Aksi belirtilmediği sürece tüm reaktifler alındığı gibi kullanıldı. Sayma boncukları (CountBright Absolute Counting Beads, Invitrogen) dışındaki tüm kimyasallar Sigma Aldrich'ten satın alındı. ζ-Potansiyel bir Zetasizer NanoZS90 (Malvern Instruments) kullanılarak ölçüldü. Parçacıkların boyutu ve morfolojisi, elementel analiz sağlamak üzere entegre EDS'li bir JEOL JSM 7800F Prime mikroskobunda SEM tarafından incelenmiştir. Parçacık boyutu, 50 bağımsız parçacığın ölçülmesiyle belirlendi. Radyo anında ince tabaka kromatografisi (ITLC), silisik asitle emprenye edilmiş Agilent Technologies cam mikrofiber kromatografi kağıdı üzerinde geliştirildi ve Laura yazılımı kullanılarak bir Lablogic Flow-count TLC tarayıcı ve bir BioScan B-FC-3200 fotomultiplier tüp (PMT) dedektörü kullanılarak analiz edildi. ITLC mobil fazı, aksi belirtilmediği sürece su içinde 0.175 M sitrik asit ve 0.325 M trisodyum sitrattan oluşmuştur. Radyoaktif numuneler, verilerin EdenTerm yazılımı kullanılarak toplandığı bir Capintec CRC-25R (Capintec) veya bir LKB Wallac 1282 Compugamma CS (PerkinElmer) kullanılarak ölçüldü. Akış sitometri deneyleri, BD FACSHorus Yazılımı kullanılarak bir BD FACSMelody hücre sıralayıcıda gerçekleştirildi. PET/CT görüntüleri bir NanoPET/CT tarayıcı (Mediso) kullanılarak elde edildi, Nucline v.0.21 yazılımı kullanılarak yeniden yapılandırıldı ve görüntüler VivoQuant yazılımı (versiyon 3.5, InviCRO) kullanılarak analiz edildi. Liste modu verileri Mediso tarafından geliştirilen özel bir MATLAB yazılım aracıyla elde edildi. Otoradyografi bir GE Amersham Typhoon cihazında gerçekleştirildi.

Mikrometre altı boyuttaki silika parçacıklarının sentezi

Parçacıklar Stöber yöntemi kullanılarak sentezlendi. Bu yöntem, monodispers, küresel silika parçacıkları üretmek için silikon alkoksitlerin hidrolizi ve ardışık yoğunlaştırılmasına dayanmaktadır.²⁷. Silikon kaynağı olarak tetraetil ortosilikat (TEOS), baz katalizör olarak amonyak ve elektrolit olarak potasyum klorür kullanıldı. Etanol içindeki bir TEOS çözeltisi, katalizör ve elektroliti içeren bir çözeltiye sürekli olarak ilave edildi. Reaktif başlangıç ​​miktarının veya ekleme oranının değiştirilmesi, daha önce bildirildiği gibi parçacık boyutunda farklılıklar sağlar²⁸. Burada parçacıkların sentezinden önce iki çözelti hazırlandı: 1 ml EtOH içinde 19.0 mmol TEOS içeren Çözüm 33.3 ve 2 ml amonyak, 0.23 ml EtOH ve 9 ml H içinde 65 mmol KCl içeren Çözüm 6.75₂O. Sentez için Çözelti 2, 250 dakika boyunca 50 rpm'de karıştırılarak 300°C'de ısıtılan 15 ml'lik yuvarlak dipli bir şişeye yerleştirildi. Daha sonra Çözelti 1, Çözelti 2'ye damla damla eklendi (besleme hızı 0.2 ml dak)^-1). Çözelti 1'in eklenmesinden sonra elde edilen parçacıklar 18,300°C'de santrifüjleme yoluyla saflaştırıldı.g 3 dakika boyunca bekletildi ve beş kez EtOH ile yıkandı. Son olarak SiO₂ mikropartiküller vakum altında kurutuldu.

Mikrometre altı boyuttaki parçacıkların silan-PEG ile aşılanması_5k

20 mg ml^-1 silan-PEG çözeltisi_5k (Sigma Aldrich) EtOH %98'de 5 mg ml ml'de bir smSiP çözeltisi üzerine ilave edildi^-1 EtOH'da %98 ve %2.8 amonyak. Karışım gece boyunca oda sıcaklığında karıştırıldı ve parçacıklar 18,300°C'de santrifüjleme yoluyla geri kazanıldı.g 3 dakika boyunca Son olarak parçacıklar üç kez damıtılmış suyla yıkandı ve gece boyunca vakum altında kurutuldu. Yıkama solüsyonları gece boyunca dondurularak kurutuldu ve bağlanmamış silan-PEG miktarı_5k Reaksiyon verimi hesaplaması için ağırlıklandırılmıştır. 0.05 mg ml^-1 smSiP–PEG çözümü_5k damıtılmış su içinde daha ileri radyo etiketleme reaksiyonları için kullanıldı.

[⁶⁸Ga]GaCl₃

Galyum-68 şu şekilde ayrıştırıldı: [⁶⁸Ga]GaCl₃ Eckert ve Ziegler'den ⁶⁸Ge /⁶⁸Ultra saf HCl'deki (4 ml, 0.1 M) Ga jeneratörü, iyi üretim uygulamaları gerekliliklerine (ABX) göre üretilmiştir.

[⁶⁸Ga]GaCl₃ katyon değişimi ile elüsyon

Elüsyonun konsantrasyonu, Ek Şekil 1'de açıklanan kurulum kullanılarak gerçekleştirildi. 1. İlk olarak, 4 ml'lik [⁶⁸Ga]GaCl₃ elüsyon bir Strata-X-C 33u kartuşa (Phenomenex) yüklendi ve elüat atıldı. Daha sonra kartuş, 5 ml aseton/0.1 M HC80 (20:XNUMX) solüsyonu ile yıkandı ve eluat atıldı. Son olarak konsantre [⁶⁸Ga]GaCl₃ 700 ul aseton/0.05 M HC98 (2:XNUMX) çözeltisi eklenerek toplandı, N altında kurutuldu₂ akış ve 50 ul 0.5 M HEPES tamponu (pH 4.9) içinde yeniden süspanse edildi. Kalite kontrolü için farklı aşamalarda Radyo-TLC uygulandı. Protokol yaklaşık 20 dakika sürer ve %86.2 ± 8.5'lik bir geri kazanım verimi sağlar.

Silika parçacıklarının farklı konsantrasyonlarda radyoaktif olarak etiketlenmesi ⁶⁸Ga

Silika parçacıkları farklı konsantrasyonlarda (1'den 0.002 mg'ye kadar) yeniden süspanse edildi.^-1) 0.5 M HEPES tamponunda (pH 4.9). Daha sonra, konsantre çözeltinin eklenmesinden önce bir reaksiyon tüpüne 50 µl çözelti eklendi.⁶⁸Ga]GaCl₃ 50 ul 0.5 M HEPES tamponunda (pH 4.9) elüsyon. Reaksiyonlar 90°C'de 30 dakika süreyle gerçekleştirildi ve radyokimyasal verimi hesaplamak için radyo-TLC uygulandı.

Akış sitometrisi ile parçacık konsantrasyonunun ölçümü

Parçacık konsantrasyonları, üreticinin talimatları izlenerek sayım boncukları (CountBright Absolute Counting Beads, Invitrogen) kullanılarak akış sitometrisi yoluyla hesaplandı. Silika parçacıkları 0.05 mg mg ml'de yeniden süspanse edildi^-1, 10 dakika boyunca sonikasyona tabi tutuldu ve 10 µm kesme boyutlu bir filtreden (KX Şırınga Filtresi, Naylon, 25 mm, 10 μm) geçirildi. CountBright Absolute Sayma Boncukları oda sıcaklığına kadar ısıtıldı ve 30 saniye boyunca vortekslendi. Daha sonra, 50 ul silika parçacıklarına 300 ul boncuk ilave edildi ve homojen bir çözelti elde etmek için karışım 30 dakika boyunca vortekslendi. Numune, akış sitometresinde çalıştırıldı ve ileri dağılım (FSC) eşiği, doğrusal FSC'ye karşı doğrusal yan dağılım grafiğindeki boncukları ve parçacıkları içerecek şekilde ayarlandı. Daha sonra, floresans detektör voltajı sayma boncukları için ayarlandı ve silika parçacıklarını ve sayma boncuk popülasyonlarını izole etmek için bir geçit stratejisi uygulandı. Son olarak parçacıklar üzerindeki kapılar ve mutlak sayım boncukları çizildi ve her numune için 1,000 boncuk olayı kaydedildi. Bu stratejiyi kullanarak çözeltideki parçacıkların sayısı aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplandı:

500 smSiP'nin radyo etiketlemesi

50 ul konsantreye XNUMX smSiP ilave edildi [⁶⁸Ga]GaCl₃ 0.5 M HEPES tamponu pH 4.9'da elüsyon. Daha sonra 5.6 ul polisorbat 80 ilave edildi ve karışım, bir termal karıştırıcıda 90 °C'de 30 dakika boyunca 900 rpm'de ısıtıldı. Daha sonra reaksiyona girmemiş/kolloidal maddeleri uzaklaştırmak için çok adımlı son bir saflaştırma protokolü tasarlandı. ⁶⁸Ga. Elli mikrolitre 10 mM EDTA ilave edildi ve karışım, oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edildi. Daha sonra parçacıklar 3°C'de 18,300 dakika boyunca santrifüjlendi.g, 500 mM EDTA + %1 polisorbat 0.1 içeren 80 ul PBS içerisinde yeniden süspanse edildi ve 10 saniye boyunca yavaşça vortekslendi. Parçacıklar tekrar santrifüjlendi, PBS içindeki 0.1 mM EDTA + %0.1 polisorbat 80 çözeltisiyle yıkandı ve 10 saniye boyunca yavaşça vortekslendi. Son olarak parçacıklar santrifüjlendi ve beş kez daha PBS + %0.1 polisorbat 80 ile yıkandı ve 500 ul PBS içerisinde yeniden süspanse edildi. Radyo-etiketleme reaksiyonu, kolloidlerin varlığını (düzgün bir şekilde uzaklaştırılmazsa parçacıklarla karıştırılabilen), parçacıkların radyo-etiketlemesini ve nihai ürünün saflığını değerlendirmek için ardışık reaksiyon adımları sırasında radyo-TLC ile izlendi. RLY, yıkama adımlarından sonra parçacıklardaki radyoaktivite miktarı ile süpernatanlar arasındaki karşılaştırmayla hesaplandı.

damıtma

Parçalama stratejisi için, 0.5 µl ila 20 µl arasındaki hacimler ⁶⁸1 parçacık μl teorik konsantrasyonda Ga-smSiP^-1 1 ul'lik adımlarla (0.5, 1, 2, 3...) farklı numune tüplerine eklendi ve son hacmi 50 ul'ye getirmek için PBS eklendi. Daha sonra, birinci tüpten 37.5 µl ikinci bir numune tüpüne, ikinci tüpten 25 µl üçüncü bir tüpe ve son olarak üçüncü tüpten 12.5 µl dördüncü bir tüpe pipetlendi. Bu strateji, tüp başına 12.5 µl nihai hacme sahip numune başına dört tüp sağlar. Her tüpteki radyoaktivite bir gama sayacında ölçüldü ve değerler daha fazla karşılaştırma ve analiz için bir kalibrasyon eğrisi kullanılarak kBq cinsinden hesaplandı. Yalnızca bir tüpte radyoaktivitenin çoğunu içeren numuneler, oda sıcaklığında 30 saniye süreyle sonikasyona tabi tutuldu ve ikinci bir fraksiyonlama adımına tabi tutuldu. Daha sonra, tüm radyoaktivitenin tek bir tüpte bulunduğu numuneler (diğer üç tüpte ihmal edilebilir aktivite ile) daha ileri in vivo/ex vivo deneyler için kullanıldı.

PET/CT fantom görüntüleme

Bir hayalet görüntüleme deneyi gerçekleştirildi ⁶⁸Ga-smSiP. Uygulama sırasında tek bir parçacığın kanül tüpünde sıkışıp kalıp kalmayacağını değerlendirmek için parçacığı bir numune tüpüne iletmek için bir kanül kullanıldı. Kısaca fantom tüp, kanül ucunun ucu tüpe takılı olacak şekilde nanoPET/CT tarayıcıya yerleştirildi. PET edinimi başlatıldıktan sonra, 100 ul PBS içinde yeniden süspanse edilen parçacık, kanülün başlangıcına takılan bir insülin şırıngasıyla iletildi. Daha sonra kanül, parçacığın fantom tüpüne iletilmesini sağlamak için 50 ul PBS ile yıkandı. PET edinimi 2 saat boyunca gerçekleştirildi ve ardından standart bir CT taraması yapıldı.

İn vivo PET/CT görüntüleme

Hayvan görüntüleme çalışmaları, hayvan deneylerini düzenleyen Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) Yasası 1986 (ASPA) Birleşik Krallık İçişleri Bakanlığı düzenlemelerine uygun olarak etik olarak incelendi ve gerçekleştirildi. İn vivo görüntüleme, sağlıklı 8 haftalık BALB/c farelerinde gerçekleştirildi. Hayvanlara izofluran (oksijende %2-3) ile anestezi uygulandı, kanül takıldı ve anestezi altında tarayıcı yatağına yerleştirildi. Hayvanı normal vücut sıcaklığında tutmak için yatak iç hava akışıyla 37 °C'ye ısıtıldı ve solunum hızı izlendi ve dakikada 60-80 nefeste tutuldu^-1 tarama boyunca. Hayvanın sıcaklığının kontrolünün sürdürülmesi önemlidir çünkü sıcaklıktaki beklenmedik bir düşüş, parçacığın kandaki hızının azalmasına neden olabilir. Bir ⁶⁸Ga-smSiP (n = 4) veya ⁶⁸Ga-smSiP–PEG_5k parçacık (n = 2), 100 ul PBS içinde kanül yoluyla uygulandı, ardından PET edinimi başlatıldıktan sonra 50 ul PBS ile yıkandı (1:5 tesadüf modu; 5 ns tesadüf zaman penceresi). PET 2 saat süreyle kaydedildi ve ardından yarım daire biçimli BT taraması yapıldı. Tüm süreç boyunca hayvanın vücut ısısı ve solunum hızı izlendi. Dinamik PET/BT görüntüleri, 3 × 400 × 600 mm voksel boyutunda Tera-Tomo 1D yeniden yapılandırma (5–20 keV enerji penceresi, 1:0.4 tesadüf modu, 0.4 yineleme ve 0.4 alt küme) kullanılarak yeniden yapılandırıldı.³ ve zayıflama, saçılma ve bozulma için düzeltildi. Tüm PET/PEPT alımlarına ilişkin liste modu verileri şu adreste bulunabilir: ⁶⁸Ref.'de Ga-smSiP. ²⁹ ve için ⁶⁸Ga-smSiP–PEG_5k ref. ³⁰.

Gerçek zamanlı izleme

İlk olarak, veriler tarayıcıdan liste modu formatında (yani, tespit edilen tesadüf fotonları için zaman damgası ve kristal indeksi olan bir format) dışa aktarıldı. Kristal indekslerden mm cinsinden pozisyona dönüştürmek için geometrik dönüşüm uygulandı. Birmingham yöntemi, MDP'yi tüm LoR'lerin bir alt kümesinden yinelemeli olarak hesaplar. Bunu, MDP'den belirli bir mesafeden daha uzakta olan LoR'leri atarak yapar; çünkü bunların, dağılımdan kaynaklanabilecek LoR'ler gibi yanlış LoR'lardan kaynaklanma olasılığı yüksektir. MDP her yinelemede iyileştirilir; yinelemelerin sayısı etkin bir şekilde belirlenir. f-faktörüdür ve o alt küme içindeki nihai parçacık konumunu tahmin etmek için kullanılan toplam LoR sayısıyla ilgilidir (örneğin, bir f-faktörün 0.5 olması, alt kümedeki LoR'lerin %50'si kaldığında yineleme döngüsünün sona ereceği anlamına gelir). Bir alt kümede kullanılan LoR'lerin sayısı, konumdaki belirsizliği artırma pahasına zamansal örneklemeyi iyileştirmek için azaltılabilir (alt kümeler, çakışma olmadan ardışık zamanlardır) (algoritmanın daha fazla ayrıntısı Parker ve ark.'da bulunabilir).⁵) PET tarayıcısından liste modu verilerini analiz etmek için Birmingham yöntemi kullanıldı. Farelerdeki parçacığı takip etmek için uyarlanabilir bir numune boyutu kullanıldı. Örnek boyutu, konumlandırma hatalarını en aza indirirken yeterli zamansal örnekleme arasında bir denge sağlayacak şekilde ayarlandı. Taramaların erken aşamalarında (tarama başlangıcından itibaren <100 s) 200 ila 60 LoR arasında bir örneklem büyüklüğü kullanıldı. f = 0.1, yaklaşık 1–5 s'lik aralıklarla sonuç verir. >60 s tarama sürelerinde numune boyutları 1,000 ile 2,000 arasında değişiyordu; bu, in vivo deneye bağlı olarak 30 s ile 60 s arasında zaman aralıkları sağlıyordu. MDP'yi hesaplamak için kullanılan sayımların sayısı (son yinelemede), örneklem büyüklüğünün f-faktör değeri. Bu parametreler önceki deneyimlere dayanmaktadır ve önceki yayınlara dayanmaktadır.¹.

Hız şu şekilde elde edildi: (sqrt{{v_{x}^{2}+{v_{y}^{2}+{v_{z}^{2}}) nerede ({v__{m}^{2}) içindeki hız x, y ve z tarifi.

Ex vivo organ alımı

Farklı organlardaki alım gama sayımı ile değerlendirildi. İn vivo PET/CT görüntülemeden sonra hayvanlar servikal dislokasyon yoluyla öldürüldü ve organlar kesilip çıkarıldı ve bir gama sayacında (LKB Wallac 1282 Compugamma CS) radyoaktivite sayımı için tartıldı. Veriler, gram doku başına (%ID g) enjekte edilen doz yüzdesi (organdaki doz/enjekte edilen toplam doz) olarak ifade edildi.^-1).

Otoradyografi

Akciğerlerdeki radyoaktivite bir radyasyon detektörü (EP15 probu, Morgan) ile takip edildi ve radyoaktif sinyal içeren küçük bir doku parçası elde edilene kadar akciğerler bir neşter ile küçük bölümlere ayrıldı. Doku -80 °C izopropanol içerisinde anında donduruldu. Dondurulduktan hemen sonra doku, optimum kesme sıcaklığına sahip ortama gömüldü ve 20 µm'lik dilimler halinde bir kriyostatta kesildi. Radyoaktif dilim bulunana kadar her dilim dedektörle incelendi. Önceki (arka planın altında), radyoaktif ve sonraki (arka planın altında) dilim, bir Superfrost mikroskop lamı (Epredia) üzerine yerleştirildi. Geriye kalan dokunun geri kalanı da arka planın altındaydı. Üç bölümlü mikroskop lamı, streç filmle kaplandı ve gece boyunca bir GE otoradyografi plakasının karşısına yerleştirildi. Plaka, 25 µm çözünürlükte ve PMT ayarı 4,000 olan GE Amersham Typhoon kullanılarak analiz edildi. Otoradyografi görüntüsü, radyoaktif dilimdeki bir radyoaktivite noktasını gösterecek şekilde doku resminin üzerine yerleştirildi. Miktar belirleme için, bilinen farklı aktivitelerde standartlar hazırlandı ve her biri kağıt üzerinde 1 µl'lik beşli olarak noktalandı. Noktalar, tek parçacıkların miktarı belirlendiği gibi GE'nin BAS-IP MS (Çok Amaçlı Standart) depolama fosfor eleğinde inkübe edildi. Görüntü, Amersham Typhoon 5 ile Kontrol Yazılımı sürüm 2.0 ile fosfor modunda, 100 µm piksel boyutunda ve 4,000 hassasiyette elde edildi. Görüntüler, jel ölçüm araç kutusu kullanılarak ImageQantTL v10.0-261 yazılımıyla ölçüldü. Sabit arka plan olarak noktanın hemen öncesinde veya sonrasında bir bölge seçilerek noktalar düzeltildi. Ortaya çıkan noktanın hacmi, kalibrasyon eğrisine dayanarak parçacıktaki Bq'yu hesaplamak için kullanıldı.

İstatistikler ve tekrarlanabilirlik

Kantitatif analiz için, in vivo veriler hariç en az üç biyolojik kopya analiz edildi. ⁶⁸Ga-smSiP–PEG_5k (n = 2). Veriler, Dunnett'in çoklu karşılaştırma testi ve Öğrenci testi ile sıradan tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ile analiz edildi. t-Ölçek. A P <0.05 değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

• SEO Destekli İçerik ve Halkla İlişkiler Dağıtımı. Bugün Gücünüzü Artırın.
• PlatoData.Network Dikey Üretken Yapay Zeka. Kendine güç ver. Buradan Erişin.
• PlatoAiStream. Web3 Zekası. Bilgi Genişletildi. Buradan Erişin.
• PlatoESG. karbon, temiz teknoloji, Enerji, Çevre, Güneş, Atık Yönetimi. Buradan Erişin.
• PlatoSağlık. Biyoteknoloji ve Klinik Araştırmalar Zekası. Buradan Erişin.
• Kaynak: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01589-8