Fareler

Genç (2-4 aylık) ve yaşlı (18-26 aylık) erkek ve dişi vahşi tip C57BL6/J, Lgr5-ki-eGFP-creER ve Olfm4-ki-eGFP-creER fareleri grup halinde barındırıldı ve muhafaza edildi. Fritz Lipmann Enstitüsü'nde 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsüne sahip ve 20 ± 2 °C Sıcaklık, rlH %55 ± 15'te standart bir fare yemi ile beslenen Özel Fırsatçı Patojen İçermeyen (SOPF) bir hayvan tesisi. Deneyler, onaylanan protokollere göre gerçekleştirildi. Thüringen Eyalet Hükümeti Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz (TLV) yetkilisi tarafından (lisans numarası: TG/J-0002858/A; TG/J-0003616/A; TG/J-0003681/A; FLI-17-109; FLI- 18-005, FLI-20-005).

İnce bağırsak kript izolasyonu

İnce bağırsak kriptaları belirlenen protokol kullanılarak izole edildi⁶⁰ bazı değişikliklerle. Kısaca fare ince bağırsağı diseke edildi, soğuk PBS'de yıkandı. Villi içermeyen bağırsak parçaları (2 cm) soğuk PBS ile yıkandı ve 5 mM EDTA/PBS'ye aktarıldı, ardından bir döndürücü üzerinde 30 °C'de 4 dakikalık iki inkübasyon yapıldı. Doku taze soğuk PBS'ye aktarıldı ve 30 saniye boyunca elle çalkalandı. Kript çözeltisi, 70 µm'lik bir hücre süzgeci kullanılarak filtrelendi ve 450 x'te santrifüj edildi. g 5 °C'de 4 dakika süreyle. İzole edilen kriptler hemen kullanıldı veya sıvı nitrojen içerisinde anında donduruldu ve daha sonraki deneyler için -80 °C'de saklandı. RNA izolasyonu için kriptalar hemen QIAzol Lizis Reaktifinde (Qiagen) yeniden süspanse edildi ve -80 °C'de saklandı.

Bağırsak kök hücrelerinin izolasyonu ve sınıflandırılması

Lgr5-eGFP ve Olfm4-eGFP ISC'leri izole etmek için, yeni izole edilen kriptler, 18 ml TrypLE Express, 2 ml 10x DNaz I Tamponu (100 mM Tris-HCl pH 7.5, 25 mM MgClXNUMX) karışımı ile ayrıştırıldı.₂, 5 mM CaClXNUMX₂) ve 1 ml DNaz I (10 mg/ml) 30 °C'de 37 dakika boyunca her 10 dakikada bir kısa vorteksleme ile. Tek hücreli süspansiyon daha sonra 20 µm'lik bir hücre süzgecinden geçirildi ve 800 x'te santrifüj edildi. g 5 °C'de 4 dakika süreyle. Hücre topağı, %3 Fetal Sığır Serumu, 2 mM EDTA, 2.5 uM Y10 ve DAPI (27632:1) ile desteklenmiş PBS içeren 1000 ml FACS boyama ortamında (FSM) yeniden süspanse edildi. Tek hücre süspansiyonu, FACS LSRII'ye (BD Biosciences) ve Lgr5-eGFP'ye uygulandı.^hi veya Olfm4-eGFP ISC'ler daha önce açıklandığı gibi aşağı akış analizi için sıralandı⁶¹.

Organoid kültür

İnce bağırsak organoitleri belirlenen protokole göre kültürlendi⁶². Kısaca izole edilmiş kriptler Matrigel ile karıştırıldı ve 24 oyuklu plakaya yerleştirildi. Matrigel'in polimerizasyonundan sonra, kript kültür ortamı (Gelişmiş DMEM/F12, 1x Glutamax, 10 mM HEPES, N2 takviyesi (1:100), B27 takviyesi (1:50), 0.5 U/mL penisilin/streptomisin, 50 ng/mL fare rekombinant epitel büyüme faktörü, 100 ng/mL fare rekombinant Noggin ve 500 ng/mL insan rekombinant R-spondin1) eklenmiştir. IFNy tedavisi için iki hafta boyunca büyütülen organoidler pasajlandı ve 3. günde bunlara IFNy (2 ng/ml) eklendi. 24 saat sonra organoidler toplandı, PBS ile yıkandı ve tek hücreli RNA sekansı için işlendi. Stat1 sinyallemesinin bloke edilmesi için organoidler, 2 gün boyunca Ruxolitinib (10 uM) ile veya olmadan IFNy 3 ng/ml ile tedavi edildi ve ardından FACS veya qRT-PCR analizi için toplandı. IFNy, yeniden tohumlama deneyi ve Baricitinib (0.2 uM) deneyi için 2 ng/ml konsantrasyonda kullanıldı.

Ek V boyama

Yukarıda açıklandığı gibi organoidlerden tek hücre hazırlanmasından sonra hücreler, oda sıcaklığında 200 dakika inkübasyonun ardından 1 ul 1x bağlama tamponu ve BD Bioscience'dan apoptoz tespit Kitinden 15 ul APC Annexin V içerisinde yeniden süspanse edildi. 1x bağlanma tamponu ile yıkandıktan sonra hücreler, 1x bağlanma tamponu (100 ul) içerisinde yeniden süspanse edildi ve FACSAriaII (BD Biosciences) kullanılarak analiz edildi ve veriler, FlowJo yazılımı kullanılarak analiz edildi.

BrdU çoğalma analizi

Hasattan 10 saat önce organoidlere BrdU (6 uM) eklendi. Yukarıda açıklandığı gibi organoidlerden tek hücre hazırlanmasından sonra, organoid kültürde çoğalan hücrelerin yüzdesini ölçmek için BD Bioscience'ın BrdU akış kiti kullanıldı. Hücreler FACSAriaII kullanılarak analiz edildi ve analiz için FlowJo yazılımı kullanıldı.

Ortak kültür deneyi

IFNy ile işlenmiş (0.2 gün boyunca 2 ng/ml) veya işlenmemiş organoidler, taze izole edilmiş ve sınıflandırılmış Cd45 ile birlikte kültürlendi⁺ 3 gün boyunca genç farelerden alınan hücreler. Yaklaşık 2 × 10⁵ Cd45⁺ hücreler 100 organoid ile karıştırıldı ve Matrigel (%30 nihai konsantrasyon) içerisinde yeniden süspanse edildi. Daha sonra bağışıklık hücreleri kültürden izole edildi ve boyamanın ardından FACSAriaII kullanılarak analiz edildi. Farklı bağışıklık hücresi popülasyonunun yüzde hesaplaması için FlowJo yazılımı kullanıldı.

IFNy'nin in vivo bloke edilmesi

Yaşlı farelere iki hafta boyunca (haftada 25 enjeksiyon) anti-fare IFNy (1 mg/kg) veya anti-IgG3 antikoru intraperitoneal olarak enjekte edildi. Fareler, son enjeksiyondan 4 gün sonra organ toplanması için kurban edildi. Rejenerasyon deneyi için, IFNy'nin bloke edilmesinden sonra, kontrol olarak 5-florourasil (5-FU) (150 mg/kg) veya DMSO, son enjeksiyondan bir gün sonra intraperitoneal (ip) olarak enjekte edildi ve fareler, 7 gün sonra organ hasadı için kurban edildi.

RNA ve DNA izolasyonu

Kriptolardan toplam RNA, QIAzol Lizis reaktifi (Qiagen) ve ardından izopropanol çökeltmesi kullanılarak izole edildi. Lgr5-eGFP'den RNA^hi FACS'ye göre sıralanan ISC'ler, üreticinin talimatları izlenerek ZR-Duet™ DNA/RNA MiniPrep Plus Kiti (Zymo Research) kullanılarak izole edildi. İzole edilmiş RNA, Nanodrop 8000 (Thermo Fisher Scientific) ve Qubit 3.0 (Thermo Fisher Scientific) üzerinde ölçüldü. İzole edilmiş RNA'nın kalitesi Fragment Analizörü (Agilent) ile analiz edildi.

RNA sıralama kütüphanesi hazırlığı

Toplam ribo-tükenmiş RNA-seq kütüphanesi hazırlığı, daha önce tarif edildiği gibi gerçekleştirildi.⁶³. Kısaca, üreticinin talimatlarına uygun olarak Ribo-Zero™ Gold Kit H/M/R Kiti (illumina) kullanılarak 50-500 ng toplam RNA'nın ribozomal RNA'sı tükendi. Ribo-tükenmiş RNA, 17 ul EFP tamponunda (illumina) yeniden süspanse edildi, 94 dakika boyunca 8 °C'ye ısıtıldı ve üreticinin talimatlarına uygun olarak TruSeq™ RNA Kitaplığı Hazırlama Kiti v2 (illumina) kullanılarak ilk iplik sentezi için girdi olarak kullanıldı.

ScRNA dizilimi için hücre hazırlığı

Deneye göre, proksimal ince bağırsak kriptleri veya bağırsak organoidleri, 1 ml Tek Hücreli İzolasyon Solüsyonunda (1 mg/ml DNase I, 5 mM MgCl ile desteklenen TripLE) yeniden süspanse edildi.₂, 80 µM Y27632) ve ilk 20 dakikalık inkübasyonun ardından kısa vorteksleme ile 37 °C'de 10 dakika inkübe edildi. Reaksiyon, 29 ml buz soğukluğunda PBS ilave edilerek söndürüldü ve hücreler, 800 x'te santrifüjlendi. g 5 °C'de 4 dakika süreyle. Hücre topağı, 80 uM Y27632 ile takviye edilmiş FSM içerisinde yeniden süspanse edildi. Hücreler, üreticinin spesifikasyonlarına göre TruStain FcX anti-fare antikoru ile önceden bloke edildi. Hücreler daha sonra CD326 (EpCAM) (G8.8), PE-Cyanine7 ile eşleşmiş sıçan monoklonal antikoru ve farklı TotalSeq anti-fare Hashtag antikorları ile karanlıkta buz üzerinde 30 dakika boyunca işleme tabi tutuldu. Hücreler daha sonra 450x'te santrifüj edildi. g 5 °C'de 4 dakika boyunca 500 ul taze FSM ve FACS ile yeniden süspanse edildi. EpCAM⁺ genç ve yaşlı farelerden alınan tek hücreler, %1.5 BSA içeren 0.04 ul PBS içeren bir BSA kaplı tüp içine akışla ayrıldı.

lamina propria bağışıklık hücreleri proksimal bağırsak dokusundan izole edildi. Kısaca, kript izolasyonundan sonra doku doğranmış ve %3 FBS ile desteklenmiş RPMI ortamında 1 ml 1 mg/ml kollajenaz-D ve 2 mg/ml DNase I içerisinde bir inkübatör çalkalayıcıda (80 rpm) 50°C'de 37 dakika boyunca inkübe edilmiştir. °C. Doku p1000 ucuyla birkaç kez yukarı ve aşağı pipetlendi. Süpernatan, 100 um'lik bir süzgeçten %2 FBS ile desteklenmiş RPMI ortamına geçirildi. Kalan doku bir şırınga pistonu ile parçalandı ve maksimum hücre sayısını toplamak için %2 FBS ile desteklenmiş RPMI ortamı ile yıkandı. Süpernatant 450x'te santrifüj edildi. g, 4 °C'de 5 dakika süreyle. Pelet, %40 FBS ile desteklenmiş RPMI ortamında %2 percoll içinde yeniden süspanse edildi. Hücre süspansiyonu, bir gradyan oluşturmak amacıyla bir şahin tüpüne %80'in üzerinde dikkatlice pipetlendi. Şahin tüpleri 1600x'te santrifüj edildi.g20 dakika boyunca RT (santrifüj molası devre dışı). Bağışıklık hücreleri iki percoll konsantrasyonunun sınırından dikkatlice toplandı ve %2 FBS ile desteklenmiş PBS ile yıkandı. Süspansiyon 450x'te santrifüj edildi g, 4 °C'de 5 dakika süreyle. Pelet, %2 FBS ile takviye edilmiş PBS içerisinde yeniden süspanse edildi ve boyama için işleme tabi tutuldu. Hücreler, üreticinin spesifikasyonlarına göre TruStain FcX anti-fare antikoru ile bloke edildi. Boyama ve karma etiketleme, her bölme için FITC-bağlı CD45 ve farklı TotalSeq anti-fare Hashtag antikorları ile aynı anda gerçekleştirildi. Antikorlarla ilgili ayrıntılar Ek Tabloda bulunabilir. S2.

Damlacık tabanlı scRNA dizilimi

scRNA-seq, 10X Genomics protokollerine göre gerçekleştirildi. Kısaca, hazırlanan tek hücre süspansiyonu, Chromium Single Cell 3' Library & Gel boncuk kimyası v2 (10x Genomics) kullanılarak ters transkripsiyon karışımıyla dikkatlice karıştırıldı ve bir Chromium Single Cell A Chip'e (10x Genomics) yüklendi.

10X Genomics Chromium sistemindeki kapsülleme işlemi sırasında hücreler damlacık içinde parçalandı ve poliadenile edilmiş RNA'yı serbest bıraktı; bu daha sonra hücreyle birlikte yakalanan barkodlu boncuklara bağlandı. 10x Genomics'in kullanım kılavuzundaki yönergeler izlenerek damlacıklar doğrudan ters transkripsiyona tabi tutuldu, emülsiyon kırıldı ve cDNA, Dynabeads MyOne Silane (Thermo Fisher Scientific) kullanılarak saflaştırıldı. cDNA'nın sekiz döngü ile PCR amplifikasyonundan sonra Fragment Analizöründe (Agilent) saflaştırma ve kalite kontrol kontrolü yapıldı.

CDNA, beş dakika süreyle parçalandı ve dA kuyruklu hale getirildi, ardından kütüphaneler oluşturmak için bir adaptör bağlama adımı ve 10 döngülük bir indeksleme PCR'si takip edildi. Nicelemenin ardından kütüphaneler, PE modunda yüksek çıkışlı bir akış hücresi (R500: 1 döngü; I26: 1 döngü; R8: 2 döngü) kullanılarak NextSeq57 platformunda (illumina) dizildi.

Yüksek verimli sıralama

Genom çapında deneylere yönelik tüm numuneler HiSeq2500 ve NextSeq500 platformunda (Illumina, San Diego, CA, ABD) dizildi.

Kantitatif gerçek zamanlı PCR

Üreticinin protokolüne göre iScript cDNA Sentez Kiti (Biorad) kullanılarak 1 µg toplam RNA ile cDNA sentezi yapıldı. Kantitatif gerçek zamanlı PCR analizi, SYBR GreenER qPCR SuperMix (Thermo Fisher Scientific) kullanılarak Corbett RotorGene 6000 (Qiagen) üzerinde gerçekleştirildi. Her reaksiyon 19 µl qPCR karışımı ve 1 µl 1:10 seyreltilmiş cDNA. qRT-PCR koşulları 10 °C'de 95 dakika, ardından 50 °C'de 10 saniyelik 95 döngü, 10 °C'de 56 saniye, 20 °C'de 68 saniye ve 3 °C'de 68 saniye idi. Amplikon verilerini elde etmek için her PCR çalışmasından sonra bir erime eğrisi analizi gerçekleştirildi: her numune üç kopya halinde analiz edildi. Numunelerin konsantrasyonları bağıl standart eğri yöntemi kullanılarak hesaplandı. Analiz edilen tüm gen ifadeleri, temizlik geni Beta-aktin'e normalleştirildi. Primerler, NCBI Primer-BLAST aracı kullanılarak tasarlandı ve dizileri Ek Tabloda listelenmiştir. S1.

Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP)-qRT-PCR analizi

Kromatin İmmünopresipitasyonu, daha önce tarif edildiği gibi IFNγ ile tedavi edilen ve tedavi edilmeyen organoidler üzerinde gerçekleştirildi.⁶³. Kısaca, 2 saat boyunca IFNy (24 ng/ml) ile işleme tabi tutulan organoidler yıkandı, parçalandı ve oda sıcaklığında 1 dakika boyunca %10'e kadar formaldehit eklenerek çapraz bağlandı, oda sıcaklığında 0.125 dakika boyunca 5 M glisin ile söndürüldü ve ardından iki kez soğuk PBS ile yıkandı. Çapraz bağlı organoidler, SDS ChIP Tamponunda (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA, %1 SDS ve proteaz inhibitörleri) yeniden süspanse edildi, 30 °C'de 4 dakika boyunca bir rotator üzerinde inkübe edildi, yüksek sıcaklıkta 18 döngü boyunca sonikasyona tabi tutuldu Bioruptor Next Gen (Diagenode) kullanılarak güç ayarı (30 s AÇIK, 30 s KAPALI) yapıldı ve 12,000 ×'te santrifüj edildi g 10 °C'de 4 dakika süreyle. İzole edilen kromatin, ChIP seyreltme tamponu (10 mM Tris-HCl pH 16.7, %8.0 SDS, %0.01 Triton X-1.1, 100 mM EDTA, 1.2 mM NaCl) ile 167 kat seyreltildi ve 4 ug antikorla gece boyunca 4°C'de inkübe edildi. °C bir döndürücü üzerinde. Protein G-konjuge manyetik boncuklar (Dynal, Thermo Fisher Scientific), PBS/%1 BSA ile doyuruldu ve somon spermi gece boyunca 4 °C'de sonikasyona tabi tutuldu. Ertesi gün numuneler, bir döndürücü üzerinde 4°C'de iki saat boyunca doymuş boncuklarla inkübe edildi ve ardından 1 ml soğuk Düşük tuz tamponu (20 mM Tris-HCl pH 8.0, %0.1 SDS, %1 Triton X-100) ile yıkandı. , 2 mM EDTA, 150 mM NaCl), 1 ml soğuk Yüksek tuz tamponu (20 mM Tris-HCl pH 8.0, %0.1 SDS, %1 Triton X-100, 2 mM EDTA, 500 mM NaCl), 1 ml soğuk LiCl tamponu (10 mM Tris-HCl pH 8.0, %1 DOC, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, %1 NP-40) ve iki kez 1 ml soğuk TE tamponu (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM) EDTA). İmmüno-çökeltilmiş kromatin, bir rotator üzerinde oda sıcaklığında 200 dakika boyunca 10 ul Elüsyon tamponu (8.0 mM Tris-HCl pH 1, 1 mM EDTA, %150 SDS, 5 mM NaCl, 30 mM DTT) ile elüt edildi ve 65°'de çapraz bağlantısı çözüldü. C gecede. Çapraz bağlı olmayan DNA, üreticinin talimatlarına göre QiaQuick PCR Saflaştırma Kiti (Qiagen) kullanılarak saflaştırıldı. İmmüno-çökeltilmiş DNA, SYBR GreenERkit (Invitrogen) ve aşağıdaki primerler kullanılarak kantitatif gerçek zamanlı PCR ile analiz edildi: H2-Ab1 (İleri: CAGGTCCTGACCCCTGTTTA, Geri: GTTTCAGGAAGGGACAGCCA), Savaşlar (İleri: CTGGCTGTGTAGTCCAAGGG, Geri: GAAAGGGTGTGGCAAAGCAG). ChIP için kullanılan antikorlar şunlardı: tavşan anti-Stat1 (9172, Hücre Sinyali), tavşan anti-IgG (12-370, Millipore). Tüm antikorlar 1:250 konsantrasyonda kullanıldı. Antikorlarla ilgili ayrıntılar Ek Tabloda bulunabilir. S2.

Dondurulmuş doku kesitlerinde immünofloresan

Küçük bir parça (2 cm) proksimal bağırsak (duodenum), bir döndürücü üzerinde gece boyunca 4°C'de PBS içindeki %4 PFA'da sabitlendi. Sabitlemeden sonra doku, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca üç kez PBS ile yıkandı ve daha sonra bir döndürücü üzerinde 20 °C'de gece boyunca %4 Sükroz içerisinde dehidre edildi. Daha sonra sabit doku, optimal kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği kullanılarak alçıya monte edildi, sıvı nitrojen kullanılarak yavaşça donduruldu ve -80 °C'de saklandı. İmmünofloresan boyama için 14 µm'lik kesitler kesildi ve doku, 0.1 dakika boyunca %100 Triton X-10 ile desteklenmiş PBS içerisinde geçirgenleştirildi ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca üç kez PBS ile yıkandı. Geçirgenleştirilmiş doku, %1 Tween 10 (T-PBS) ile desteklenmiş PBS içerisinde %0.1 FBS ile 20 saat süreyle bloke edildi ve daha sonra 2 °C'de nemli bir odada gece boyunca %4 FBS ile desteklenmiş T-PBS içerisinde birincil antikorla inkübe edildi. . Birincil antikorla inkübasyonun ardından doku, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca üç kez PBS ile yıkandı ve daha sonra oda sıcaklığında 1 saat boyunca DAPI (1000:1) ile desteklenmiş PBS içerisinde ikincil antikorla inkübe edildi. İkincil bir antikorla inkübasyonun ardından doku, oda sıcaklığında 15 dakika süreyle PBS ile üç kez yıkandı ve monte edildi. Görüntüleme Fritz Lipmann Enstitüsü - Temel Tesis Görüntüleme'de gerçekleştirildi. Görüntüler, optik kesit için ApoTome kaydırma modülüne sahip Axiovert 200 ters mikroskop kullanılarak elde edildi. Görüntüleme 200x toplam büyütmede gerçekleştirildi.

İmmünfloresan için kullanılan birincil antikorlar şunlardı: tavşan monoklonal anti-EpCAM [EPR20533-63] (Abcam; 1:250); sıçan monoklonal anti-Fare MHC Sınıf II (IA) (NIMR-4), PE (Thermo Fisher Scientific; 1:250). İmmünofloresan için kullanılan ikincil antikorlar şunlardı: Alexa Fluor 488 eşek anti-tavşan IgG (H + L) (Thermo Fisher Scientific; 1:500); Alexa Fluor 568 keçi anti-sıçan IgG (H + L) (Thermo Fisher Scientific; 1:500). Antikorlarla ilgili ayrıntılar Ek Tabloda bulunabilir. S2.

Parafine gömülü doku kesitlerinde immünofloresan

5 mikronluk parafin bölümleri, ksilene üç kez daldırılarak (her seferinde 5 dakika) parafinden arındırıldı ve her biri 100 dakika boyunca bir dizi dereceli etanol seyreltisine %90, %70 ve %5 daldırılarak yeniden hidratlandı. Epitop geri kazanımı, bölümlerin tam güçlü mikrodalgada (5 W) 900 mM sodyum sitrat tamponu pH 10 içinde kaynayana kadar 6.5 dakika boyunca ön ısıtılması ve ardından 10 dakika alt kaynama sıcaklığında (600 W) ısıtılmasıyla gerçekleştirildi. 20 dakika soğuduktan sonra kesitler PBS'de yıkandı ve nemli odada oda sıcaklığında 1 saat boyunca %1 BSA/PBS ile bloke edildi. Kesitler birincil antikorlarla boyandı: anti-Olfm4 (Hücre Sinyali, D6Y5A, #39141), anti-Muc2 (abcam, ab90007) ve anti-Chga (abcam, ab15160) %1 BSA/PBS içinde 16 saat boyunca 4 derecede nemli odada. Bunu PBST (%0.1 Tween 20, 3 x 5 dakika) içerisinde yıkama ve ardından AF30 ile konjuge ikincil anti-tavşan IgG ile 488 dakika süreyle inkübasyon izledi. Tüm antikorlar 1:250 konsantrasyonda kullanıldı. Slaytlar T-PBS (%0.1 Tween 20, 3 x 5 dakika) içinde yıkandı ve DAPI içeren montaj ortamıyla monte edildi. Boyalı bölümlerin görüntüleri, Zeiss'in Axio Imager'ı kullanılarak elde edildi ve ZEN blue yazılımı v2 (Zeiss) tarafından analiz edildi. Daha fazla görüntü analizi için ZEN yazılımının sayma ve ölçmeye yönelik grafik araçları kullanıldı. Antikorlarla ilgili ayrıntılar Ek Tabloda bulunabilir. S2.

RNA sıralama veri analizi

Fastq dosyalarının kalite kontrolü FastQC v0.11.5 kullanılarak gerçekleştirildi. Fastq dosyaları, TopHat v9 kullanılarak aşağıdaki parametrelerle –bowtie2.1.0 –no-coverage-search -a 1 kullanılarak mm5 genomuyla eşlendi. Her gen tarafından kapsanan okuma sayısı, -s ile HTSeq-Count 0.11.2 tarafından hesaplanır. no -a 0 -t exon -m kesişim-boş olmayan parametreler. Daha ileri analizlerden önce tüm rRNA genleri sayım verilerinden çıkarılır. DEG'leri ve normalleştirilmiş sayımı hesaplamak için varsayılan parametrelerle DESeq2 R paketi v1.20.0 kullanıldı. Pearson korelasyon analizi ve ifadenin grafiğinin çizilmesi için normalleştirilmiş sayım kullanıldı.

Gen seti zenginleştirme analizi

Gen seti zenginleştirme analizi için normalleştirilmiş sayımlar (tüm numunelerdeki her gen için), R'deki ölçek fonksiyonu kullanılarak ölçeklendi (merkez = DOĞRU, ölçek = DOĞRU parametrelerle). ortalaması Z puanlar her grup için hesaplandı ve grafiklerin çizilmesi ve aşağı yönlü analiz için kullanıldı. p değerler Wilcoxon eşleştirilmiş testi (iki kuyruklu) kullanılarak hesaplandı. Kutu grafikleri verilerin çeyrek dağılımını gösterir. Alt çeyreğin altında çeyrekler arası aralığın (Q1.5 – Q3) 1 katı bir mesafe ölçülür ve bu mesafeye giren veri kümesinden gözlemlenen alt noktaya kadar bir bıyık çizilir. Gözlemlenen diğer tüm noktalar aykırı değerler olarak işaretlenmiştir.

Bağırsak kripta hücreleri için scRNA dizilimi veri analizi

Ham dizileme verileri, Cell Ranger yazılımının (v2.1.0, 10X Genomics) 'count' komutuyla varsayılan seçeneklerle işlendi. Gerekli referans, girdi olarak Ensembl'den (v10) gelen gen açıklamasının yanı sıra mm87 fare genomuna dayalı olarak Cell Ranger'ın 'mkref' komutuyla oluşturuldu. Ek açıklama, yalnızca protein kodlayan, lincRNA ve antisens gen özelliklerini içerecek şekilde Cell Ranger'ın 'mkgtf' komutuyla filtrelendi ('–attribute=gene_biotype:protein_coding –attribute=gene_biotype:lincRNA –attribute=gene_biotype:antisense'). Sayım dosyası, cellrangerRkit paketi v2.0.0 kullanılarak doğrudan R'ye yüklendi. Sayım verileri üzerinde daha fazla analiz yapılmadan önce, ifade edilmeyen genler çıkarıldı ve sayımlar, her bir hücredeki toplam sayım sayısına göre normalleştirildi (cellrangerRkit paketindeki normalize_barcode_sums_to_median işlevi kullanılarak) ve tüm aşağı akış analizleri için log 10'a dönüştürüldü. PCA, merkez = DOĞRU, ölçek ile prcomp işlevi kullanılarak hesaplandı. = DOĞRU parametreler. Hücrelerin kümelenmesi kmean kümeleme (merkez = 9, nstart = 10) kullanılarak yapıldı ve tanımlanan her kümenin hücre tipi, her hücre tipi için iyi bilinen işaretleyiciler kullanılarak belirlendi. 9 küme kullanarak Tuft ve Enteroendokrin hücreleri aynı kümede yer aldığından kmean (merkez = 2, nstart = 10) kullanarak yeniden kümeleme yaparak bu hücre tiplerini ayırdık. Her kümeye yönelik işaretleri tanımlamak için sırasıyla order_cell_by_clusters ve prioritize_top_genes (method = "sseq", min_mean = 0.1) kullandık. İşaretleyicilerin ifadesi, istenen küme ile diğer tüm hücreler (prioritize_top_genes işlevi kullanılarak) ve log2 kat değişikliği ≥ 2 olan ve ayarlanan genler arasında karşılaştırıldı. p değer < 0.05 işaretleyici olarak seçildi.

Lamina propria bağışıklık hücreleri ve bağırsak organoid hücreleri için scRNA dizilimi veri analizi

Referans genomu olarak mm3.1.0-3 ile numune çoğullama çözme, barkod işleme ve tek hücreli 10' UMI sayımı gerçekleştirmek için Cell Ranger Yazılım Paketi (Sürüm 3.0.0) kullanıldı. Hücre başına etkili okumalar (UMI), ham okumaların altörneklenmesiyle her örnekte aynı seviyeye (hücre başına ortalama UMI sayısı: 1330) ölçeklendirildi. Hashtag okunan hücreler, her hücredeki hashtag oranına göre “tek hashtag”, “çift hashtag”, “üçlü hashtag” ve “çoklu hashtag” şeklinde farklı kategorilere ayrıldı. Hashtag'lere 10'dan az okuma eşlemesi olan hücreler atıldı ve yalnızca "tek hashtag" olarak tanımlananlar alt analiz için tutuldu. Daha sonra tüm örneklerin gen-barkod matrisi Seurat v3 ile entegre edildi. Daha sonra her bir hücreye, yani bağışıklık hücreleri için aşağıdaki kriterler uygulandı: gen sayısı 200 ila 1500 arasında, UMI sayıları <5000 ve mitokondriyal gen normalize edilmiş sayıları 8'in altında; bağırsak organoid hücreleri için: mitokondriyal gen normalize edilmiş sayımlar 20'nin altındadır. Filtrelemeden sonra kalan toplam 8997 bağışıklık hücresi (genç örnekler için 4423 hücre, eski örnekler için 4574 hücre) ve 13,054 bağırsak organoid hücresi (kontrol grubu için 5843 hücre, kontrol grubu için 7211 hücre) IFNy ile tedavi edilen grup) aşağıdaki analiz için bırakıldı. Toplu etki, tek hücreleri kontrol organoidlerinden ve IFNy ile tedavi edilen organoidlerden entegre ederken "kanonik korelasyon analizi (cca)" düzeltmesi ile kaldırıldı.

Boyut azaltma, grafik kümeleme ve UMAP/t-SNE görselleştirme

Bağışıklık hücreleri için, veri kümesinde hücreden hücreye yüksek varyasyon sergileyen bir özellik alt kümesi (7425 gen), Seurat'ta "mvp" yöntemiyle seçilir (ortalama kesme noktası 0.0125 ile 2 arasında; dağılım kesme noktası >0.9), değişkenlik ve ortalama ifade arasındaki güçlü ilişkiyi kontrol ederken değişken özellikleri tanımlayabilen. Temel olarak özellikler, ortalama ifadelerine göre 20 bölmeye bölündü ve z puanlar her bölme içindeki dağılım için hesaplandı.

Bağırsak organoid hücreleri için, veri kümesinde hücreden hücreye yüksek çeşitlilik sergileyen bir özellik alt kümesi (2000 gen), Seurat'ta "vst" yöntemiyle seçilir. Özellik değerleri, log(varyans) ve log(ortalama) uygun çizgi modeli tarafından verilen gözlemlenen ortalama ve beklenen varyans kullanılarak standartlaştırıldı. Özellik varyansı daha sonra maksimuma kırpıldıktan sonra standartlaştırılmış değerler üzerinden hesaplanır.

Aşağı akış analizinde değişken genlere odaklanmak, tek hücreli veri kümelerinde biyolojik sinyalin vurgulanmasına yardımcı olur. Veri kümesindeki değişkenliğin çoğunun korunmasını sağlamak amacıyla boyut küçültme için "mvp" veya "vst" yöntemiyle tanımlanan tüm değişken genleri konservatif bir şekilde kullandık. Filtrelenmiş hashtag ile izole edilmiş gen-barkod matrisinin boyut küçültülmesi, bu değişken genlere PCA tarafından uygulandı. Daha sonra, hücrelerin görselleştirilmesi için ilk 20 ana bileşen üzerinde bağırsak organoidleri için Tekdüzen Manifold Yaklaşımı ve Projeksiyonu (UMAP) ve bağışıklık hücreleri için t-dağıtılmış stokastik komşu yerleştirme (t-SNE) gerçekleştirildi. Bu arada Seurat v3 ile boyutu azaltılmış veriler üzerinde grafik tabanlı kümeleme yapıldı.

Kümeler için diferansiyel analiz ve kümeye özgü genlerin tanımlanması

Diferansiyel analiz elde etmek için Seurat v3'te uygulandığı şekliyle Wilcoxon sıra toplamı testi benimsendi. Her küme için, yaşlanmadaki DEG'ler, her kümedeki tüm hücrelerdeki ortalama gen ekspresyonuyla üretildi. Aynı şekilde, her kümedeki her bir genin ortalama ifadesi, belirli bir kümede zenginleştirilmiş genleri belirlemek için diğer tüm kümelerdeki hücrelerdekilerle karşılaştırıldı. Her kümeden ifade farklılıklarına göre sıralamadaki en üstteki birkaç kümeye özgü gen incelendi. Her genin ortalanmış ifadesi, ısı haritasıyla görselleştirme için kullanıldı. İmmün hücre alt gruplarının sınıflandırılması, kümeye özgü genlerin açıklamasından çıkarıldı. Bilinen belirteçlere (Ek Veriler) atıfta bulunularak farklı hücre tipleri manuel olarak belirlenmiştir. S4).

Bağışıklık hücrelerinde ve bağırsak organoidlerinde hücre oranlarındaki değişimlerin test edilmesi

Olasılık oranı, yaşlanma veya tedavi sırasında her hücre tipinin göreceli bolluğundaki değişimi temsil edecek şekilde hesaplandı. Bu iki veri setinde bazı hücre tiplerinin frekansında dramatik değişiklikler gözlemlendi. Bu kaymaların istatistiksel önemi, her bir durum karşılaştırması ve hücre tipine ilişkin olarak, hücre sayılarında gözlemlenen değişikliğin tam hipergeometrik olasılığının (değiştirilmeden) hesaplanmasıyla değerlendirildi.

Spesifik olarak, m ve n toplam hücrenin (tüm hücre tiplerinden) sırasıyla bir tedavi ve kontrol koşulunda sıralandığı göz önüne alındığında, belirli bir hücre tipi için, gözlenen C tipi hücrelerin toplamda k ve q sayısının ve toplam k ve q sayısının olup olmadığını test ederiz. sırasıyla tedavi koşulu, hipergeometrik dağılım tarafından verilen boş bir modelden önemli ölçüde sapmaktadır. Bu değerleri gözlemleme olasılığı, 'stats' paketindeki R fonksiyonu 'phyper' kullanılarak aşağıdaki komut kullanılarak hesaplandı: p = phyper(q, k, m, n) ve hipergeometrik olarak bildirildi p değer. Olasılık oranı için güven aralıkları, 'fisher.test' R fonksiyonu kullanılarak hesaplandı.

Gen fonksiyonel açıklaması

İstatistiksel olarak anlamlı DEG'ler (düzeltilmiş p değeri < 0.05) Canonical Pathway ve Upstream Regulator analizi için QIAGEN IPA yazılımına yüklendi (Qiagen 2020, sürüm 01-18-06). Zenginleştirilmiş yollar ve aday yukarı akış düzenleyicileri IPA'dan alınabilir.

Motif tahmini

Motif tahmini, HOMER-v4.9.1 yazılımı tarafından “-start −1000 -end 500 -len 8,10 -p 4 -b” ayarıyla gerçekleştirildi. Hesaplamak için binom dağılımı kullanıldı p Zenginleştirilmiş motiflerdeki değerler. Bağırsaktaki salgı hücrelerinin işaretçileri olarak bilinen genlerin destekleyicileri ile enterosit işaretçileri olarak bilinen genlerin destekleyicileri üzerinde analiz yapıldı.

İstatistikler ve tekrarlanabilirlik

Örneklem boyutunu önceden belirlemek için herhangi bir istatistiksel yöntem kullanılmamıştır. Hiçbir veri analizlerin dışında tutulmadı. Araştırmacılar, deneyler ve sonuç değerlendirmesi sırasında tahsis konusunda kör değildi.

Raporlama özeti

Araştırma tasarımı hakkında daha fazla bilgi Doğa Portföyü Raporlama Özeti bu makaleye bağlantılı.

• SEO Destekli İçerik ve Halkla İlişkiler Dağıtımı. Bugün Gücünüzü Artırın.
• PlatoData.Network Dikey Üretken Yapay Zeka. Kendine güç ver. Buradan Erişin.
• PlatoAiStream. Web3 Zekası. Bilgi Genişletildi. Buradan Erişin.
• PlatoESG. karbon, temiz teknoloji, Enerji, Çevre, Güneş, Atık Yönetimi. Buradan Erişin.
• PlatoSağlık. Biyoteknoloji ve Klinik Araştırmalar Zekası. Buradan Erişin.
• Kaynak: https://www.nature.com/articles/s41467-023-41683-y