Malzeme hazırlama ve karakterizasyonu

Sulu GO çözeltisi, 0.15 mg ml elde etmek için deiyonize su içerisinde seyreltildi.^-1 çözelti ve vakum, 0.025 µm'lik gözeneklere sahip bir nitroselüloz membrandan filtrelenerek ince bir GO filmi oluşturulur. Daha sonra ince film, deiyonize su içinde ıslak transfer ve ayrıca 100°C'de 2 dakika süreyle termal tavlama kullanılarak hedef substrata aktarıldı. GO film-substrat yığını, EGNITE oluşturmak üzere standart bir otoklavda 134 saat boyunca 3 °C'de hidrotermal olarak indirgendi. EGNITE'in tüm karakterizasyon çalışmaları için temel substrat bir kareydi (1 x 1 cm)²) Si / SiO₂ (400 mikron/1 mikron).

XPS

XPS ölçümleri bir Phoibos 150 analizörü (SPECS) ile ultra yüksek vakum koşullarında (temel basınç, 5 x 10^-10 mbar) monokromatik bir Al Ka ​​X-ışını kaynağı (1,486.74 eV) ile. Genel bakış spektrumları, 50 eV geçiş enerjisi ve 1 eV adım büyüklüğü ile elde edildi ve yüksek çözünürlüklü spektrumlar, 20 eV geçiş enerjisi ve 0.05 eV adım büyüklüğü ile elde edildi. Bu son koşullardaki genel çözünürlük, Ag 0.58'ün maksimum yarısında tam genişliğin ölçülmesiyle belirlendiği üzere 3 eV'dir.d5/2 zirve püskürtme gümüş. XPS analizi, C–O zirvesinin (epoksit gruplarıyla ilişkili) hidrotermal işleminden sonra güçlü bir düşüş olduğunu, ancak hidroksiller, karboniller ve karboksillerden dolayı C–OH, C=O ve C(O)OH'nin küçük bir katkısını gösterir. azaltıldıktan sonra kalır. O1'in ters evrişimis zirve bu davranışı doğruluyor. C1'e ana katkıs Ancak hidrotermal indirgemeden sonraki sinyal sp² melezleştirilmiş C–C yörüngeleri^34,57.

X-ışını difraksiyon

X-ışını kırınım ölçümleri (θ-2θ tarama) bir Malzeme Araştırma Difraktometresinde (Malvern PANalytical) gerçekleştirildi. Bu difraktometrenin yatay bir özelliği vardır. ω-2θ dört daire geometrisinde gonyometre (320 mm yarıçap) ve Cu Ka anotlu seramik bir X-ışını tüpüyle çalıştı (λ = 1.540598 Å). Kullanılan dedektör, Medipix2 teknolojisine dayanan hızlı bir X-ışını dedektörü olan Pixcel'dir.

Raman spektroskopisi

Raman spektroskopisi ölçümleri, 488 nm lazer uyarım hattıyla donatılmış bir Witec spektrografı kullanılarak yapıldı. Ölçümler için Raman spektrumları, 50x objektif ve nm başına 600 oluk ızgarası kullanılarak elde edildi; Numunenin ısınmasını önlemek için lazer gücü 1.5 mW'ın altında tutuldu.

TEM

EGNITE örneğinin kesit çalışması için Helios NanoLab DualBeam (LMA-INA) ile odaklanmış bir iyon ışını lameli hazırlandı. Yapısal analizler, HRTEM ve yüksek açılı halka şeklindeki karanlık alan STEM tekniklerini içeren, 20 kV'de çalıştırılan bir Tecnai F200 mikroskobu kullanılarak TEM aracılığıyla gerçekleştirildi. STEM-EELS deneyi, 20 KeV'de çalışan, 200 mm açıklık, 5 mm kamera uzunluğu, 30 mrad yakınsama açısı ve 12.7 mrad toplama açısına sahip bir Tecnai F87.6 mikroskobunda gerçekleştirildi. Çekirdek kaybı kazanımında başlangıç ​​enerjisi olarak piksel başına 0.5 eV ve 250 eV kullandığımızdan, 1,839 eV'de beklenen Si K-kenarını, 2,122 eV'de Pt M-kenarını ve 2,206 eV'de Au M-kenarını elde edemedik. 100 eV. Göreceli C–O atom bileşimi, dikkatimizi indirgenmiş GO katmanına odaklayarak ve analiz edilen kenarların (bizim durumumuzda C ve O) toplamının %XNUMX olduğu varsayılarak elde edilmiştir. Bu varsayım bizim durumumuzda da kanıtlandığı gibi geçerlidir. Ek bilgi haritalar. Enerji diferansiyel kesiti Hartree-Slater modeli kullanılarak ve arka plan ise düşük güç modeli kullanılarak hesaplandı.

Elektiriksel iletkenlik

Elektriksel iletkenlik ölçümleri, iki nokta konfigürasyonunda bir Keithley 2400 kaynak ölçer kullanılarak yapıldı. Ölçülen numuneler 1 × 1 cm EGNITE filmlerinden oluşuyordu² bir SiO'nun üstünde₂ alt-tabaka.

Veri analizi

X-ışını kırınımı, Raman ve XPS verileri Python 3.7 paketleri (Numpy, Pandas, Scipy, Xrdtools, Lmfit, Rampy, Peakutils, Matplotlib) kullanılarak analiz edildi. Düzlemler arasındaki mesafe, Snell yasasına göre X-ışını kırınım ölçümlerinden hesaplandı. Veriler uzaysal alana taşındığında, zirvelerin maksimumu yerleştirildi. Karşılık gelen mesafe, düzlemler arasındaki mesafenin ortalama değerini verdi. Bu ortalama değerlerden sapmalar, uzaysal alandaki zirvelerin Lorentzian uyumlarının maksimum yarı genişliğindeki tam genişliğinden hesaplandı. XPS ve Raman spektroskopisi ölçümleri, karşılık gelen özellikler için beklenen konumlara tepe noktalarının bir evrişiminin yerleştirilmesiyle analiz edildi. GO ve EGNITE'in iletkenlik değerleri uygun hale getirilerek elde edildi. I-V Elektriksel iletkenlik ölçümlerinde ölçülen eğriler Ohm kanununa göre belirlenir. Veriler n = 1 her ölçüm için.

Esnek dizi üretimi

Cihazların imalatı Ek Şekil 2'de gösterilmektedir. 4. Cihazlar 4 inç Si/SiO üzerinde üretildi₂ (400 μm/1 μm) gofretler. İlk olarak, 10 µm kalınlığında bir PI (PI-2611, HD MicroSystems) tabakası, gofret üzerine döndürülerek kaplandı ve nitrojen açısından zengin bir atmosferde 350°C'de 30 dakika süreyle pişirildi. Metalik izler, ters görüntü fotorezistinin (AZ5214, Microchemicals) optik litografisi kullanılarak desenlendi. 20 nm titanyum ve 200 nm altın biriktirmek için elektron ışını buharlaştırması kullanıldı ve kaldırma gerçekleştirildi. Elektrokimyasal performans ile dizi esnekliği arasında bir denge sağlamak için yaklaşık 1 mikron kalınlığında bir EGNITE filmi kullandık. GO filmini aktardıktan sonra, alüminyum e-ışını buharlaştırıldı ve gelecekteki mikroelektrotların üstündeki alanlar, negatif bir fotorezist (nLOF 2070, Mikrokimyasallar) kullanılarak tanımlandı ve havalandı. Daha sonra, GO filmi, 5 W'de 500 dakika boyunca oksijen reaktif iyon aşındırma (RIE) kullanılarak gelecekteki mikro elektrotlar dışında her yere kazındı ve koruyucu alüminyum sütunlar, seyreltilmiş bir fosforik ve nitrik asit çözeltisiyle kazındı. Daha sonra, 3 µm kalınlığında bir PI-2611 tabakası gofretin üzerine çöktürüldü ve daha önce anlatıldığı gibi pişirildi. Daha sonra mikroelektrot üzerindeki PI-2611 açıklıkları, sonraki oksijen RIE'si için maske görevi gören pozitif kalın bir fotorezist (AZ9260, Microchemicals) kullanılarak tanımlandı. Daha sonra cihazlar yine AZ9260 fotorezist ve RIE kullanılarak PI katmanı üzerinde desenlendi. Fotorezist katman daha sonra aseton içerisinde çıkarıldı ve levha, izopropil alkol içerisinde temizlendi ve kurutuldu. Son olarak cihazlar levhadan çıkarıldı ve standart bir otoklavda 134 °C'de 3  saat boyunca hidrotermal olarak işleme tabi tutulmak üzere sterilizasyon poşetlerine yerleştirilmeye hazırdı.

Mikroelektrot elektrokimyasal karakterizasyonu

Mikroelektrotların elektrokimyasal karakterizasyonu, pH 128'te 1 mM fosfat tamponu, 4417 mM NaCl ve 10 mM KCl içeren 137x PBS (Sigma-Aldrich, P2.7) içindeki Metrohm Autolab PGSTAT7.4N potansiyostat ile ve üç elektrotlu bir konfigürasyon kullanılarak gerçekleştirildi. Referans olarak bir Ag/AgCl elektrodu (FlexRef, WPI) kullanıldı ve karşı elektrot olarak bir platin tel (Alfa Aesar, 45093) kullanıldı.

Performans değerlendirmesinden önce elektrotlara 10,000 yük dengeli darbe (1 ms, 15 μA) uygulandı. Elektrotların 100 mV s'de 0.9 döngüsel voltametri döngüsüyle (−0.8 ila +50 V) devam eden sürekli darbeli protokollere maruz bırakılması^-1, 20 darbenin (5,000 ms) 1 tekrarı ve açık devre potansiyelinin yeniden belirlenmesi.

Veri analizi

Elektrokimyasal karakterizasyon verileri Python 3.7 paketleri (Numpy, Pandas, Scipy, Pyeis, Lmfit, Matplotlib) kullanılarak analiz edildi. Empedans spektroskopisi verileri, bir dirençten oluşan eşdeğer bir elektrik modeline yerleştirildi (R) sabit bir faz elemanı (CPE) ile seri olarak bağlanır. Buradan, CPE değeri bir kapasitansa yaklaştırıldı ve EGNITE'in arayüzey kapasitansı için eşdeğer bir değer elde etmek üzere mikroelektrot geometrik alanına bölündü. Mikroelektrot yük depolama kapasitansı (CSC), ölçülen akımın katodik ve anodik rejimlerinin entegre edilmesi ve tarama hızıyla normalleştirilmesi yoluyla döngüsel voltametri ölçümlerinden hesaplandı. EGNITE'in 100 mV tarama hızında katodik ve anodik yük depolama kapasitansı (cCSC ve aCSC) 45.9 ± 2.4 ve 34.6 ± 2.8 mC cm'dir^-2, sırasıyla (n = 3). Diğer malzemeler için bildirildiği gibi⁵⁸elde edilen CSC'ler tarama hızına bağlıdır (Ek Şekil 1). 5). Oksijen indirgeme reaksiyonlarının varlığını değerlendirmek için CV dalga formunu nitrojenle temizlenmiş elektrolit altında ölçtük⁵⁹ ve dalga biçiminde önemli farklılıklar gözlemlemedi (Ek Şekil 1). 6). Ancak sonuçlarımız, oksijen indirgeme reaksiyonlarının EGNITE'in şarj enjeksiyon kapasitesi üzerindeki etkisini tam olarak ele almamaktadır ve bunun doğru şekilde araştırılması için ek çalışmaların yapılması gerekmektedir. Mikroelektrot yük enjeksiyon kapasitesi (CIC), elektrot elektrokimyasal su penceresine (katodik için -0.9 V ve Ag/AgCl'ye karşı anodik için +0.8 V) uyan bir voltaj farkı ortaya çıkaran (ohmik düşüşün giderilmesinden sonra) mevcut darbe genliğinin belirlenmesiyle oluşturulmuştur. ) (Ek Şek. 17)⁶⁰.

istatistiksel analiz

Veriler ortalama ± s.d.'dir, n = 18 EIS için ve n Kronopotansiyometriler için = 3. Katodik kapasitif voltaj gezinim haritasının verileri, her darbe şekli için bir olaya yönelik katodik kapasitif voltaj gezilerinin ortalamasıdır. n = 3 elektrot.

Mekanik stabilite değerlendirmesi

Ultrason sonikasyonu

EGNITE elektrot dizileri, ultrasonik su banyosundaki (Elmasonic P 180H) suyla doldurulmuş bir kabın içine yerleştirildi. Sonikasyon, 37 W'de 15  dakika süreyle 200 kHz'de uygulandı ve ardından güç 15 W'a yükseltilmiş olarak 37 kHz'de ilave 300 dakika sonikasyon uygulandı. Elektrotların görüntüleri, sonikasyon adımlarından önce ve sonra elde edildi.

Bükme testi

Bükme düzeni (Şek. 2k) üç silindirik çubuktan oluşuyordu; ortadaki (çap, 700 µm) aşağıya doğru indirilerek 131°'lik bükülme açıları oluşturuldu. Bükme testi için üç esnek mikroelektrot dizisi kullanıldı. Her dizi, 18 µm çapında 50 mikroelektrot içeriyordu. İki dizi 10 ve 20 döngüden sonra ölçülürken, bir cihaz ölçüm sonrası kullanım sırasında hasar gördüğü için yalnızca 10 döngü boyunca ölçüldü. Bükme testi döngüsü, 10 saniyelik bir yük uygulamasından ve yüksüz 10 saniyeden oluşuyordu. Cihazlar, 10 ve 20 bükme döngüsünden önce ve sonra elektrokimyasal olarak karakterize edildi (EIS ve CV).

Epikortikal sinir kaydı

Epikortikal implantasyon

Tüm deneysel prosedürler, Avrupa Topluluğu Konseyi'nin tavsiyelerine ve laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımına ilişkin Fransız mevzuatına uygun olarak gerçekleştirildi. Protokoller Grenoble etik komitesi (ComEth) tarafından onaylandı ve Fransız bakanlığı tarafından yetkilendirildi (numara 04815.02). Sprague-Dawley sıçanları (erkek, 4 aylık, ağırlıkta) -Yaklaşık 600 g) ketamin (kg başına 50 mg (vücut ağırlığı)) ve ksilazin (kg başına 10 mg (vücut ağırlığı)) ile kas içinden anestezi uygulandı ve daha sonra stereotaksik bir tutucuya sabitlendi. Temporal kafatasının çıkarılması işitsel korteksi açığa çıkardı. Kortikal dokuya zarar vermemek için dura mater korundu. Referans elektrodunu yerleştirmek için tepe noktasında bir delik açıldı ve toprak elektrodunu yerleştirmek için birinciden 7 mm öne doğru ikinci bir delik açıldı. Elektrotlar, entegre devre soketleri için kullanılan 0.5 mm kalınlığındaki pimlerdi. Dura mater ile elektriksel temas kuracak şekilde yerleştirildiler ve diş çimentosu ile kafatasına sabitlendiler. Daha sonra yüzey mikroelektrot şeridini Şekil XNUMX'de gösterildiği gibi işitsel kortekse monte ettik. 3b. Damar desenleri, Krieg'in sıçan beyni haritasının 41. alanındaki işitsel korteksi tanımlıyor. Kortikal sinyaller eş zamanlı olarak 1,000 kazançla güçlendirildi ve 33 kHz örnekleme hızında dijitalleştirildi. Bir farenin kulağının 20 cm önünde, açıkta kalan korteksin kontralateralindeki bir hoparlör, akustik uyarılar verdi. İletilen uyaranlar, kulağın yakınına yerleştirilen ve ses basıncı seviyesinde (dB SPL re 0.25 μPa) sunulan 4939 inçlik bir mikrofon (Brüel & Kjaer, 20) tarafından izlendi. 80 dB SPL'de alternatif tıklamalarla ve 70 dB SPL'de 5 ila 40 kHz arasında değişen frekanslarda, 5 ms'lik bir yükselme ve düşme süresiyle ton patlaması uyaranlarıyla uyarılan tepe pozitif (negatif-yukarı) orta gecikme yanıtlarını inceliyoruz ve 200 ms'lik bir süre.

Veri analizi

Elektrofizyolojik veriler Python 3.7 paketleri (Numpy, Pandas, Scipy, Neo, Elephant, Sklearn Matplotlib) ve PhyREC özel kütüphanesi (https://github.com/aguimera/PhyREC). r.m.s. değerler 20 Hz'nin üzerindeki frekanslarda 200 ms'lik kayan pencereyle hesaplandı. Spektrogramlar 70 Hz ile 1.1 kHz arasındaki bir aralık için hesaplandı. PSD, 60 saniyelik sürekli kayıtlar üzerinden hesaplandı. Belirli bir elektrot dizisi için iki PSD hesaplandı: in vivo (IV) ve ölüm sonrası (PM). SNR, dB (20 × ln(r.m.s.(IV)/r.m.s.(PM))) cinsinden ifade edilir ve 20 Hz ile 10 kHz arasında logaritmik olarak aralıklandırılmış 1 nokta için enterpolasyon yapılır.

istatistiksel analiz

Şekil 2'de sunulan epikortikal nöral veriler. 3 tek bir hayvan üzerinde yapılan bireysel ölçümlerden alınmıştır. İncirde. 3c64 elektrottan elde edilen veriler sunulmaktadır. İncirde. 3d, seçilen iki elektrottan gelen veriler sunulmaktadır. İncirde. 3f, PSD ve SNR 64 EGNITE elektrotundan hesaplanır ve ortalama ± s.d olarak gösterilir. Ek Şekil XNUMX'de. 12c, d medyan veriler 192 EGNITE elektrotu için sunulmuştur. n = 3 deney ve 60 platin elektrot n = 1 deney.

İntrakortikal sinir kaydı

İntrakortikal implantasyon

Hayvanlara bir ketamin/ksilazin karışımı (75:1, 0.35 ml/28 gr ip) ile anestezi uygulandı ve bu durum %1.5 izofluran sağlayan bir inhalasyon maskesi ile muhafaza edildi. İmplantı sabitlemek için kafatasına birkaç mikro vida yerleştirildi ve beyinciğin tepesindeki vida genel bir zemin olarak kullanıldı. Prob prefrontal kortekse implante edildi (koordinatlar: AP, 1.5 mm; ML, ±0.5 mm; DV, bregma'dan -1.7 mm). İmplantasyon, geçici prob sertliği sağlamak ve probun yerleştirilmesini kolaylaştırmak için probun maltoz ile kaplanması (aşağıdaki protokole bakınız) yoluyla gerçekleştirildi. Prob diş çimentosu ile kapatıldı. Probu minyatür bir kablo aracılığıyla elektrofizyolojik sisteme bağlamak için TDT-ZifClip konektörleri kullanıldı. Ameliyattan sonra fareye, analjezi (buprenorfin) ve antiinflamatuar (meloksikam) tedavileri uygulanarak 1 haftalık bir iyileşme süresi uygulandı. Sinirsel aktivite, çok kanallı Open Ephys sistemi ile bir Intan RHD30 amplifikatörü ile 2132 kHz örnekleme hızında kaydedildi. İşitsel görev deneyleri, daha önce açıklanan çalışmaya dayanan protokoller kullanılarak, içinde iki hoparlör bulunan, ses geçirmez bir kutuda gerçekleştirildi.⁶¹. Ses uyaranı, her biri 15 saniye (uyaran arası aralık) ile ayrılmış, 100 kez (döngü) tekrarlanan, 5 ms uzunluğunda bir beyaz gürültü tıklamasından oluşuyordu. Görev sırasında hayvan serbestçe hareket edebildi.

Maltoz sertleştirici protokolü

Sulu bir maltoz çözeltisi cam geçiş noktasına kadar ısıtılır (T_g), 130 ila 160 °C arasında, sıcak bir plaka veya mikrodalga kullanılarak. Maltoz viskoz hale geldiğinde probun arka tarafı yalnızca maltozla temas ettirilir. Maltoz soğudukça probu sertleştirir ve sertleştirir.

Veri analizi

Her elektrottan gelen sinir sinyalleri, SUA ve LFP'leri çıkarmak için çevrimdışı olarak filtrelendi. SUA, sinyalin 450 ila 6,000 Hz arasında filtrelenmesiyle tahmin edildi ve tek tek nöronlardan gelen ani yükselişler, Çevrimdışı Sıralayıcı v.4 (Plexon) ile temel bileşen analizi kullanılarak sıralandı. LFP'leri elde etmek için sinyaller 1 kHz'e alt örneklendi, trendi kaldırıldı ve Python'da özel olarak yazılmış komut dosyalarıyla gürültü hattı artefaktlarını (50 Hz ve harmonikleri) ortadan kaldırmak için çentik filtrelendi. AEP SNR, tepe N1 genliğinin ve sd'nin oranı olarak hesaplandı. uyarandan önceki 20 ms'lik bir sürenin.

istatistiksel analiz

Şekil 2'de gösterilen veriler. 3 saat, ben ortalama ± s.d., n = 30, ortalama deneme sayısı olarak. Aynı elektrottan kaydedilen veriler 30, 60 ve 90. günlerde gösterilmektedir. Tek bir hayvandan elde edilen veriler sunulmaktadır.

Kronik epikortikal biyouyumluluk

Cihazların cerrahi implantasyonu

Bu çalışma için toplam 27 yetişkin, erkek, Sprague-Dawley sıçanı kullanıldı (Charles River). Hayvanlar, 21 ± 2 °C ortam sıcaklığında ve %40–50 nem oranında, 12 saat aydınlık/12 saat karanlık döngüsünde barındırıldı. Sıçanlar gruplar halinde barındırıldı ve deney süresi boyunca diyet ve suya ücretsiz erişimleri sağlandı. Deneysel prosedürler, Birleşik Krallık İçişleri Bakanlığı'nın ve yerel hayvan refahı etik inceleme kuruluşunun (AWERB) onayı altında, Hayvan Refahı Yasası'na (1998) uygun olarak gerçekleştirildi. Hayvanlara ameliyat süresince izofluran (%2-3) ile anestezi uygulandı ve anestezi derinliği ayak parmağı sıkıştırma refleks testi ile izlendi. Hayvanlar, vücut ısısını korumak için termal bir battaniyenin üzerine yerleştirilmiş stereotaksik bir çerçeveye (Kopf, 900LS) yerleştirildi. Bir kraniyotomi deliği (-5 mm ×4 mm), 1 mm çapak matkap ucuna sahip bir diş matkabı kullanılarak orta hattan 0.9 mm uzakta yapıldı, dura çıkarıldı ve epikortikal cihaz beynin kortikal yüzeyine yerleştirildi. Kraniyotomi deliği Kwik-sil ile kapatıldı, ardından diş çimentosu uygulandı ve cilt dikildi. Kaybedilen sıvıların yerine konması ve ameliyat sonrası ağrının azaltılması için deri altı salin enjeksiyonları (kg başına 1 ml (vücut ağırlığı)) ve buprenorfin (kg başına 0.03 mg (vücut ağırlığı)) verildi ve anestezi geri çekildi.

Doku toplama ve işleme

Hayvanlar, gerçekleştirilecek analiz türüne uygun bir yöntemle implantasyondan 2, 6 veya 12 hafta sonra sonlandırıldı.

Histoloji ve immünohistokimya

İmplantasyondan 2, 6 veya 12 hafta sonra sıçanlar, heparinize (10 U ml) ile kardiyak perfüzyon yoluyla sonlandırıldı.^-1, Sigma-Aldrich) PBS, ardından PBS içinde %4 paraformaldehit (PFA, Sigma-Aldrich). Beyinler 4 saat süreyle %24 PFA'da sonradan sabitlendi, ardından izopentan içinde dondurulmadan önce en az 30 saat süreyle PBS içindeki %48 sakkaroza aktarıldı. Beyinler daha sonra 80 μm'de kriyokesit yapılana kadar -25 °C'de saklandı. Doku daha sonra mikroglial aktivasyon düzeyini belirlemek amacıyla iyonize kalsiyum bağlayıcı adaptör molekülü 1 (Iba-1) için boyandı. Kısaca doku kesitleri, birincil antikor anti-Iba-5 (0.1:1, 4-1; Wako) ile 1°C'de gece boyunca inkübasyondan önce 1,000 saat süreyle %019 Triton-X içeren PBS içindeki %19741 keçi serumu ile bloke edildi. Kesitler daha sonra ikincil antikor, anti-tavşan Alexa Fluor 594 (1:400, A-11012; Thermo Fisher) ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca boyandı. Slaytlar, 4,6-diamidino-2-fenilindol (Thermo Fisher) içeren Prolong Gold solmayı önleyici montaj ortamı kullanılarak lamellerle monte edildi. Prob 3 × 3.7 mm’lik bir alanı kapsıyordu² beynin kortikal yüzeyinde; Boyama için seçilen doku kesitleri bu bölgenin uzunluğunu 3.2 mm kapladı. Slaytlar, 3DHistech Pannoramic-250 mikroskop slayt tarayıcısı kullanılarak 20x'te görüntülendi ve görüntüler CaseViewer v.2.4 (3DHistech) kullanılarak analiz edildi. Mikroglia aktivasyonunu değerlendirmek için 3.2 mm'lik bir alan kaplandı ve her 100 µm'de bir görüntü analiz edildi. Epikortikal prob alanının, beynin orta hattından 8.5 mm uzaklıkta, doğrudan prob bölgesinin altındaki alanı kapsayan bir bölümünü detaylandıran görüntüler 3x büyütmede alınmıştır.

Görüntü işleme

Mikroskopi verileri, mikroglia fenotip karakterizasyonu için bir algoritma kullanılarak görüntü ile işlendi (Ek Şekil 1). 13). Mikroglial aktivasyonu özel bir CellProfiler* (Broad Institute, v.3.1.9) kullanılarak analiz edildi. https://cellprofiler.org/) boru hattı. İlk olarak, EnhanceOrSuppressFeatures modülü, tüplülük geliştirme yöntemini uygulayarak nöritler gibi filamentli yapıları geliştirmek için kullanıldı. Geliştirilmiş görüntülerden hücreler, TanımlamaPrimaryObjects modülü kullanılarak bölümlere ayrıldı. Hücrelerin ön ölçümleri, uygun nesne çapı aralığının 3-40 piksel olduğunu gösterdi. Bu çap aralığının dışında kalan veya görüntünün kenarına temas eden nesneler atıldı. Hücreler, 50 piksellik uyarlanabilir pencere boyutuna sahip iki sınıflı bir Otsu uyarlanabilir eşikleme stratejisi kullanılarak bölümlere ayrıldı. TanımlamaPrimaryObjects modülü tarafından tanımlanan nesneler, hücre sınıflandırması için gerekli özellikleri hesaplamak üzere MeasureObjectSizeShape modülüne girdi olarak verildi. ClassifyObjects modülünde, sınıflandırmaların temel alınacağı kategori AreaShape olarak belirtildi ve karşılık gelen ölçüm olarak Extent seçildi. Hücreler şu şekilde sınıflandırıldı: 'Hücrenin kapladığı alanın, sınırlayıcı kutunun kapladığı alana oranı olan Extent özelliğine göre etkinleştirilmiş' veya 'etkinleştirilmemiş'. Bu sınıflandırma yaklaşımı, aktifleştirilmiş mikrogliaların büyük hücre gövdelerine sahip olması ve hiçbir süreç içermemesi ve dolayısıyla sınırlayıcı kutularının etkinleştirilmemiş benzerlerine göre çok daha büyük bir kısmını işgal etmesi gerçeğiyle rasyonelleştirildi. Son olarak, istenilen istatistikleri hesaplamak ve çıktısını almak için CalculateMath ve ExportToSpreadsheet modülleri kullanıldı.

istatistiksel analiz

Veri setleri n = 3 her cihaz tipi için (yalnızca PI implant (PI); açıkta mikrofabrik altın (altın) içeren PI ve tüm zaman noktalarında mikrofabrik altın ve EGNITE (EGNITE) içeren PI) 6 haftalık altın haricinde n = 2 ELISA verileri için. Kontralateral hemisferler her zaman noktasında birleştirildi. n = 9, implantasyondan sonraki 2 ve 12. haftalarda ve n = 8, implantasyondan 6 hafta sonra. Verilerin analizi GraphPad Prism v.8 yazılımı kullanılarak yapıldı. İstatistiksel analiz, uygun olduğu yerde Tukey'in çoklu karşılaştırma testiyle birlikte iki yönlü bir varyans analizi (ANOVA) kullanılarak tamamlandı; P < 0.05 anlamlı olarak kabul edildi.

ELISA

İmplantasyon periyodunun ardından hayvanlar servikal dislokasyonla sonlandırıldı. Beyin dokusu beynin hem sağ hem de sol yarıküresinden çıkarıldı, sıvı nitrojende anında donduruldu ve bir sonraki kullanıma kadar -80 °C'de saklandı. Doku, proteaz ve fosfataz inhibitörü (Halt Proteaz ve Fosfataz İnhibitör Kokteyli, Thermo Fisher) içeren NP-40 liziz tamponu (150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, %1 Nonidet P40 ikamesi, Fluka, pH 7.4'e ayarlanmış) kullanılarak parçalandı. ardından dokunun mekanik olarak parçalanması gelir (TissueLyser LT, Qiagen). Numuneler daha sonra 10 rpm'de 5,000 dakika süreyle santrifüjlendi ve süpernatan, bir sonraki kullanıma kadar 4°C'de saklandı. Boncuk bazlı multipleks ELISA kiti olan LEGENDplex Sıçan Enflamasyon Paneli (katalog numarası 740401, BioLegend), aşağıdaki sitokinlerin miktarını belirlemek için çalıştırıldı; IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-17A, IL-18, IL-33, CXCL1 (KC), CCL2 (MCP-1), granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör, interferon-γ ve tümör nekroz faktörü. Kit, üreticinin talimatlarına göre, 15 µl sabit hacimde protein yüklenerek çalıştırıldı. Süpernatan ile inkübasyonun ardından boncuklar bir BD FACSVerse akış sitometresinde çalıştırıldı ve veriler LEGENDplex veri analizi yazılımı kullanılarak analiz edildi.

Sinirsel uyarım

İntrafasiküler implantasyon

Tüm hayvan deneyleri, Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi 2010/63/EU'ya uygun olarak Universitat Autònoma de Barcelona Etik Kurulu tarafından onaylandı. Hayvanlar, 22 ± 2 °C'de, 12 saat aydınlık/12 saat karanlık döngüsü altında, yiyecek ve suyun serbestçe temin edilebileceği şekilde barındırıldı. Anestezi uygulanmış dişi Sprague-Dawley sıçanlarının siyatik siniri (250–300 g, -18 haftalık) cerrahi olarak açığa çıkarıldı ve TIME elektrotları, 10-0 ilmekli bir ipliğe tutturulmuş düz bir iğne yardımıyla siyatik sinir boyunca enine şekilde implante edildi.⁴⁶. Sinir fasikülleri içindeki aktif bölgelerin doğru pozisyonunu sağlamak için süreç bir diseksiyon mikroskobu altında izlendi (Şekil 1). 4b). Deneyler sırasında hayvanın vücut sıcaklığı bir ısıtma yastığıyla muhafaza edildi.

Sinir stimülasyonu, farklı EGNITE aracılığıyla 100 s (Stimülatör DS0, Digitimer) boyunca 150 Hz'de 1 veya 3 μA adımlarla faz başına 3 μs sabit süreli iki fazlı akım darbeleri dizisi uygulanarak ve genlik 33'dan 4 μA'ya artırılarak gerçekleştirildi. mikroelektrotlar. Eş zamanlı olarak, CMAP'ler her bir kasa yerleştirilen küçük iğne elektrotları (13 mm uzunluğunda, 0.4 mm çapında, paslanmaz çelik iğne elektrotları A-03-14BEP, Biyonik) kullanılarak GM, TA ve PL kaslarından kaydedildi.⁶². Aktif elektrot kas karnına ve referans tendon seviyesine yerleştirildi. Elektromiyografi kayıtları güçlendirildi (GM ve TA için × 100, PL için × 1,000; P511AC amplifikatörleri, Grass), bant geçişli filtrelendi (3 Hz ila 3 kHz) ve 16 kHz'de bir PowerLab kayıt sistemi (PowerLab20SP, ADInstruments) ile dijitalleştirildi.

Veri analizi

Her CMAP'nin genliği taban çizgisinden maksimum negatif zirveye kadar ölçüldü. Gerilim tepe ölçümleri, deneydeki her kas için elde edilen maksimum CMAP genliğine normalleştirildi. Bir kas için normalleştirilmiş CMAP genliği ile CMAP arasındaki oran olarak her aktif bölge için bir seçicilik indeksi (SI) hesaplandı._ive SI formülünü takip ederek üç kastaki normalleştirilmiş CMAP amplitüdlerinin toplamı_i = nWCPA_i/∑nWCPA_j, minimal düzeyde işlevsel olarak alakalı bir kas tepkisi ortaya çıkaran minimum stimülasyon akımı genliğinde (daha önce belirlenmiş olan o kasın maksimum CMAP genliğine göre kaslardan biri için en az %5 CMAP genliği olarak tanımlanır). Daha sonra, belirli bir deneyde, üç kasın her biri için en yüksek SI'ya sahip aktif bölgeler, her kas için SI'lar olarak seçildi.

Kronik intranöral biyouyumluluk

Daha önce bildirilen bir prosedürün ardından^50,63, anestezi altındaki Sprague-Dawley dişi sıçanların siyatik siniri (250-300 g, -18 haftalık) açığa çıkarıldı ve EGNITE ile ve EGNITE olmadan in vivo biyouyumluluk için cihazlar siyatik sinirin tibial dalına uzunlamasına implante edildi (n = 6–8 grup başına). Kısaca sinir, 10-0 ilmekli bir ipliğe (STC-6, Ethicon) bağlanan düz bir iğne ile trifürkasyon noktasında delinir; iplik, bükülmüş elektrot şeridinin ok şeklindeki ucunu çeker. Uç, ipliği çıkarmak için kesilir ve her bir kolun uçları, cihazın geri çekilmesini önlemek için hafifçe bükülür. Sinir içindeki yabancı cisim tepkisinin daha iyi incelenmesine olanak sağladığı için uzunlamasına bir implant seçildi⁵⁰.

Sinir ve hayvan fonksiyonel değerlendirmesi

Hayvanlar implantasyon sonrası takip sırasında sinir iletimi, algesimetri ve yürüme yolu hareket testleri aracılığıyla değerlendirildi.⁶². İletim testleri için, implante edilen ve kontralateral pençelerin siyatik siniri, siyatik çentikteki iğne elektrotlarla uyarıldı ve PL kasının CMAP'si yukarıdaki gibi kaydedildi. CMAP'nin gecikmesi ve genliği ölçüldü. Algesimetri testi için, sıçanlar tel ağlı bir platform üzerine yerleştirildi ve elektronik bir Von Frey algesimetresine (Bioseb) bağlanan metal bir uçla mekanik, zararlı olmayan bir uyarı uygulandı. İmplante edilen pençelere karşı karşı taraftaki pençelerin nosiseptif eşiği (hayvanların pençeyi geri çektiği gram cinsinden kuvvet) ölçüldü. Yürüme yolu testi için arka pençelerin plantar yüzeyi siyah mürekkeple boyandı ve her bir sıçan bir koridor boyunca yürümeye bırakıldı. Ayak izleri toplandı ve siyatik fonksiyonel indeks hesaplandı⁶².

histoloji

2 veya 8 hafta sonra hayvanlara PFA (%4) perfüze edildi ve siyatik sinirler toplandı, sonradan sabitlendi, dondurularak saklandı ve histolojik analiz için işlendi. FBR'nin değerlendirilmesi için siyatik sinirler kriyostat (Leica CM15) ile 190 µm kalınlığında enine kesitler halinde kesildi. Numuneler, miyelinli aksonlar (Neurofilament 97K, 200:1'i etiketlemek için anti-RT200; Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası) ve makrofajlar (anti-Iba-1, 1:500; Wako) için birincil antikorlarla boyandı. Daha sonra bölümler, eşek anti-fare Alexa Fluor 1 ve eşek anti-tavşan Alexa Fluor 488 (555:1, Invitrogen) ikincil antikorları ile oda sıcaklığında 200 saat süreyle inkübe edildi. Tibial sinirdeki implantın orta kısmından temsili kesitler seçilmiş, görüntüler bir dijital kameraya (DS-Ri2, Nikon) bağlı bir epifloresan mikroskobu (Eclipse Ni, Nikon) ile alınmış ve ImageJ yazılımı (Ulusal Enstitüler) ile görüntü analizi gerçekleştirilmiştir. Sağlık). Tibial sinirin tüm alanındaki Iba-1-pozitif hücrelerin miktarı ölçüldü ve doku kapsülünün kalınlığı, implantın her iki tarafının en yakın aksonlara olan ortalama mesafesi olarak ölçüldü.

istatistiksel analiz

Verilerin istatistiksel analizi için, bir veya iki yönlü ANOVA'yı ve ardından gruplar veya zamanlar arasındaki farklar için Bonferroni post hoc testini kullandık. Grafiksel gösterim ve analiz için GraphPad Prism yazılımı kullanıldı. İstatistiksel anlamlılık şu durumlarda dikkate alındı: P <0.05.

Raporlama özeti

Araştırma tasarımı hakkında daha fazla bilgi Doğa Portföyü Raporlama Özeti bu makaleye bağlantılı.

• SEO Destekli İçerik ve Halkla İlişkiler Dağıtımı. Bugün Gücünüzü Artırın.
• PlatoData.Network Dikey Üretken Yapay Zeka. Kendine güç ver. Buradan Erişin.
• PlatoAiStream. Web3 Zekası. Bilgi Genişletildi. Buradan Erişin.
• PlatoESG. karbon, temiz teknoloji, Enerji, Çevre, Güneş, Atık Yönetimi. Buradan Erişin.
• PlatoSağlık. Biyoteknoloji ve Klinik Araştırmalar Zekası. Buradan Erişin.
• Kaynak: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01570-5