Hücre kültürü

Kahverengi adipositler, daha önce anlatıldığı gibi B. Spiegelman (Harvard Üniversitesi) tarafından sağlanan ölümsüzleştirilmiş kahverengi preadiposit fare hücre hattından farklılaştırıldı.¹⁹. Preadipositler, bir büyüme ortamında (Dulbecco'nun değiştirilmiş Eagle ortamı, yüksek glukoz (Gibco), %50 fetal sığır serumu (Sigma-Aldrich), 20 mM HEPES (Sigma-Aldrich) ile desteklenmiş) düşük birleşme noktasında (<%20) muhafaza edildi ve genişletildi. ve 100 U mi^-1 penisilin-streptomisin (Gibco)). Farklılaşma için, preadipositler iki kez fosfat tamponlu çözelti (PBS) (Gibco, pH 7.4, 1x) ile yıkandı, TrypLE Express ile ayrıştırıldı ve yaklaşık 23,000 hücre cm- yoğunlukta ekildi.^-2 büyüme ortamında. Ortam, 24 saat sonra bir farklılaşma ortamıyla değiştirildi (Dulbecco'nun değiştirilmiş Eagle ortamı, yüksek glukoz, %10 fetal sığır serumu, 20 nM insülin, 1 nM triiyodotironin ve 100 U ml ile desteklendi)^-1 penisilin-streptomisin) ve hücreler 2 gün boyunca kültürlendi. Hücre farklılaşması daha sonra 0.125 gün boyunca bir indüksiyon ortamının (0.5 mM indometasin, 0.5 uM deksametazon ve 2 mM izobütil metilksantin ile desteklenen farklılaşma ortamı) eklenmesiyle indüklendi, ardından ortam iki gün daha farklılaşma ortamına değiştirildi. Farklılaştırılmış adipositler bir kez açlık ortamıyla (Dulbecco'nun değiştirilmiş Eagle ortamı, düşük glikoz (Gibco), 8 mM'lik bir nihai konsantrasyona kadar glikozla takviye edilmiş, % 0.5 sığır serum albümini (Sigma-Aldrich) ve 100 U ml) yıkandı.^-1 penisilin-streptomisin) ve ana metinde belirtilen süreler boyunca açlık ortamında seyreltilmiş insülin NanoRod'lar veya NanoRod'larla tedaviden önce açlık ortamında 2 saat boyunca inkübe edildi. Tedavinin ardından hücreler bir kez PBS'de yıkandı ve immünoblotlar için proteinin veya gen ekspresyonu için RNA'nın izolasyonu için toplandı. DNA-PAINT ile IR analizi için preadipositler, aşağıdaki modifikasyonlarla yukarıda açıklandığı gibi farklılaştırıldı. İndüksiyon ortamı ile muameleden sonra hücreler, TrypLE Express ile ayrıştırıldı ve μ-Slide 18 Well Glass Bottom kuyucuklarına (ibidi) farklılaşma ortamına ekildi. 2 gün sonra hücreler, 2 saat boyunca açlık ortamıyla inkübe edildi, ardından 10 dakika boyunca açlık ortamında 10 nM insülin ile muamele edildi. Kontrol deneylerinde insülin eklenmesi ihmal edildi. Tedaviden önce farklılaşmış adipositler, hücre yüzeyi yoğunluğunu değerlendirmek ve hücrelerin farklılaşmasını değerlendirmek için görsel olarak analiz edildi ve ardından rastgele tedavi ve kontrol gruplarına ayrıldı.

Hücreler %5 COXNUMX içeren nemli bir atmosferde tutuldu, genişletildi ve farklılaştırıldı.₂ 37 °C'de.

IR'nin DNA BOYA'sı

Farklılaşmış adipositler, PBS içerisinde önceden ısıtılmış %12 paraformaldehit ile oda sıcaklığında (RT) 4 dakika süreyle sabitlendi, üç kez PBS ile yıkandı, bir bloklama çözeltisi (%90 fetal sığır serumu/%3.0 Triton X) ile oda sıcaklığında 0.1 dakika süreyle bloke edildi -100 PBS içinde) ve tavşan anti-IR beta antikoru (Hücre Sinyali (4B8; bloklama çözeltisinde 1:300 seyreltme) ile 2 °C'de 4 gün boyunca inkübe edildi. Hücreler daha sonra üç kez PBS ile yıkandı ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca bir bloke edici tampon (Massive Photonics) içerisinde 200:1 seyreltilmiş nanobody FluoTag-XM-QC anti-tavşan IgG (Massive Photonics) ile inkübe edildi. PBS ile üç yıkamanın ardından hücreler, 80 nm altın nanopartikülleri (Sigma-Aldrich; bloklama tamponunda 1:5 seyreltme) ile 10 dakika süreyle inkübe edildi. Hücreler bir kez PBS ile yıkandı ve bir görüntü tamponunda (Massive Photonics) seyreltilmiş 5 nM Cy3b etiketli şeritlerle (Massive Photonics) inkübe edildi.

Görüntüleme, Perfect Focus sistemine (Nikon Instruments) sahip bir Nikon ECLIPSE Ti-E mikroskobu üzerinde, yağa batırılmış bir iLAS2 dairesel toplam dahili yansıma floresans modülü (Gataca Systems) kullanılarak objektif tipte bir toplam dahili yansıma floresans konfigürasyonu uygulanarak gerçekleştirildi. 1.49 sayısal açıklıklı CFI Planı Apo toplam dahili yansıma floresansı ×100 objektif (Nikon Instruments), 1.5 nm'lik son piksel boyutuna karşılık gelen ×87 yardımcı Optovar büyütme ile donatılmıştır. Kullanılan lazer, azaltılmış alan süper çözünürlüklü görüntüleme için optimize edilmiş özel iLas giriş ışın genişletme optiklerine (Cairn) sahip bir OBIS 561 nm LS 150 mW (Tutarlı) idi. Floresan ışık demeti ilk olarak bir uyarma dört bantlı filtre, bir dört bant dikroik filtre ve bir dört bant emisyon filtresini (ZET89901/405/488/561x, ZET640/405/488/561bs ve ZET640) içeren bir filtre küpünden (405, Chroma Technology) geçirildi. /488/561/640m, Chroma Teknolojisi). Floresan ışık daha sonra bir emisyon filtresiyle (ET595/50m, Chroma Technology) spektral olarak filtrelendi ve bir iXon Ultra 888 elektron çoğaltıcı yük bağlantılı cihaz kamerasında (Andor) görüntülendi. Micro-Manager yazılımı v. 1.4, 12,000 MHz okuma çerçevesi, 10 ms pozlama ve elektron çoğaltma kazanımı olmayan 130 çerçeve elde etmek için kullanıldı. Her koşulda üç bağımsız deneyden toplam on hücre görüntülendi (Ek Not ve Ek Şekil. 1).

INS-DNA üretimi ve saflaştırılması

İnsülin (Merck, 1 mg ml^-1) dibenzosiklooktin-sülfo- ile reaksiyona sokulduN690 mM Na içinde -hidroksisüksinimidil ester (DBCO-sülfo-NHS, Click Chemistry Tools; 100 µM)₂CO₃ oda sıcaklığında 11.5 dakika boyunca tampon (pH 20). Reaksiyon daha sonra Tris bazının (Sigma-Aldrich, 5 mM) eklenmesiyle 100 dakika süreyle söndürüldü. Çözelti üç kez 400 ul 100 mM Na ile yıkandı.₂CO₃ 0.5 kDa kesme membranlı (Merck) Amicon Ultra 3 ml santrifüj filtre üniteleri kullanılarak. Her yıkama adımında kolonlar 10×14,000 dakika süreyle döndürüldü.g. Son yıkama adımından sonra insülin-DBCO (690 µM), azidle modifiye edilmiş DNA (Biomers, 35 µM; Ek Tablo) ile karıştırıldı. 3) 100 mM Na'da₂CO₃ ve oda sıcaklığında 3 saat süreyle reaksiyona bırakıldı. Reaksiyon NaN eklenerek söndürüldü₃ (Sigma-Aldrich, 6.9 mM). Numuneler, doğal bir poliakrilamid jel (6x TAE içinde %19 1:1 poliakrilamid, 20 dakika, 200 V, TAE çalıştırma tamponu) üzerinde çalıştırıldı ve INS-'yi doğrulamak için üreticinin talimatlarına göre SYBR Gold (Thermo Fisher) ile boyandı. DNA oluşumu. Görüntüleme ImageQuant LAS 4000 jel görüntüleyici kullanılarak gerçekleştirildi. İnsülin-DBCO-sülfo-NHS konjugasyon protokolü, ssDNA oligo'nun B zincirindeki lizin-29'a (B29 lizin) bağlanmasını, amin gruplarıyla karşılaştırıldığında teşvik edecek şekilde optimize edildi. N insülin A ve B zincirlerinin terminali. B29 amininin pKa değeri, iki aminlerinkinden daha yüksektir. N termini (11.2'ye karşı 8.6 ve 6.8). Yüksek pH'ta, çapraz bağlayıcının NHS grubunun tercihen en bazik amin grubu olan B29 lisin amin ile reaksiyona gireceği tahmin edilmektedir.³². Bu nedenle pH reaksiyon koşulları, tek bir INS-DNA ürününü teşvik edecek şekilde optimize edildi.

INS-DNA reaksiyon karışımları, ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi C ile saflaştırıldı₁₈ sütun (Agilent Poroshell 120 EC-C₁₈) bir Amersham Pharmacia Biotech ÄKTA Ettan LC üzerinde. Tampon A (50 mM trietilamin asetat) ve tampon B (%90 asetonitril ve %10 tampon A), bir gradyan profilinde kullanıldı; burada tampon B yüzdesi, 30 dakika içinde %50'dan %20'ye çıkarıldı. Fraksiyonlar toplandı ve yüksek performanslı sıvı kromatografi tamponlarının uçucu bileşenlerini çıkarmak için bir vakum yoğunlaştırıcıda (Thermo Scientific SpeedVac Savant DNA 120) 30 dakika boyunca yüksek sıcaklıkta döndürüldü. Seçilen zirveler, 0.5 kDa kesme membranına (Merck) sahip Amicon Ultra 3 ml santrifüj filtre üniteleri kullanılarak, 10x'te 14,000 dakika boyunca üç kez döndürülerek PBS'ye tampon değiştirildi.g ve her seferinde 400 ul PBS ile yıkama. Saflaştırılmış fraksiyonların örnekleri, doğal bir poliakrilamid jel üzerinde yürütüldü ve saflaştırılmış INS-DNA'yı görselleştirmek için SYBR Gold (Thermo Fisher) ile boyandı. Konjugatların nihai saflığı her preparat için üç yöntemle analiz edildi: gümüş boyama bandı yoğunluklarının (Pierce Silver Stain Kit) sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (Invitrogen, %4–12 Bolt jel) ile insülin standartlarıyla (Merck) karşılaştırılması. SYBR Altın bant yoğunluğunun, doğal poliakrilamid jel elektroforezindeki DNA standartlarına (Entegre DNA Teknolojileri) ve Qubit ssDNA Test Kiti (Qubit 4 Florimetre, Invitrogen) ile karşılaştırılması. INS-DNA'nın nihai konsantrasyonları, Qubit ssDNA ölçümlerine dayanarak hesaplandı. Saflaştırılmış INS-DNA donduruldu ve bir sonraki kullanıma kadar -20 °C'de saklandı.

NanoRod'ların ve insülin NanoRod'ların üretimi

Origami yapıları, iskele plazmit DNA'sının (p7560, Tilibit, 10 nM) uygun zımba telleriyle (Entegre DNA Teknolojileri, 100 nM) karıştırılmasıyla hazırlandı (Ek Tablolar) 4-9) bir katlama tamponunda (pH 5.0'te 8.5 mM Tris (Sigma-Aldrich), 1.0 mM EDTA (Panreac AppliChem) ve 12.5 mM MgClXNUMX)₂ (Sigma-Aldrich)). Karışım daha sonra bir termosikleyiciye (MJ Research PTC-225 Gradient Thermal Cycler) yerleştirildi ve 80.0 °C'ye 5 dakika ısıtılarak tavlandı, 60.0 dakika boyunca dakikada 1.0 °C'de 20 °C'ye soğutuldu ve ardından yavaşça 20.0 °C'ye soğutuldu. Dakikada 0.5 °C'de °C. Fazla zımbalar, 0.5 kDa kesme membranlı (Merck) Amicon Ultra 100 ml santrifüj filtre üniteleri kullanılarak, 2x'te 14,000 dakika boyunca beş kez döndürülerek çıkarıldı.g ve her seferinde 400 ul katlama tamponu ile yıkama. Saflaştırılmış yapının konsantrasyonu, 260 nm'de DNA absorbansının ölçülmesiyle belirlendi (Thermo Scientific NanoDrop 2000). Daha sonra saflaştırılmış INS-DNA, NanoRod yapısındaki mevcut uzatılmış iplik bağlama bölgelerine 3 kat stokiyometrik fazlalıkta eklendi ve 37.0 saat boyunca 1 °C'ye ısıtılarak ve dakikada 22.0 °C'de 0.1 °C'ye soğutularak bir termodöngücüde tavlandı, 22.0 °C'de 14 saat inkübe edildi ve dakikada 4.0 °C'de 0.1 °C'ye soğutuldu. Bağlanmamış INS-DNA, 0.5 kDa kesme membranına (Merck) sahip Amicon Ultra 100 ml santrifüj filtre birimleri kullanılarak, 2x'te 14,000 dakika boyunca beş kez döndürülerek çıkarıldı.g ve her seferinde 400 µl PBS + 10 mM MgCl ile yıkama₂. İnsülin NanoRod'lar bir sonraki kullanıma kadar 4 °C'de saklandı.

Agaroz jel elektroforezi

NanoRod yapıları, numunelerin 4 V'de 70 saat boyunca buz üzerinde agaroz jelleri üzerinde çalıştırılmasıyla analiz edildi. Jeller, 2x TBE tamponu (Panreac AppliChem) artı 0.5 mM MgCl10 içindeki %XNUMX agarozdan (Thermo Scientific TopVision Agarose) oluşuyordu.₂ (Sigma-Aldrich) ve 1x SYBR Güvenli DNA boyası (Invitrogen). Görüntüleme ImageQuant LAS 4000 jel görüntüleyici kullanılarak gerçekleştirildi.

Dinamik ışık saçılımı

NanoRod ve insülin NanoRod numuneleri PBS + 10 mM MgCl içerisinde hazırlandı₂0.1 µm membranlar (Merck) kullanılarak şırınga filtrelendi ve bir Zetasizer Ultra cihazında (Malvern Panalytical) analiz edildi. Düşük hacimli bir hücrede (ZSU25) 1002 °C'de üç ölçüm yapıldı ve ardından ortalaması alındı.

NanoRod'un oxDNA simülasyonu

NR, NR-1, NR-2, NR-4, NR-7 ve NR-15 yapıları, oxDNA kaba taneli modelleme kullanılarak analiz edildi (https://oxdna.org/). İnsülin birleşme bölgelerinden uzanan dsDNA iplikçiklerine sahip NanoRod yapıları vHelix kullanılarak oluşturuldu ve tacoxDNA web sitesi kullanılarak oxDNA formatına dönüştürüldü (http://tacoxdna.sissa.it/). Yapılar TBMM'ye sunuldu oxDNA.org 37 °C'de simülasyon için web sunucusu, tuz konsantrasyonu olarak 1, 1 × 10⁸ reklamlı zaman adımlarıt 0.0001 değeri ve varsayılan parametrelerle bir ön gevşeme adımı. Simülasyonlar görselleştirildi ve oxView aracı kullanılarak videolar yapıldı (https://oxdna.org/).

Negatif boyama TEM

Saflaştırılmış NanoRod'lar (10 nM), akkor deşarjlı karbon destekli bakır TEM ızgarasına (TEM-CF200CU50, Thermo Fisher Scientific) dağıtıldı ve çözeltiyi çıkarmadan önce 60 saniye boyunca inkübe edildi. Izgaralar daha sonra 10 saniye boyunca 5 ul %2 a/h uranil formatla boyandı ve daha sonra çıkarıldı. Boyama prosedürü yedi kez tekrarlandı ve TEM ızgaraları görüntülemeden önce 30 dakika boyunca havayla kurutuldu. Görüntüleme, yakın alan görünümleri için Talos 120C G2 (120 kV, Ceta-D dedektörü) üzerinde ×92,000'de gerçekleştirildi. Ham görüntüler ImageJ yazılımı (v1.53) kullanılarak işlendi.

AFM

NanoRod yapıları, bir mikroskop lamının merkezine epoksi yapıştırıcı ile tutturulmuş ve Reprorubber kullanılarak slayda tutturulmuş plastik bir halka ile çevrelenmiş bir mika diski üzerinde görüntülendi. Nanoyapılar TE-Mg tamponunda (1 mM Tris bazı, 5 mM EDTA, 1 mM MgCl10) XNUMX nM'ye seyreltildi.₂, pH 8.0) ve 10 ul taze bölünmüş mika üzerine pipetlendi. 30 saniye sonra 4 ul 5 mM NiSO₄ eklendi ve 4.5 dakika daha inkübe edildi. Daha sonra yüzey, 1.0 ml 0.1 µm filtrelenmiş TE-Mg tamponu ile durulandı ve ardından görüntüleme için mika diskine 1.5 ml filtrelenmiş TE-Mg tamponu ilave edildi. Görüntüleme, ac modunda bir Bruker AC3 konsoluna sahip bir JPK Instruments NanoWizard 40 Ultra atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak sıvı içinde gerçekleştirildi.

İnsülin NanoRod nanoyapılarının DNA-PAINT'i

µ-Slide 18 Kuyulu Cam Alt kuyucukları (ibidi) izopropanol ile temizlendi ve N ile kurutuldu₂. Kuyucuklar 1 mg ml ile inkübe edildi^-1 Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca tampon A (100 mM Tris-HCl, 0.05 mM NaCl ve pH 20'da %8.0 (h/h) Tween 5) içindeki biyotin sığır serum albümini (Thermo Fisher), üç kez tampon A ile yıkandı ve ile inkübe edildi. 0.5 mg mi^-1 oda sıcaklığında 5 dakika boyunca tampon A içinde nötravidin (Thermo Fisher). Kuyucuklar daha sonra üç kez tampon A ile yıkandı, ardından tampon B (5 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl) ile üç yıkama yapıldı.₂, 1 mM EDTA ve %0.05 (h/h) Tween 20, pH 8.0). Daha sonra, dört biyotin etiketli DNA ipliğini içeren 500 pM NanoRod'lar (Genişletilmiş Veri Şekil XNUMX). 2a), 9-nükleotid PAINT yerleştirme sekansı içeren INS-DNA ile (DS1; Ek Tablo) 3), her kuyucuğa 5 dakika süreyle eklendi. Kuyucuklar üç kez tampon B ile yıkandı. Daha sonra 1 nM Atto-647N görüntüleyici ipliği (IS1; Ek Tablo) 10) oksijen tutucular (protokateşuik asit (Sigma), protokateşuat 3,4-dioksijenaz (Sigma) ve Trolox (Sigma)) ile takviye edilmiş tampon B içindeki her bir oyuğa ilave edildi. Çift değişimli PAINT için üç yerleştirme sırası (DS2; Ek Tablo) 10) NanoRod'ların her iki ucuna da eklendi. Numuneler daha önce tarif edildiği gibi hazırlandı; kuyucuklar, her görüntüleme alımı arasında on kez tampon B ile yıkandı. Her görüntüleme edinimi farklı bir Atto-647N görüntüleyici dizisi (IS1 ve IS2; Ek Tablo) ile yapıldı. 10). Micro-Manager yazılımı, 9,000 MHz okuma çerçevesi, 10 ms pozlama ve elektron çoğaltma kazancı olmayan 200 çerçeve elde etmek için kullanıldı (Ek Not ve Ek Şekiller. 2 ve 3).

SPR

SPR deneylerini gerçekleştirmek için bir Biacore T200 cihazı (Cytiva) kullanıldı ve veriler, Biacore T200 sistem kontrol yazılımı v. 2.01 kullanılarak elde edildi. Biyotinlenmiş ECD-IR (Nordic BioSite), bir streptavidin Sensor Chip SA (Cytiva) üzerinde immobilize edildi. Çalıştırma tamponu olarak HBS-P+ tamponu (Cytiva) kullanıldı. ECD-IR'nin immobilizasyonundan sonra stabil bir taban çizgisine ulaşmak için 15 dakikalık bir stabilizasyon süresi uygulandı. NR-1, NR-2, NR-4, NR-7, NR-15, NR-8 ve NR-8dsDNA, çalıştırma tamponuna 11.4 nM insülin konsantrasyonunda enjekte edildi. İnsülin ve INS-DNA, analiz edilebilecek bir bağlanma eğrisi elde etmek için minimum konsantrasyon olan 55 nM'de enjekte edildi. NR, insülin NanoRod enjeksiyonlarında kullanılan en yüksek NanoRod konsantrasyonuna (NR-1 = 11.4 nM) eşit bir konsantrasyonda negatif kontrol olarak enjekte edildi. Alternatif olarak, NR-2, NR-4, NR-7 ve NR-15, 5.7 nM nanoyapı konsantrasyonunda enjekte edildi (Genişletilmiş Veri Şekil XNUMX). 4e) ve NR-7^K-PEG ayrıca 50 nM konsantrasyonda insülin enjekte edildi (Genişletilmiş Veri Şekil XNUMX). 9c). Her numunenin enjeksiyonu, 180 saniyelik bir birleşme aşaması ve 300 saniyelik bir ayrışma aşaması kullanılarak gerçekleştirildi. Ayrışma denge sabiti (K_D), birleşme oranı sabiti (k_on) ve ayrışma hızı sabiti (k_kapalı) BIAevaluation 3.0 yazılımı kullanılarak belirlendi. t_1/2 Kalış süresini tanımlayan değerler ln2/ formülü kullanılarak belirlendi.k_kapalı. NR-7 yapılarının IR ve IGF1R arasındaki bağlanmasını karşılaştırmak için, ECD-IR ve ECD-IGF1R proteinleri (Nordic BioSite), üreticinin talimatlarına göre amin birleştirme reaksiyonları yoluyla bir CM5 sensör çipinin iki farklı akış hücresi üzerinde immobilize edildi. İnsülin ve INS-DNA'nın bağlanması, tek döngülü kinetik modda çalışma tamponuna (HBS-P+) farklı konsantrasyonlarda insülin (6.2, 18.5, 55.6, 166.7 ve 500.0 nM) enjekte edilerek test edildi. 140 s ve 300 s'lik bir ayrışma aşaması. NR-7'nin bağlanması, 11.4 saniyelik bir birleşme fazı ve 180 saniyelik bir ayrışma fazı kullanılarak tek bir yapı konsantrasyonu (300 nM insülin) enjekte edilerek test edildi.

Coomassie jeli

Burada 0.5 ug rekombinant ECD-IR (Nordic BioSite), Laemmli numune tamponunda (Bio-Rad) yeniden süspanse edildi. İndirgeme koşulları için, %2'lik nihai konsantrasyona kadar 2.5-merkaptoetanol ilave edildi. Numuneler 80 °C'de 10 dakika süreyle denatüre edildi, sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi ile çözüldü ve GelCode Blue güvenli protein boyası (Thermo Fisher Scientific) ile boyandı.

Jel kaydırma deneyi

7 nM'deki NanoRod'lar (NR ve NR-20), insan IR'nin 300 nM rekombinant hücre dışı alanı (Nordic BioSite) veya PBS ile 30 °C'de 4 dakika boyunca inkübe edildi. Numuneler daha sonra %2 agaroz jel üzerinde çalıştırıldı ve SYBR Safe ile boyandı.

Immunoblotting

Hücreler PBS ile yıkandı, proteaz ve fosfataz inhibitör kokteyli (Thermo Fisher Scientific) ile desteklenmiş radyoimmünopresipitasyon tahlil tamponunda (Sigma-Aldrich) parçalandı ve 30 dakika boyunca çalkalanarak buz üzerinde inkübe edildi. Lizat santrifüjleme yoluyla temizlendi (20,000x)g 20 °C'de 4 dakika boyunca) ve protein lizatlarının miktarı Bradford protein tahlili (Bio-Rad) kullanılarak belirlendi. Protein lizatları, %2.5 2-merkaptoetanol içeren Laemmli örnek tamponunda (Bio-Rad) yeniden süspanse edildi, 80 ° C'de 10 dakika boyunca denatüre edildi, sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi ile çözüldü ve poliviniliden florür membranlara aktarıldı. Membranlar, bir bloklama çözeltisi (%1 Tween 0.1 (TBST) ve %20 yağsız kuru süt ile Tris tamponlu salin) içinde 5.0 saat inkübe edildi, ardından fosfo-IR beta/IGF4R'ye karşı birincil antikorlarla 1 °C'de gece boyunca inkübasyon yapıldı. beta (CST 3024, 1:1,000), fosfo-AKT-S473 (CST 4058, 1:1,000) veya GAPDH (Invitrogen PA1-987, 1:5,000). TBST ile üç yıkamanın ardından membranlar, yaban turpu-peroksidaz konjuge sekonder antikorlarla (Invitrogen, 31460, 1:5,000) oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edildi. Yaban turpu peroksidazının tespiti, bir ChemiDoc Görüntüleme Sistemi (Bio-Rad) üzerinde kemilüminesan substrat Immobilon Forte ile gerçekleştirildi. Band densiometrisi ImageJ yazılımı kullanılarak yapıldı.

Akış sitometrisi

Farklılaştırılmış, serumsuz adipositler yukarıda açıklandığı gibi hazırlandı. Adipositler daha sonra iki kez Hanks'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ile yıkandı ve kollajenaz D çözeltisi (1.5 U ml) içerisinde ayrıştırıldı.^-1 kollajenaz D (Roche) ve 10 mM CaClXNUMX₂ HBSS içinde) 20 °C'de 37 dakika süreyle. Hücreler HBSS içerisinde yeniden süspanse edildi, 35 µm HBSS ile dengelenmiş bir hücre süzgecinden (BD Biosciences) filtrelendi, 300x'te topaklandıg 5 dakika süreyle bekletildi ve bir boyama tamponunda (1x PBS ve %1 sığır serum albümini) yeniden süspanse edildi. Ölü hücreler, üreticinin talimatlarına göre CANLI/ÖLÜ Sabitlenebilir Sarı Ölü Hücre Leke Kiti (Thermo Fisher Scientific) ile etiketlendi ve ardından hücre süspansiyonu 300x'te peletlendi.g 5 dakika süreyle bekletildi ve boyama tamponunda yeniden süspanse edildi. Burada ~100,000 hücre, 10 ul'lik nihai hacimde 647 nM ATTO-100 etiketli NanoRod yapılarıyla 10 °C'de 37 dakika süreyle inkübe edildi. NanoRod yapıları olmadan inkübe edilen hücreler, işlenmemiş kontrol olarak kullanıldı. Hücreler daha sonra 300x'te santrifüjleme yoluyla boyama tamponu ile iki kez yıkandı.g 5 dakika boyunca Akış sitometri ölçümleri, BD FACSDIVA yazılımı v. 9.0 (BD Biosciences) içeren bir BD FACSCANTO II üzerinde gerçekleştirilmiştir. Canlı adiposit hücreleri başlangıçta AmCyan-A'ya karşı FSC-A'daki hücrelerin kapatılmasıyla tanımlandı, ardından teklileri tespit etmek için FSC-A'ya karşı FSC-H'ye geçiş yapıldı. Elde edilen veriler FlowJo 10.7.1 yazılımı (BD Biosciences) kullanılarak analiz edildi. Muamele edilmemiş kontrole normalizasyondan sonra floresans yoğunluğunun geometrik ortalaması, NanoRod'lar tarafından hücre etiketleme derecesini tanımlamak için kullanıldı.

RNA-seq kütüphanesinin hazırlanması ve sıralaması

Toplam RNA, Quick-RNA Microprep Plus Kiti (Zymo Research) kullanılarak farklılaştırılmış adipositlerden izole edildi ve üreticinin düşük numune protokolüne göre TruSeq RNA Kütüphanesi Hazırlama Kiti v500 kullanılarak mRNA-seq kütüphanesinin hazırlanması için 2 ng saflaştırılmış RNA kullanıldı. Kütüphane nicelemesi, bir Varioskan LUX çok modlu mikroplaka okuyucu (Thermo Fisher) üzerinde üreticinin çok oyuklu plaka protokolüne göre QuantiFluor dsDNA sistemi (Promega) kullanılarak gerçekleştirildi. Kütüphane boyutu ve kalitesi Bioanalyser 2100 ve Yüksek Hassasiyetli DNA Kiti (Agilent) kullanılarak değerlendirildi. Kütüphaneler, NextSeq standart normalizasyon protokolü (Illumina) kullanılarak denatüre edildi ve seyreltildi ve sıralama, NextSeq 1 platformunda NextSeq 75/500 Yüksek Çıkış Kiti v. 550 (2.5 döngü) ile tek uçlu okumalar (75 x 550 bp) kullanılarak gerçekleştirildi ( Illumina).

RNA-seq ölçümü, DEG analizi ve GSEA

Sıralama okumaları bir referans transkriptomuna karşı haritalandı kas protein kodlayan transkript dizileri (M29, GRCm39 salınımı; https://www.gencodegenes.org/mouse/) ve Somon 1.7.0 (ref. ³³). Sayım tabloları tximport paketi kullanılarak oluşturuldu³⁴ ve DEG listeleri DESeq2 paketi (v. 1.34.0) kullanılarak elde edildi.³⁵, burada yalnızca ayarlanmış genler var P 0.001'e eşit veya altında değerler ve bir günlük₂Daha ileri analizler için ±0.58'deki kat değişim kesme noktası dikkate alındı. Isı haritaları ve UpSet grafikleri, ComplexHeatmap (v. 2.10.0) kullanılarak oluşturuldu³⁶. Hem Gen Ontolojisi terimleri hem de KEGG yolları ile biyolojik süreçler için GSEA, ClusterProfiler'a girdi olarak sıralanmış bir gen listesi kullanılarak gerçekleştirildi (v. 4.2.2)³⁷ ve yanlış keşif oranına göre ayarlanmış bir değerin önemi P sırasıyla 0.10 ve 0.05'in altındaki değerler.

Zebra balığı mikroenjeksiyonları ve serbest glikoz ölçümü

NanoRod ve insülin NanoRod'lar oligolizin-PEG (K) ile karıştırıldı.₁₀-PEG_5K, Alamanda Polimerleri) K'deki lizin aminleri arasında 1:1 oranında₁₀-PEG_5K ve DNA'daki fosfatlar³⁰ve her zebra balığı larvasına 30 nl numunenin mikro enjeksiyonundan önce 2 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edildi. Enjeksiyon numuneleri, kaplanmış NanoRod numuneleri için 100 nM yapı nihai konsantrasyonunda ve kaplanmış insülin NanoRod numuneleri için 100 nM insülin nihai konsantrasyonunda (NR-100.0 için 14.3 ve 1 nM NanoRod'lara karşılık gelir) hazırlandı.^K-PEG ve NR-7^K-PEG, sırasıyla). Zebra balığı larvalarına 1 nM konsantrasyonda 100 nl insan insülini enjeksiyonunun, serbest glikoz seviyelerinde bir azalmaya ve insülin sinyallemesi ile tutarlı transkripsiyonel değişikliklere neden olduğu gösterilmiştir.³⁸. Bu nedenle, serbest glikoz seviyeleri üzerinde insülinin aracılık ettiği etkileri değerlendirmek için tahlillerimizde 2 nl 100 nM insülin konsantrasyonu enjekte ettik. 2 dpf zebra balığı için toplam kan hacmi 60-89 nl olduğundan (ref. ³⁹), bizim analizlerimizde enjekte edilen insülinin tahmini konsantrasyonu 2-3 nM civarında olacaktır. Bu analizlerde, enjekte edilen numune miktarı açısından da sınırlıydık, daha yüksek enjeksiyon seviyeleri (3 ve 4 nl) larvaların hayatta kalmasına neden oluyordu.

Zebra balığının bakımı ve melezlenmesi (D.rerio) hatlar, Stockholms djurförsöksetiska nämnd tarafından onaylanan hayvan refahı düzenlemelerine ilişkin İsveç mevzuatına uygun olarak yürütülmüştür. β-hücre ablasyonu ve serbest glikoz tahlili deneyleri için yalnızca 5 günden küçük hayvanlar kullanıldığından, 2010/63/AB'ye göre herhangi bir etik izin gerekmemektedir. Kullanılan zebra balığı transgenik hatları daha önce açıklanmıştır; Tg(ins:CFP-NTR)^s892 (Ref. ²⁷) Ve Tg(ins:Kaede)^s949 (Ref. ²⁸).

β-hücrelerinin ablasyonu iki günlükken gerçekleştirildi Tg(ins:CFP-NTR) Ve Tg(ins:CFP-NTR);Tg(ins:Kaede) embriyolar, 10 saat boyunca 1 mM 3-fenil-0.2-tiyoüre (PTU, Acros Organics) ile desteklenmiş bir yumurta suyu çözeltisinde (E1) %2 DMSO (VWR) içerisinde seyreltilmiş 24 mM MTZ (Sigma-Aldrich) ile işlenerek. β hücresi ablasyonunu takiben, üç günlük Tg(ins:CFP-NTR) larvalara (72 hpf) %0.01 tricain içinde anestezi uygulandı ve ortak kardinal damara (Cuvier kanalı) 2 nl 1x PBS, değiştirilmemiş insülin veya kaplanmış NanoRod/insülin NanoRod'lar enjekte edildi.⁴⁰. Mikroenjeksiyon işleminin görselleştirilmesine ve başarıyla enjekte edilen larvaların belirlenmesine yardımcı olmak için PBS, insülin veya kaplı insülin NanoRod örneklerine %0.1'lik nihai konsantrasyona kadar fenol kırmızısı (Sigma-Aldrich) eklenmiştir. Zebra balığı larvaları tedavi gruplarına rastgele atandı. Serbest glikoz seviyeleri başka bir yerde açıklandığı gibi ölçüldü⁴¹ floresans bazlı bir enzimatik kit (BioVision) kullanılarak. Koşul/kopya başına üç ila altı enjekte edilen larvadan oluşan gruplar kullanıldı.

Konfokal görüntüleme

Tg(ins:CFP-NTR);Tg(ins:Kaede)-ablated larvalar, ablasyon tedavisinden 24 saat sonra toplandı, anestezi uygulandı ve daha önce belirtilen protokole göre enjekte edildi ve β hücre sayılarını konfokal görüntüleme ile analiz etmeden önce %4 paraformaldehit solüsyonunda sabitlendi. Konfokal görüntüler bir Leica TCS SP8 mikroskobu ve LAS X yazılımı (v. 3.5.5.19976) ile elde edildi. β hücreli ablasyonun birincil pankreas adacıkları Tg(ins:CFP-NTR);Tg(ins:Kaede) larvalar ×40 suya daldırma hedefiyle tarandı ve z yığınlar Fiji yazılımı (v1.53) kullanılarak analiz edildi. Görüntülenen tüm görüntüler aynı deneyden elde edildi ve kontrast değerleri görselleştirme amacıyla ayarlandı. β-hücrelerinin miktarının belirlenmesi, orijinal değiştirilmemiş görüntüler üzerinde gerçekleştirildi.

istatistiksel analiz

Örneklem boyutlarını önceden belirlemek için hiçbir istatistiksel yöntem kullanılmadı ancak örnek boyutları önceki yayınlarda bildirilenlere benzerdi.^28,38,42. Hücre kültürü örnekleri ve hayvanlar rastgele kontrol ve tedavi gruplarına atandı. Veri toplama ve analiz, deneylerin koşullarına bakılmaksızın gerçekleştirilmedi. Çoğu grafik için ayrı veri noktaları çizilir. Örnek boyut (n) deneysel biyolojik tekrarların sayısı ve kullanılan istatistiksel yöntemler ilgili şekil açıklamalarında belirtilmiştir. Veri kümeleri Gauss dağılımı açısından test edildi ve ardından uygun istatistiksel test uygulandı. Verilerin istatistiksel analizi ve grafiksel gösterimi GraphPad Prism 9.4.0 ile işlendi. Kontrol ve insülinle tedavi edilen hücreler arasındaki küme özelliklerini karşılaştırmak için iki kuyruklu Mann-Whitney testi yapıldı. Western blot niceliklendirmeleri için, tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından Dunnett'in çoklu karşılaştırma testi gerçekleştirildi. β hücrelerinin miktarının belirlenmesi için Kruskal-Wallis testi ve ardından Dunn'ın çoklu karşılaştırma testi uygulandı. Serbest glikoz değerlerinin analizi, Tukey çoklu karşılaştırma testi ile tek yönlü ANOVA kullanılarak gerçekleştirildi.

Raporlama özeti

Araştırma tasarımı hakkında daha fazla bilgi Doğa Portföyü Raporlama Özeti bu makaleye bağlantılı.

• SEO Destekli İçerik ve Halkla İlişkiler Dağıtımı. Bugün Gücünüzü Artırın.
• PlatoData.Network Dikey Üretken Yapay Zeka. Kendine güç ver. Buradan Erişin.
• PlatoAiStream. Web3 Zekası. Bilgi Genişletildi. Buradan Erişin.
• PlatoESG. karbon, temiz teknoloji, Enerji, Çevre, Güneş, Atık Yönetimi. Buradan Erişin.
• PlatoSağlık. Biyoteknoloji ve Klinik Araştırmalar Zekası. Buradan Erişin.
• Kaynak: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01507-y