedavi edilen CCL10 kaynaklı karaciğer hasarına sahip sıçanlar.

  I Mel-PLGA NP'ler (5 mg/kg) GIV: 4 mg/kg Mel-PLGA NP'lerle tedavi edilen CCL5 kaynaklı karaciğer hasarına sahip sıçanlar.

  I Mel-PLGA NP'ler (10 mg/kg) GV: 4 mg/kg Mel-PLGA NP'lerle tedavi edilen CCL10 kaynaklı karaciğer hasarına sahip sıçanlar.

Deney süresi boyunca haftada iki kez intraperitoneal (ip) enjeksiyon yoluyla 0.1 ml zeytinyağı alan sağlıklı sıçanlardan oluşan araç grubuna (VG) ek olarak. CCL4 zeytinyağında çözüldü ve birbirini takip eden dört hafta boyunca haftada iki kez ip yoluyla 0.5 mg/kg'lık bir dozda uygulandı. Karaciğer hasarı indüksiyonundan sonra, Mel veya Mel-PLGA NP'ler dört hafta daha günlük olarak ip yoluyla uygulandı (not: sıçanlar tedavi sırasında CCL4 dozlarını almaya devam etti) (Şekil XNUMX). 1).

Deneysel zaman çizgisi.

Tam boy görüntü

Deneyin sonunda, sıçanlara terminal olarak 50 mg/kg sodyum pentobarbital ile anestezi uygulandı.³¹. Kan örnekleri kalp ponksiyonu yoluyla toplandı. Kanın oda sıcaklığında pıhtılaşmasına izin verildikten sonra, 1500 rpm'de 15 dakika santrifüj edildikten sonra serum toplandı ve kısımlara bölünerek -20°C'de saklandı. Tüm deney gruplarındaki sıçanlar, organ (karaciğer) toplanması için parçalara ayrıldı. Kısaca sıçan diseksiyon tepsisine sırtüstü yerleştirildi ve uzuvları bir bant yardımıyla sabitlendi. Alttaki kasları ortaya çıkarmak için sıçanın derisi kesildi. Karın duvarı soyuldu ve karaciğer dikkatlice çıkarıldı. Tüm deney gruplarından karaciğer örnekleri (bir g), karaciğer homojenatını (%10) hazırlamak için soğuk Tris-HCl tamponu kullanılarak homojenleştirildi.

Serum numunelerinde biyokimyasal analiz

Mel-PLGA NP'lerin hepatoprotektif etkisini değerlendirmek amacıyla karaciğer fonksiyon parametreleri ölçüldü. Aspartat aminotransferaz (AST), alanin transaminaz (ALT), albümin (ab234579, ab263883, ab108789, abcam, ABD) ve toplam bilirubin (MBS9389057, MyBiosource, ABD) seviyeleri Farid ve arkadaşlarına göre sıçan ELISA kitleri ile ölçüldü..²⁷.

Karaciğer dokusu homojenatlarındaki oksidatif stres belirteçleri:

Hazırlanan NP'lerin antioksidan etkisi, in vivo olarak lipit peroksidasyon belirteci malondialdehit (MDA) ve antioksidan enzimlerin ölçülmesiyle belirlendi. MDA (MBS268427, MyBioSource, ABD), GPx (MBS744364, MyBioSource, ABD), SOD (ab285310, ABD) ve CAT (P04762, CUSABIO, ABD) seviyeleri Farid ve arkadaşlarına göre sıçan ELISA kitleri ile ölçüldü.³² ve Amr ve diğerleri.³³.

Karaciğer dokusu homojenatlarındaki sitokin seviyeleri

Mel-PLGA NP'lerin anti-inflamatuar etkisi, pro-inflamatuar sitokinlerin (TNF-a, IL-1β ve IL-6) ve anti-inflamatuar sitokinin (IL-10) seviyesi ölçülerek belirlendi. Sitokin seviyeleri sıçanların karaciğerinde IL-1β (MBS825017, MyBioSource, ABD), TNF-α (ab100785, abcam, UK), IL-6 (P20607, CUSABIO, ABD) ve IL-10 (P29456, CUSABIO, ABD) ile ölçüldü. ABD) Farid ve arkadaşlarına göre sıçan ELISA kitleri.³⁴.

Karaciğer dokusu homojenatlarındaki matriks metaloproteinaz seviyeleri:

Mel-PLGA NP'lerin karaciğer dokusunun yeniden şekillenmesi üzerindeki etkisi, sıçan ELISA kitleri (sırasıyla MBS9 ve MBS1; MyBioSource, ABD) ile MMP722532 ve TIMP2502910 ölçülerek değerlendirildi.

Akış sitometri tekniği

Hazırlanan NP'lerin apoptoz ve hücre içi apoptotik protein seviyeleri üzerindeki etkisini bulmak için akış sitometri tekniği kullanıldı. Hepatosit hücre kültürleri steril koşullar altında üretildi. Anestezi altındaki sıçanların portal veni kollajenaz tamponu ile perfüze edildi. Karaciğer perfüzyondan sonra parçalara ayrıldı, hücreler ayrıldı, William'ın tam ortamında süspanse edildi, bir naylon filtreden (100 um) süzüldü ve daha sonra kültürlendi. Karaciğer hücrelerinde apoptoz düzeyi Annexin-V-FITC/PI apoptoz tespit kiti (ab14085, abcam, ABD) kullanılarak incelendi. Karaciğer hücreleri saponin (pH 7.4) ile geçirgenleştirildi; ve anti-apoptotik protein Bcl2 (11-6992-42) ve pro-apoptotik proteinler [Bax (MA5-14,003), p53 (ab90363), kaspaz 3 (C92-605) ve 8 (ab32125)] akış sitometrisi ile ölçüldü .

Histopatolojik ve immünohistokimyasal inceleme:

Deney grupları arasındaki farklı histopatolojik değişiklikleri değerlendirmek için karaciğer kesitleri sıradan hematoksilen ve eozin boyama yöntemiyle incelendi. Mel-PLGA NP'lerin antiinflamatuar etkisini değerlendirmek için immünohistokimyasal boyama kullanıldı. Karaciğer numuneleri artan alkol seviyeleri kullanılarak dehidre edildi: 70 saat boyunca %1.5 alkol, 90 saat boyunca %1.5 alkol ve 3 saat boyunca mutlak alkol. Karaciğer daha sonra 4 saat boyunca ksilen içerisinde temizlendi. Temizlemenin ardından, karaciğer numuneleri infiltrasyon prosedürüne tabi tutulur ve burada 56 °C'de üç farklı sınıftan (her biri bir saat süren) yumuşak, saf parafin ile emprenye edilir. Numuneler daha sonra bloklar halinde düzenlendi ve 58°C'deki parafin mumuna daldırıldı. Histolojik analiz için 4 mikron kalınlığında parafin dilimleri kesildi, hematoksilen ve eozin ile boyandı, dibütilftalat polistiren ksilen içerisine yerleştirildi ve daha sonra kaplandı.^33,35. İmmünohistokimyasal inceleme için²⁸, H₂O₂ Endojen peroksidaz aktivitesini inhibe etmek için (%3) [ardından PBS yıkaması ve sığır serum albümini (BSA, %60) ile 5 dakikalık bloklama) kullanıldı. Karaciğer bölümleri, birincil antikor [anti-nükleer faktör-kappa beta (NF-кB) p30 antikoru (ab65, abcam, ABD) veya anti-C-Reaktif Protein antikoru (C86299) ile 1688 dakikalık bir inkübasyonun ardından PBS'de yıkandı. , Sigma Aldrich, ABD)]. Yaban turpu peroksidazı (HRP)-tavşan anti-sıçan IgG ikincil antikoru (ab6734, abcam, ABD) karaciğer bölümlerine uygulandı ve 60 dakika boyunca inkübe edildi. Renk gelişimi için 3, 3-diaminobenzidin (DAB) kullanıldı; kahverengi renk, pozitif sonucu ifade ediyordu. Karaciğer kesitleri yıkandı ve daha sonra hematoksilin (%0.1) ile zıt boyandı.

istatistiksel analiz

Veriler ortalama ± SD olarak ifade edildi ve SPSS versiyon 20.0 (SPSS Inc., Chicago, ABD) kullanılarak tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ile araştırıldı. Ortalamalar arasındaki farklar Tukey post hoc testi ile incelendi. Ne zaman P < 0.05, değerler anlamlı kabul edildi.

Etik onayı

Tüm deneysel prosedürler ve hayvan bakımı, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.

• SEO Destekli İçerik ve Halkla İlişkiler Dağıtımı. Bugün Gücünüzü Artırın.
• PlatoData.Network Dikey Üretken Yapay Zeka. Kendine güç ver. Buradan Erişin.
• PlatoAiStream. Web3 Zekası. Bilgi Genişletildi. Buradan Erişin.
• PlatoESG. karbon, temiz teknoloji, Enerji, Çevre, Güneş, Atık Yönetimi. Buradan Erişin.
• PlatoSağlık. Biyoteknoloji ve Klinik Araştırmalar Zekası. Buradan Erişin.
• Kaynak: https://www.nature.com/articles/s41598-023-43546-4