Hücre gerilmesinin biyomedikal araştırmalara entegre edilmesi
,
] Nefes alma, sindirim, kas kasılması, kalp atışı, beyin gelişimi gibi pek çok fizyolojik fonksiyon, hücrelerin sürekli olarak gerilmesini ve/veya sıkıştırılmasını gerektirir. Bu süreçlerdeki merkezi bir unsur, hücrelerin bu mekanik kuvvetleri algılama ('mekanosensing') ve mekanik bilgiyi bir yanıt olarak iletme ('mekanotransdüksiyon') yeteneğidir.Kutu 1). Örneğin, hücreler bağlandıkları ECM'nin sertliğini, onu gererek, yani hücre-ECM yapışma kompleksleri yoluyla ona çekme kuvvetleri uygulayarak aktif olarak araştırabilirler.
], ancak hücrelerin ECM mekanik özelliklerini algılamasına izin veren tüm araştırma mekanizmaları açıklığa kavuşturulmamıştır. Bilginin mekanik duyumu ve iletimi, hareketlilik ve soy farklılaşması gibi hücre değişen hücresel süreçleri yeniden programlayan bir dizi biyokimyasal ve biyomekanik yanıt üretir ve böylece insan (pato)fizyolojisini kritik bir şekilde etkiler.
,
,
] (Şekil 1, Anahtar şekil).
] Hücre iskeletinin birçok maddi özelliği arasında en dikkat çekici olanı, hücre dışı ortamlarının fiziksel özelliklerindeki değişikliklere (örneğin, ECM sertliği veya mekanik gerilme (MS)) yanıt olarak hücreler tarafından otonom ve aktif bir şekilde yeniden organize edilebilme yeteneğidir. Bu mekanik uyarlanabilirliğin merkezinde, hücrelerin çevrelerinin geometrisini ve fokal adezyonlar yoluyla çevrelerine uygulanan fiziksel kuvvetleri algıladığı bir dizi biyokimyasal ve mekanik süreç vardır; bu süreç 'mekanosensing' olarak adlandırılır.
,
] Hücrelerin yüzeylerinde, mekanik bilgiyi hücre içi olarak iletebilen ve farklı biyokimyasal sinyal yollarının aktivasyonuna yol açabilen mekanik algılama elemanları olduğu düşünülen çok sayıda farklı reseptör vardır. Örneğin MS, hücrelerin ECM'ye yapışmasına ve kuvvetlerin üzerine iletilmesine izin veren sabitleme noktaları olarak görev yapan integrinler gibi gerilerek aktive edilen proteinler aracılığıyla hücreler tarafından algılanır.
] Bu, MS'e yanıt olarak kalsiyum akışını aktive eder ve sonuçta hücre iskeletini ve onun kuvvet ve kasılma kabiliyetini yeniden düzenleyen çeşitli kinazları aktive eder. Bu kısmen, aktin filamentleri boyunca birbiri üzerinden kayarak kasılmayı sağlayan ve aktin aktif olarak kutupsal bir biçimde polimerize olan moleküler motorların (miyozin II) kuvvet üretme kapasitesi sayesinde elde edilir. Miyozin II'nin motor aktivitesi, ATP hidrolizi tarafından beslenen bir güç vuruşu mekanizması yoluyla ortaya çıkarılır. TFM kullanılarak, hücrelerin çevrelerine uyguladığı kuvvetler ölçülebilir; bu, fokal adezyonların ne kadar iyi organize edildiğinin ve altta yatan hücre iskeletine ne kadar iyi bağlandığının bir göstergesi olarak düşünülebilir.
,
] Hücresel mekanizmanın altında yatan tasarım ilkelerini, uyarlanabilir ağlarını ve hücre dışı kuvvetlere verdiği çeşitli yanıtları anlamak, yalnızca hücrenin sağlıkta ve hastalıkta nasıl çalıştığını anlamak için değil, aynı zamanda tasarlanmış dokuların daha iyi tasarlanması ve rejeneratif tıp için de son derece önemlidir. . Ortaya çıkan araştırma sorusuna bağlı olarak, ilgilenilen zaman ölçekleri saniyelerden dakikalara kadar değişebilir (örneğin, hücresel yapışma dinamikleri veya akut statik MS uygulaması üzerine hücre sertliğindeki değişiklikler).
,
]) saatlere ve hatta günlere kadar (örneğin, hücre içi bakteriyel patojenler tarafından memeli hücrelerinin enfeksiyonuna yanıt olarak hücre iskeleti ve çekiş gücü değişiklikleri)
]).
Şekil 1Anahtar rakam. Mekanik esneme (MS), hücresel davranış ve fonksiyonun birçok yönünü değiştirebilir.
] Hücre belirli bir gerginlikte statik olarak gerildiğinde, hücre iskeleti takviyesi meydana gelir, hücre yayılır (şeklini değiştirir) ve yeniden düzenlenen hücre iskeleti yoluyla matrisine artan çekiş kuvvetleri uygular.
,
] Hücrelere uygulanan statik ve siklik MS sırasında değişebilen ek hücre fonksiyonları ve davranışları arasında (A) proliferasyonu yer alır.
,
]; (B) hücresel göç [
]; (C) soy farklılaşması [
,
]; (D) apoptoz [
]; (E) hücresel hizalama ve 3 boyutlu organizasyondaki değişiklikler; (F) kortikal sertlik, yüzey reseptörlerinin miktarı ve bileşimi, glikokaliks organizasyonu; (G) tek katmanlı hücreler için hücreler arası iletişim ve sinyal dinamiği; (H) bariyer bütünlüğü ve hücreler arası kuvvet iletimi; (I) kommensal mikroplar da dahil olmak üzere patojenlerle etkileşimler; ve (J) bağışıklık veya kanser hücre dizileri dahil olmak üzere diğer hücre tipleriyle etkileşimler. Prensipte tüm bu değişiklikler videomikroskopi yoluyla izlenebiliyor. Kısaltmalar: ERK, hücre dışı sinyalle düzenlenen kinaz.
Mekanik gerilme (MS) dokularda ve hücreleri oluşturan hücrelerde her yerde bulunduğundan, deney sırasında bunun hesaba katılması kritik öneme sahiptir. in vitro. MS sırasında hücresel ve moleküler ölçekte meydana gelen uzay-zamansal değişiklikleri ortaya çıkarmak için, MS'in çok hücreli düzeneklere uygulanmasına izin veren CSD'ler kullanılır. Mikroskopi ile bir miktar uyumluluğa rağmen, MS sırasında canlı hücrelerin uzun süreli görüntülenmesi hala sınırlıdır. Bu derlemede öncelikle MS'in sağlık ve hastalıktaki önemine ilişkin arka plan sağlayarak biyolojik ve biyomedikal uygulamalar için CSD'lerin daha da geliştirilmesinin önemini vurguluyoruz. Daha sonra yaygın olarak kullanılan CSD'lerin etki tarzını, sınırlamalarını, uygulanabilirliğini ve canlı hücre videomikroskopisiyle uyumluluğunu inceleyeceğiz ve temel hücre biyolojisi ve ötesinde ortaya çıkan keşifleri daha da vurgulayacağız. Son olarak açık soruları ve CSD'lerin biyomedikal çekiciliğini ve uygulanabilirliğini iyileştirmenin yollarını tartışıyoruz. Bu kritik incelemeyle, MS'in hücre ve dokuyu modüle etmedeki rolünü daha kolay araştırmak için, esneme sırasında uzun vadeli görüntülemeye izin veren CSD'lerdeki daha ileri gelişmelere ilham vereceğimizi umuyoruz. (mekanik)biyoloji.
Sağlıkta ve hastalıkta dokularda MS ve onları oluşturan hücreler
,
] Fizyolojik MS'deki değişiklikler patolojilerin nedeni veya sonucu olabilir.Kutu 2). Örneğin, miyokardda MS, periyodik kalp kasılmalarının gelişimine ve düzenlenmesine rehberlik ederken, kardiyomiyositlerin gerilmeye tepkisinin yanlış düzenlenmesi çeşitli kalp hastalıklarıyla bağlantılıdır.
] (Kutu 2). Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, gelişimsel koşullar altında MS, kök hücre farklılaşmasını yönlendirir in vitroRejeneratif tıpta MS, tasarlanmış miyokardiyal dokuların gücünü ve işlevselliğini artırır.
] İlginç bir şekilde yerleşik makrofajlar, komşu kardiyomiyositlerle etkileşimleri sayesinde MS'i de algılayabiliyor. Görüntüleme, MS'te makrofajların aktive olduğunu ve böylece kardiyak yeniden yapılanmayı teşvik ederek başarısız kalbi koruduğunu ortaya çıkardı.
] Benzer şekilde, bağırsakta MS, bağırsak epitel hücrelerini (IEC'ler) gen ekspresyonlarını değiştirerek yeniden programlayabilir.
] ve beslenme düzenlemesi için tokluk sinyalleri üretme [
] (Kutu 2). IEC'lerin MS'e maruz kaldıktan sonra görüntülenmesi, ikincisinin, IEC'lerin haftalarca kommensal mikroplarla ortak kültürüne izin verdiğini ortaya çıkardı; bu, IEC ölümüne neden olan bakteriyel aşırı büyüme nedeniyle statik kültürlerde zor bir şeydir.
,
] Tutarlı bir şekilde, MS'in bozulduğu irritabl bağırsak hastalığı olan hastalarda aşırı bakteri çoğalması yaşandı.
] Enfeksiyon sırasında MS'in varlığı ve kommensallerle birlikte kültür yapılması, epiteli enfeksiyona ve yaralanmaya karşı korur.
] Bununla birlikte, bireysel türlerin kesin katkıları ve enfeksiyonu düzenlemek için kullandıkları mekanizmalar, muhtemelen videomikroskopi ile uyumsuzluk nedeniyle değerlendirilmemiştir. Hücre dışı fiziksel ipuçlarının etkisinin mikrobiyomdan ayrıştırılması, katkılarının kesin olarak belirlenmesine olanak sağlayabilir. (Görmek Kutu 3.)
Kalp atışı sırasında MS
].
Bağırsak peristaltizmi sırasında MS
], gen ekspresyonundaki değişiklikler de dahil olmak üzere, IEC yeniden programlaması nedeniyle mikrobiyom kompozisyonunu ve IEC'nin enfeksiyona duyarlılığını etkiler [
] Bu, açığa çıkmanın önemini vurgulamaktadır. in vitro hücrelerini MS'e daha yakından taklit etmek için in vivo durum. IEC bariyer bütünlüğü ve 3D mimarisi de in vivo MS uygulandığında dokular [
].
Solunum sırasında MS
] Bununla birlikte, mekanik ventilasyon alan akut solunum yetmezliği olan hastalarda, gerginlik seviyeleri %15-25'e yükselebilir ve bu da önceden var olan koşulları ağırlaştırabilir.Şekil I). Normal koşullar altında BEC'ler, pulmoner hava yollarını inhale tahriş edici maddelerden ve patojenlerden koruyan sağlam hücre-hücre yapışmalarından oluşan fiziksel bir bariyer oluşturur.
] Alerjenler ve patojenler hava yollarının daralmasına neden olarak epitelyumun çok daha yüksek gerilimlere maruz kalmasına neden olabilir.
], epitelde yapısal, biyofiziksel ve moleküler değişiklikleri indükleyerek ECM'nin yeniden şekillenmesine ve bariyer bütünlüğünün kaybına neden olabilir.
].
Kan damarlarında kan pompalanması sırasında MS
] kan pompalamasına bağlı olarak yaşadıkları siklik MS'deki değişikliklere yanıt vererek çoğalmalarını ve bariyer bütünlüklerini değiştirirler (Şekil I) [
] Doku mühendisliğinde, kök hücrelerin MS'e hazırlanması, hayvanlara implantasyonu takiben daha yüksek mekanik dayanıklılığa ve daha iyi fonksiyona sahip doku mühendisliği ile üretilmiş vasküler greftlerin oluşturulmasına yol açar.
].
Şekil ISağlıkta ve hastalıkta diferansiyel mekanik gerilme (MS) yaşayan insan dokularının illüstrasyonu.
], akut olarak uygulanan statik (akciğer hasarında olduğu gibi) kronik siklik MS'e karşı AEC işlevleri ve kaderi üzerinde farklı etkilere sahiptir [
] (Kutu 2). Bu, gerilme büyüklüğü (indüklenen gerinim), frekans ve yön gibi parametrelerin bağımsız olarak ayarlanmasına izin veren CSD'lerin öneminin altını çizer. AEC'lere benzer şekilde, kan damarlarının iç lümenini kaplayan endotel hücreleri (EC'ler), MS yönüne dik olarak uzar ve hücre-ECM ve hücre-hücre yapışmalarını gerilim büyüklüğüne ve zamana bağlı bir şekilde değiştirir.
,
] Fizyolojik zorlanmaya (%18) kıyasla yüksek şiddete maruz kalma (%5, astımlı hastaların bronkospazmı sırasında olduğu gibi) endotelyal hasarı bozar bariyer bütünlüğü aktivasyonu sonucunda hücre dışı sinyalle düzenlenen kinaz (ERK) MS'in hücrelere statik olarak ve döngüsel olarak uygulandığında da farklılık gösteren sinyalleşme ve hücre kontraktilitesindeki değişiklikler.
] (Şekil 1). Fizyolojik suşla karşılaştırıldığında yüksek büyüklük, aynı zamanda EC'lerin ve bunların glikokalikslerinin (koruyucu şeker elek kaplama hücreleri) transkripsiyon profilini değiştirebilir ve aterosklerotik plak oluşumuna katkıda bulunabilecek ECM'nin yeniden şekillenmesini indükleyebilir.
] Tahrik mekanizmalarının gerçek zamanlı olarak araştırılması, kan damarlarının nasıl hasar gördüğünün ve aterosklerozun nasıl geliştiğinin daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır. MS aynı zamanda endositoz ve sonrasında hücre zarı gerginliğindeki artış da dahil olmak üzere veziküler trafik işlemlerinin dinamiklerini de etkileyebilir.
,
] İlginç bir şekilde, yakın zamanda in vivo Çalışma, endositik yolakların gerilmeyle aktive edilen kanallar tarafından düzenlendiğini ve MS tarafından inhibe edilebileceğini göstermiştir.
] Birçok patojen hücreleri enfekte etmek için veziküler aracılı ticareti ele geçirdiğinden, bu daha iyi ilaç dağıtım yöntemleri geliştirmek ve enfeksiyonla mücadele etmek için önemli olabilir. Ek olarak, MS'e maruz kalma, hücreler MS sonrası elastik olmayan matrislere yerleştirildiğinde bile korunan EC oluşturma hafızasını yeniden programlamaktadır.
,
] Mekanik hafıza kavramıyla tutarlı olarak, EC'lerin MS ile ön koşullandırılması, iyi implante edilebilir vasküler greftlerin oluşturulması için kullanılan bir özellik olan bariyer bütünlüğünü arttırır.
] Bununla birlikte, doku ve hücre (pato)fizyolojisini daha iyi anlamak için, araştırma laboratuvarlarında yaygın olarak yapıldığı gibi, yalnızca MS'e maruz kalma sırasında değil, canlı hücrelerin görüntülenmesi çok önemlidir. Daha sonra sunulan literatür mikroskopi ile uyumlu CSD'lere odaklanmaktadır. Döngüsel germe sırasında canlı hücre görüntülemeyi mümkün kılan CSD'ler de vurgulanmıştır.
Çok hücreli düzeneklerin canlı hücre görüntülemesi için germe platformları: mühendislik hususları
], bir dizi temel alınarak çeşitli hücre germe platformları geliştirilmiştir. çalıştırma ticari olarak temin edilebilenler de dahil olmak üzere prensipler, özellikle Flexcell (Flexcell International'dan) ve StrexCell (STREX Inc.'den) biyoreaktörleri [
] Bu CSD'ler, MS'in çeşitli hücresel fonksiyonları nasıl etkilediği de dahil olmak üzere, giderek artan karmaşıklığa ilişkin biyolojik soruları yanıtlamak için kullanılmıştır.
] Ortaya çıkan biyolojik sorulara bağlı olarak, CSD tasarımı, yetenekleri ve otomasyon açısından aşağıdakiler de dahil olmak üzere çeşitli parametrelerin dikkate alınması gerekir: (i) yüksek çözünürlüklü canlı hücre görüntüleme yöntemleriyle uyumluluk; (ii) spesifik analizlerle uyumluluk (örneğin, özel erişim gerektiren enfeksiyon analizleri); (iii) (biyo)mekanik karakterizasyon yöntemleriyle uyumluluk; (iv) biyomimetik yetenekler (örn. uygulanan esnetmenin yön(ler)i); ve (v) diğer fiziksel ipuçlarını (örneğin, kesme sıvısı akışı) eşzamanlı olarak entegre etme olasılığı (Kutu 3). Daha sonra canlı hücre görüntülemeye özel ilgi göstererek mikroskopi ile CSD uyumluluğuna odaklanacağız. Cihaz tasarımı açısından canlı hücre görüntülemeyle uyumluluk (esas olarak ters floresans veya eş odaklı mikroskoplar kullanılarak gerçekleştirilir) şeffaf, ince, gerilebilir bir membran gerektirir. Bu tür membranlar kullanılarak üretilir. elastomerik malzemeler, en önemlisi polidimetilsiloksan (PDMS) veya diğer silikonlar ve kullanılarak çalıştırılır. motor çalıştırma or pnömatik çalıştırma vakum kullanarak. Diğer çalıştırma modları (örneğin, piezoelektrik, elektromanyetik) gösterilmiştir ancak bunlar yaygın olarak kullanılmamaktadır.
,
].
Motorla çalıştırılan hücre germe platformları
] Bağımsız olarak kontrol edilen motorlar özelleştirilebilir tek eksenli ve/veya çift eksenli germe desenler (Şekil 2A) kalp kapakçığının subconfluent interstisyel hücrelerinde. İnce membranlar üzerindeki PDMS kuyucuklarında kültürlenen hücreler (Çekiş kuvveti mikroskobu (TFM). Görüntüleme yalnızca germe işleminden sonra (sıfır gerinim konfigürasyonunda) yapıldı. Membranın esnekliği, küçük kalınlığı ve hücre kültürü kuyusunun büyük çapı (22 mm) nedeniyle, görüntüleme sırasında membranı desteklemek ve sıvının ağırlığının düşmesini önlemek için lamelli özel bir kuyu tutucusu gerekliydi. görüntü bozulmasına neden olur. Yazarlar TFM'yi sıfır gerinim konfigürasyonunda (yani döngüsel germenin sona ermesinden sonra) gerçekleştirdiğinden, bu sonuçta cihazı germe sırasında canlı hücre görüntülemeyle uyumsuz hale getirmiş olabilir. Aynı grup, kendi germe platformlarını geliştirmeden önce STREX Hücre Germe Sistemi ve Flexcell® Germe Sistemini kullanarak benzer araştırmalar yapmaya çalıştı.
] STREX, çeşitli hızlarda ve esneme oranlarında tutarlı bir hareket aralığı için PDMS tabanlı bir hücre kültürü odası ve yüksek hassasiyetli bir step motor kullanır. STREX iki ana CSD sunar: yüksek verimli, uzun süreli esnetmeye izin veren cihazlar ve canlı hücre görüntüleme için mikroskoba monte edilebilen cihazlar. Bununla birlikte, diğer PDMS cihazlarına benzer şekilde, görüntüleme tipik olarak germeden önce ve sonra gerçekleştirilir ve gerçek zamanlı görüntüleme yalnızca düşük (~10x) büyütmede mümkündür.
,
,
] Tek eksenli ve çift eksenli germe tek bir platformda birleştirilemez. Flexcell® cihazları pnömatik olarak çalıştırılır ancak aşağıdakilerle uyumlu değildir: ters mikroskoplarEsnek silikon membranlar yükleme direkleri tarafından desteklendiğinden [
] Son olarak Duda örneğinde olduğu gibi membransız cihazlar da geliştirilmektedir. ve diğerleri., bir manüel CSD'nin süzmek için kullanıldığı yer Drosophila melanogaster Sıvı ortamla doldurulmuş iki PDMS mikrokanalı arasında asılı duran kanat diski. Dinamik germe yapılmadı (birkaç dakikada bir ve 2 saate kadar bir germe döngüsü), bu da dönen disk konfokal mikroskobu kullanarak canlı görüntülemeyi mümkün kıldı.
].
Şekil 2Hücre germe cihazlarında (CSD'ler) ve germe modlarında yaygın olarak kullanılan çalıştırma prensipleri.
(A) Germe modları. Soldan, tek eksenli, iki eksenli, eşeksenli. Bu çizimin amacı, esneme sonrasında hücre hizalamasını göstermek değildir. in vitro. (B) Pnömatik olarak çalıştırılan CSD örneği. Bu cihazda, hücre kültürü kuyularının yanlarında (veya dairesel cihaz mimarileri durumunda bu bölmelerle çevrili) çalıştırma odaları bulunur. Cihazlara elastomerik hücre kültürü membranları yapıştırılmaktadır. Çalıştırma odalarına vakum uygulandığında hücre kültürü zarı, üzerinde kültürlenen hücrelerle birlikte gerilir. (C) Motorla çalıştırılan bir CSD örneği. Bu cihazda elastomerik bir membran, bir kelepçe vasıtasıyla bir elektrik motoruna bağlanır. Elektrik motoru hücre kültürü zarını çekip gererek ona bağlı hücrelere baskı uygular.
Pnömatik olarak çalıştırılan hücre germe platformları
] Bu CSD, iki çalıştırma odasıyla çevrili bir hücre kültürü odasından oluşuyordu ve 125 mikron kalınlığında bir hücre kültürü membranı kullanılarak kapatıldı (Şekil 2B). Vakum uygulamasının ardından, hücre kültürü odasında bulunan hücre tek katmanı, artan gerginlikte sürekli olarak (döngüsel olarak değil) tek eksenli olarak gerildi ve aynı anda, 7 saatlik aralıklarla ~ 1 saat boyunca iletilen ışık, hızlandırılmış mikroskopi kullanılarak gözlemlendi. Bununla birlikte, optik odak, özellikle daha uzun/daha kısa görüntü alma aralıkları isteniyorsa, optimal olmayan bir özellik olan germe sırasında manuel olarak ayarlandı. Benzer konfigürasyonlar, asılı elastomerik membranların, bağırsak peristaltizmini veya solunumunu taklit eden yan odalar aracılığıyla tek eksenli olarak pnömatik olarak çalıştırıldığı çip üzerinde organ platformlarında kullanılır.
] Çip üzerindeki organın biyomimetik doğasına rağmen, görüntüleme yetenekleri mikroskop hedefi ile hücreler arasındaki tipik olarak 200 μm'yi aşan büyük mesafe nedeniyle engellenmektedir. Askıya alınmış membranlar kullanan cihazların görüntülemeyle ilgili bir başka sınırlaması, hücreleri ayıran çoklu malzeme arayüzlerinden ve mikroskop hedefinden (örneğin, sıvı ortam ve elastomerler arasındaki arayüzler) kaynaklanmaktadır.
] Tek eksenli olarak gerilmiş hücre kültürü odacıklarına ek olarak, ince elastomerik hücre kültürü membranları kullanılarak kapatılmış çalıştırma halka odacıkları ile çevrelenmiş hücre kültürü kuyuları kullanılarak, yüksek çözünürlüklü canlı hücre görüntülemeyle uyumlu dairesel CSD'ler de gösterilmiştir. Çalıştırma halkası bölmesine vakum uygulandığında, hücre tek katmanı boyunca tekdüze eşit eksenli gerinim üretilir. Daha önce tartışılan tek eksenli gerilmenin aksine, eş çift eksenli esneme, genellikle hücrelerin deneyimlediği gerilim modellerini daha iyi taklit edebilir. in vivoilgi dokuya bağlı olarak (örneğin, peristalsis sırasında IEC'ler). Kreutzer ve diğerleri. böyle bir dairesel germe platformu bildirmiş ve bunu pluripotent kök hücrelerin kardiyak farklılaşmasını indüklemek için kullanmıştır.
] Canlı hücre görüntüleme ters bir mikroskop kullanılarak yapıldı. Bununla birlikte, çalıştırma odasına vakum uygulandığında hücre kültürü zarı, z yönünde ~315 μm kadar yer değiştirmiştir. Her ne kadar elastomerik membranların pnömatik çalıştırılması üzerine düzlem dışı bir yer değiştirme beklense de, bu sınırlama canlı hücre mikroskobu için zararlı olmasına rağmen literatürde sıklıkla tartışılmamaktadır. Bu sorunun üstesinden gelmek için Kreutzer ve diğerleri. Yer değiştirmenin görüntü kalitesi üzerindeki etkisini en aza indirmek için germe döngüleri arasında manuel olarak yeniden odaklanılır ve düşük büyütmeli hedefler kullanılır
], Hart'ınkine benzer ve diğerleri. rapor edildi [
].
Döngüsel germe sırasında canlı hücre görüntüleme
] Daha önceki bir çalışmada, benzer bir dairesel pnömatik CSD, epitel hücrelerine homojen eşeksenli gerilim uygulamak ve germe öncesinde, sırasında ve sonrasında hücre matris gerilimlerini haritalamak için kullanıldı.
] Yazarlar ayrıca germenin yanal hücre yer değiştirmesine ve odaklanmanın bozulmasına yol açtığını da belirtti. TFM ve canlı hücre görüntüleme için, her 2 dakikada bir (yani her germe döngüsünden sonra) manuel yeniden konumlandırma/yeniden odaklama gerçekleştirildi. Başka bir çalışmada, cilt de dahil olmak üzere birçok dokuda geçerli olduğundan, germe sırasında epitelyal kırılmanın altında yatan mekanizmaları incelemek için benzer bir CSD kullanıldı.
] CSD, iki Teflon halka arasına sıkıştırılmış ve dairesel bir yükleme direğinin üzerine yerleştirilmiş bir PDMS membranından (80-100 mikron kalınlığında) oluşuyordu. Membranın dış dairesel bölgesine vakum uygulanması, membran boyunca eşit eşeksenli gerilime neden oldu. Hücre kültürü alanı, üstten ve alttan objektif erişime izin verecek kadar genişti, bu da onu ters ve dik optik mikroskopi ile uyumlu hale getiriyordu. İlginç bir şekilde, kullanılan dairesel pnömatik CSD'ye rağmen, döngüsel germe sırasında canlı hücre görüntülemesi gösterildi ve ortam ağırlığından kaynaklanan görüntü bozulması veya germe sırasında membranın düzlem dışı yer değiştirmesi gibi yaygın sorunlar tartışılmadı. Nispeten yavaş germe hızı (her 10 dakikada bir gerçekleştirilen 30 dakikalık germe darbesi) ve deneylerin oldukça kısa uzunluğu (tek germe darbeleri gösterilmiştir) göz önüne alındığında, membran sapmasını düzeltmek için her germe döngüsünden sonra odağın yeniden ayarlanması mümkündür. Tablo 1 tartışılan bazı CSD'lerin önemli özelliklerini özetlemektedir.
Tablo 1Cihaz örnekleri ve bunların mikroskopi ile uyumluluğu
Hücre biyokimyası ve mekaniğinin karışmasını araştırmak için MS altında hücrelerin görüntülenmesi
Teknik olarak zor olmasına rağmen hücrelerin MS'e çift maruz kalması için girişimlerde bulunulmuştur. in vitro görüntüleme ile. Bu tür çalışmalar, hücrelerin MS'e yanıt olarak nasıl işlediğine, biyomekanik girdileri sinyallemeye nasıl dönüştürdüklerine ve bunun biyolojik ve biyomedikal bağlamlarla ne kadar alakalı olduğuna dair önemli bilgiler verdi. Daha sonra, germe sırasında canlı hücre görüntülemeyle daha iyi eşleşme için CSD'lerin daha da geliştirilmesini teşvik etmeyi umarak bazı ufuk açıcı çalışmaların ana hatlarını çizeceğiz.
] Bu, motor proteininin yer değiştirmesine atfedildi. miyozin II sitoplazmadan hücre korteksine doğru, iyileşmeye ise artış aracılık etti. aktinMiyozin kasılması muhtemelen miyozin II'nin sitoplazmaya geri gönderilmesinden kaynaklanmaktadır. Araştırılmamış olmasına rağmen, hücre-hücre ve hücre-ECM güçlerindeki değişiklikler (aralarında yüksek derecede çapraz karışma) hücre hızındaki değişikliklerin nedeni olabilir.
,
,
] Bu kuvvetlerin ölçülmesi, epitel MS ile tehdit edildiğinde bariyer bütünlüğünde zamana bağlı değişiklikleri ortaya çıkarabilir. Aslında, hücre-hücre bağlantıları, gerinim hızına bağlı bir şekilde yeniden modellenir ve bağlantı arızasını önlemek için düşük gerinim hızlarında stres oluşumunu rahatlatabilir.
] Bununla birlikte, gerinim büyüklüğü ve süresi yüksek olduğunda, epitel dokusunun gerilmesi, gerilmenin serbest bırakılması üzerine, kökeni gerilmeden ziyade hidrolik olan çatlak oluşumuna neden olur.
] Yani, epitelyal çatlaklar, gerilme sırasında ECM'de oluşan basınç birikiminden kaynaklanmaktadır; bu, epitelyal bütünlüğün, doku gerilmesi ile ECM hidroliği arasındaki güçlü bağlantıya bağlı olduğu hipotezini desteklemektedir. Benzer bir pnömatik olarak çalıştırılan CSD kullanılarak, çığır açan daha önceki bir çalışma (takip eden diğer çalışmalarla birlikte), MS'in hücrelere yüksek gerilimlerde veya hızda geçici olarak uygulandığında hücrelerin evrensel olarak akışkanlaşmaya maruz kaldığını, sertliklerini azalttığını ve hücre iskeletlerini parçaladığını, ancak daha sonra gösterdi. yeniden katılaşabilecekleri aşamalar [
,
,
] Eş zamanlı olarak, hücrelerin ECM'lerine uyguladığı çekiş stresleri, akut statik MS durumunda artar, ancak MS salınımı üzerine temel seviyelerin altına düşer; bu, hücrelerin hücre iskeletini yeniden düzenlemek ve gerilimi yeniden dağıtmak için potansiyel enerjiyi kullandığını ima eder.
] MS'te dokuların ve kurucu hücrelerin mekanik duyarlılığında büyüklük ve gerinim hızına bağlı değişiklikler de gözlemlenmiştir. in vivo [
] Hücrelerin MS sırasında geçirdiği bu zamana bağlı geçişlerin kalıcı mekanik hafıza oluşturmak için yeterli olup olmadığı, kısmen doku mühendisliğiyle olan ilgisi nedeniyle aktif bir araştırma alanı olmaya devam etmektedir.
,
].
] MS sonrası görüntüleme, MS'in çeşitli dokulardan dönüştürülmüş kanser hücresinin hayatta kalması üzerindeki etkisini incelemek için kullanıldı. in vitro. Çalışma, MS'e veya egzersize maruz bırakılan ve tümör büyümesinin mekanik güce bağlı bir inhibisyonunu gösteren kanserli fareler üzerinde yapılan daha önceki çalışmalarla motive edilmiştir.
,
] Pnömatik olarak çalıştırılan bir CSD kullanılarak MS'in, normal hücrelerde meydana gelenin tersine, kanser hücresi büyümesini inhibe ettiği ve apoptozu ("mekanoptoz") tetiklediği keşfedildi. Bu bulgular MS bazlı kanser tedavilerinin geliştirilmesinde daha fazla kullanılabilir. Bu çalışmanın aksine, tek tabakadaki epitel hücreleri onkojenik olarak dönüştürülmüş hücrelerle sabit koşullar altında karıştırıldığında, ekstrüzyon yoluyla dönüştürülmüş hücrelerden kurtulabildiler. Bununla birlikte, pnömatik olarak çalıştırılan bir CSD'de gerildiğinde, dönüştürülmüş hücreler, yapılarındaki değişiklikler nedeniyle tek katmanda kaldı. odak yapışması Dinamikler ve aktomiyosin kontraktilitesi, invaziv kanserli fenotipi teşvik eder.
] Bu bulgular arasındaki tutarsızlık, ikinci durumda hücre rekabetinin alt-birleşik hücrelerde değil, 'kalabalık' tek tabakada gerçekleşmesiyle açıklanabilir. MS sırasındaki görüntüleme, bu hücre yoğunluğuna bağlı değişikliklerin nasıl ortaya çıktığını açıklamaya yardımcı olabilir. Bununla birlikte, her iki çalışma da MS'i değerlendirmenin önemini vurgulamaktadır. in vitro kanserle ilgili deneyler.
] Doku gerilmesi üzerine ve kısa zaman ölçeklerinde miyozin II, aktin yeniden yapılanmasıyla ilgili asimetrik kablolar oluşturdu. Yazarlar bunun, mekanik bozulmaları tamponlamak ve şekli korumak amacıyla dokuyu sertleştirmeye yönelik hızlı bir yanıt olduğunu öne sürdüler. Gelecekteki gelişmeler, MS büyüklüğü ve sıklığındaki çeşitliliğin doku gelişimini nasıl etkileyebileceğinin incelenmesine olanak sağlayabilir. Ayrıca, kalkınma bağlamında [
] ve yara iyileşmesi sırasında [
], tek başına difüzyondan daha hızlı bir hücreden diğerine dalgalar halinde ilerleyen MS'ye duyarlı ERK aktivasyonu, hücresel hareketliliği ve doku organizasyonunu düzenleyen önemli bir mekanokimyasal süreç olarak ortaya çıkmıştır. Mekanik kuvvetler hücresel sinyallemeyle sıkı bir şekilde birleşir, böylece hücre polarizasyonunu ve toplu hücre göçünü yönlendirir.
,
] Bu çalışmalar dayanmaktadır Förster rezonans enerji transferi (FRET)Mikroskobi yöntemlerini kullanarak zaman ve mekanda ERK aktivasyonunu takip etmek üzere tasarlanmış biyosensörlere dayalı biyosensörler. Bu tür ölçümlerin biyomekanik tekniklerle (örn. TFM) birleştirilmesi, dokuların nasıl şekillendiğini ve yaralanmalar (örn. bir yara) durumunda homeostazise nasıl döndüklerini anlamak için mekanik ve biyokimyasal sinyalleşme arasındaki çapraz karışmayı sorgulamanın önemini açıkça kanıtladı. ERK, MS tarafından aktive edildiğinden, gelecekteki gelişmeler, pek çok dokuda meydana geldiği ve sabit kültürlerde ERK aktivasyonu üzerine görülenler gibi, çok hücreli düzenekler boyunca sinyal olaylarının dinamiklerinin düzenlenmesinde yer aldığı için, döngüsel MS'in rolünün belirlenmesini mümkün kılabilir.
Son sözler ve gelecek perspektifleri
] Son olarak, hızlandırılmış görüntüleme için ve germe modellerinin karmaşıklığına ve sıklığına bağlı olarak otomasyon gereklilikleri dikkate alınmalıdır.
Eş zamanlı veya daha sonra canlı hücre görüntülemeyle birleştirilmiş hücre germe platformları kullanılarak çok çeşitli biyolojik ve biyomedikal sorular yanıtlanabilir. Ancak bazı ticari seçeneklere rağmen uygulamaları sınırlıdır. Mevcut CSD'yi geniş uygulamadan alıkoyan şey nedir? Yüksek verimli deneyleri ve videomikroskopiyle uyumluluğu mümkün kılacak şekilde CSD'ler nasıl oluşturulabilir? Döngüsel germe sırasında canlı hücre mikroskobu görüntülemenin çoğu, düşük germe oranları ve 2D matrislerde bulunan hücrelerin görüntü alımları arasındaki uzun aralıklar kullanılarak gerçekleştirilir. Hem 2D hem de 3D matrislerde yüksek hızlarda döngüsel esneme sırasında canlı hücre görüntülemesine izin veren daha iyi hücre germe platformları geliştirerek, mekanotransdüksiyondaki kusurlarla ilişkili çeşitli hastalıkların ardındaki süreçleri daha iyi anlayabilir miyiz? Esnetme sırasında canlı hücre görüntülemeyle ilgili hangi sınırlamalar kullanılan gerdirme cihazından ayrılabilir ve özel mikroskop ekipmanıyla telafi edilebilir? Germe sırasında canlı hücre görüntüleme için ideal bir mikroskop neleri içerir? Böyle bir sistem, MS uygulaması sırasında biyokimyasal hücre sinyalleme süreçlerinin dinamikleri hakkında bilgi çıkarmak için FRET görüntülemenin veya diğer türdeki daha karmaşık görüntüleme yöntemlerinin gerçekleştirilmesine izin verir mi? Hücrelerin ECM'lerine (örn. TFM kullanarak) ve ayrıca tek katmandaki komşu hücrelere uyguladığı çekiş kuvvetleri eş zamanlı olarak ölçülebilir mi ki bu, bariyer bütünlüğünün bir temsilcisi olarak düşünülebilir mi? MS sırasında hücresel biyomekaniklerin biyokimyasal sinyallerle nasıl karıştığını ve böylece mekanobiyoloji alanını nasıl hızlandırdığını ortaya çıkarabilir miyiz? Germe deneylerinde kullanılan elastomerik membranların çoğu silikon bazlıdır. Esnetme deneyleri silikon bazlı olmayan membranlardan faydalanabilir mi? Uzun vadeli canlı hücre görüntülemeyi de kolaylaştıracak ümit verici aday materyaller var mı? Bu tür gelişmeler, hastalara başarılı bir şekilde implantasyonu iyileştirmek için tasarlanmış dokunun mekanik gücünü ve işleyişini daha da artırarak doku mühendisliği alanına fayda sağlayabilir mi?
Sözlük
aktin
Hücreler içinde uzun, dinamik filamanlar oluşturmak üzere (de)polimerize olan, hücre şeklini ve örneğin hücre hareketliliği için gerekli olan kuvvet iletimini destekleyen önemli hücre iskeleti proteini.
Çalıştırma
Enerjiyi mekanik kuvvete dönüştürerek fiziksel hareket elde etmesine yardımcı olan bir cihaz veya sistemin parçası olan aktüatörleri ifade eder.
Bariyer bütünlüğü
Örneğin temel iyonların, besin maddelerinin ve suyun geçirgenliğine izin veren, ancak zararlı maddelerin (örneğin patojenlerin) girişini kısıtlayan, tek katmanlı hücreler için hücreler arası yapışmaların düzenlenmesi mekanizması.
Hücre germe platformu
Bir CSD'nin yanı sıra bir hücre germe deneyini yürütmek için gerekli tüm diğer ilgili donanım ve yazılımı içeren eksiksiz hücre germe sistemi.
Elastomerik malzemeler
kauçuğa benzer elastikiyet sergileyen polimerler boyutsal olarak stabildir ancak düşük Young modülüne sahip elastik olarak deforme olabilen plastiklerdir.
Hücre dışı matris (ECM)
Vücuttaki hücre ve dokuları çevreleyen, destekleyen ve onlara yapı kazandıran geniş protein ve diğer molekül ağı.
Hücre dışı sinyalle düzenlenen kinaz (ERK)
Aktivasyon üzerine çoğalma, farklılaşma, göç ve hücre döngüsü gibi hücre süreçlerini düzenleyen gerilmeye duyarlı protein kinaz.
Odak adezyonları
ECM'ye bağlanmayı sağlayan hücrelerin bazal tarafında yer alan ve büyük ölçüde integrinler adı verilen transmembran heterodimerik proteinlerden oluşan kompleksler.
Förster rezonans enerji transferi (FRET)
Uygun sensörler kullanılarak FRET mikroskobu yoluyla ölçülebilen, enerjinin uyarılmış durumdaki bir floresan donörden temel durumdaki bir alıcıya aktarılması.
gecikme
bir sistemin durumundaki, yalnızca mevcut girdilere değil aynı zamanda geçmiş girdilere (yani geçmişine) bağlı olan bir değişiklik.
ters mikroskop
ters veya dik mikroskoplar, numuneyi tutan tablanın sırasıyla altında veya üstünde objektiflere sahiptir (yani numune sırasıyla alttan veya üstten görüntülenir).
mekanobiyoloji
Biyoloji ve mekaniğin kesişimindeki alan, hücrelerin ve dokuların biyolojik ve mekanik özellikleri arasındaki karışmayı ve bunların hücre ve doku fonksiyonlarını nasıl düzenlediğini araştırıyor.
Motor çalıştırma
Elektrik sinyallerinin bir motor kullanılarak harekete dönüştürülmesi.
Miyozin II
Hücre içindeki aktin filamentleri boyunca kayarak hücresel serbest enerjiyi biyolojik çalışmaya dönüştürebilen moleküler motor proteini.
Pnömatik çalıştırma
Basınçlı havanın veya vakum enerjisinin harekete neden olan mekanik kuvvetlere dönüştürülmesi.
Gerilme
fizikte deformasyonun ölçüsü. Bir stres uygulandığında (örneğin, germe sırasında) orijinal duruma göre konfigürasyondaki değişikliği ölçer.
Çekiş kuvveti mikroskobu (TFM)
Hücrelerin ECM'leri üzerinde uyguladığı kuvvetleri ölçmek için kullanılan bir tekniktir; bu, fokal adezyonların ne kadar iyi organize edildiğinin ve altta yatan hücre iskeletine ne kadar iyi bağlandığının bir göstergesi olarak düşünülebilir.
Tek eksenli ve/veya çift eksenli germe
tek eksenli, bir eksen boyunca uzanan; iki eksen boyunca uzanan iki eksenli; eşeksenli, tüm eksenler boyunca eşit olarak uzanan.
- SEO Destekli İçerik ve Halkla İlişkiler Dağıtımı. Bugün Gücünüzü Artırın.
- Plato blok zinciri. Web3 Metaverse Zekası. Bilgi Güçlendirildi. Buradan Erişin.
- Kaynak: https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(22)00332-8?rss=yes
