2000'li yılların başlarında İnsan Genomu Projesi sırasında biz insanların yalnızca 20,000 kadar protein kodlayan gene sahip olduğumuzun keşfi (toprakta yaşayan minik nematod solucanının sayısı kadar ve pirinç bitkisinin yarısından azı kadar) şok etkisi yarattı. . Ancak gururumuza inen bu darbe, insan genomunun düzenleyici bağlantılar açısından zengin olduğu fikriyle yumuşatıldı. Genlerimiz, DNA parçalarının ve kodladıkları moleküllerin (RNA ve proteinler) diğer genlerin "ifadesini" kontrol ettiği, kendi RNA ve proteinlerini yapıp yapmadıklarını etkilediği yoğun bir ağ içinde etkileşime girer. İnsan genomunu anlamak için bu gen düzenleme sürecini anlamamız gerekiyordu.

Ancak bu görevin genom dizisini çözmekten çok daha zor olduğu ortaya çıkıyor.

Başlangıçta, gen düzenlemesinin, bir gen ürününün dijital tarzda başka bir gen için açma/kapama düğmesi görevi görmesi gibi basit bir mesele olduğundan şüpheleniliyordu. 1960'larda Fransız biyologlar François Jacob ve Jacques Monod ilk kez bu konuyu açıkladılar. gen düzenleme süreci mekanik detayda: Escherichia coli Bakterilerde, bir baskılayıcı protein DNA'nın belirli bir bölümüne bağlandığında, şeker laktozunu sindirmek için enzimleri kodlayan bitişik gen grubunun transkripsiyonunu ve translasyonunu bloke eder. Monod ve Jacob'ın adını verdiği bu düzenleyici devre lak operonun düzgün ve şeffaf bir mantığı vardır.

Ancak karmaşık metazoanlarda (insanlar gibi karmaşık ökaryotik hücrelere sahip hayvanlar) gen düzenlemesi genellikle bu şekilde çalışmıyor gibi görünüyor. Bunun yerine, bir genin ifadesini kontrol etmek için bir şekilde işbirliği yapan, bir kromozom boyunca bulunan proteinler, RNA'lar ve DNA parçaları dahil olmak üzere bir molekül çetesini içerir.

Ökaryotlardaki bu düzenleyici sürecin, bakterilerde ve diğer basit prokaryotik hücrelerde tipik olarak görülenden daha fazla oyuncuya sahip olması sadece değildir; kategorik olarak farklı ve daha belirsiz bir süreç gibi görünüyor.

Stanford Üniversitesi'nde biyofizikçi ve biyomühendis liderliğindeki bir ekip Polly Fordyce, şimdi bu bulanık gen düzenleme modunun bir bileşenini ortaya çıkarmış gibi görünüyor. Onların işleri, geçen Eylül ayında yayınlandı Bilim, bir genin yakınındaki DNA'nın, çeşitli düzenleyici molekülleri hapsetmek için bir tür sığ kuyu görevi gördüğünü, onları harekete hazır tuttuğunu, böylece gerektiğinde genin etkinleştirilip etkinleştirilmeyeceğine ilişkin karara kendi seslerini de ekleyebileceklerini öne sürüyor.

Bu düzenleyici kuyucuklar kesinlikle tuhaf DNA parçalarından oluşuyor. Bir ila altı baz çifti uzunluğundaki kısa bir DNA dizisinin birçok kez tekrarlandığı dizilerden oluşurlar. Bu "kısa tandem tekrarların" (STR'ler) onlarca kopyası, aynı küçük "kelimenin" tekrar tekrar yazılması gibi, bu dizilerde bir araya getirilebilir.

STR'ler insan genomunda bol miktarda bulunur: Tüm DNA'mızın yaklaşık %5'ini oluştururlar. Bir zamanlar bunların "çöp" DNA'nın klasik örnekleri olduğu düşünülüyordu çünkü yalnızca STR'lerden oluşan tekrarlayan bir DNA "metni", örneğin bu metinde bir cümleyi oluşturan düzensiz harf dizileri kadar anlamlı bilgi tutamaz. madde.

Ancak yine de STR'ler kesinlikle önemsiz değildir: Huntington hastalığı, spinobulbar kas atrofisi, Crohn hastalığı ve bazı kanserler gibi rahatsızlıklarla ilişkilendirilmiştir. Geçtiğimiz birkaç on yılda, gen düzenlemesini bir şekilde geliştirebileceklerine veya engelleyebileceklerine dair kanıtlar birikti. Gizem, bu kadar az bilgi içeriğiyle nasıl bu kadar güçlü olabildikleriydi.

Karmaşık Hücreler İçin Karmaşık Kontroller

STR'lerin gen düzenlemesinin büyük resmine nasıl uyduğunu anlamak için bir adım geriye gidelim. Genlerin yanında rutin olarak RNA veya protein kodlamayan ancak düzenleyici işlevlere sahip DNA parçaları bulunur. Bakteriyel genler, polimeraz enzimlerinin bağlanarak bitişik DNA'nın RNA'ya transkripsiyonunu başlatabileceği "promotör" bölgelere sahiptir. Ayrıca rutin olarak baskılayıcı proteinlerin bağlanarak transkripsiyonu bloke edebildiği ve bir geni kapatabildiği "operatör" bölgelerine de sahiptirler. lak operon.

İnsanlarda ve diğer ökaryotlarda düzenleyici diziler daha çok sayıda, daha çeşitli ve kafa karıştırıcı olabilir. Örneğin güçlendiriciler olarak adlandırılan bölgeler, bir genin kopyalanma olasılığını etkiler. Güçlendiriciler genellikle transkripsiyon faktörleri adı verilen ve gen ifadesini artırmak veya engellemek için bağlanabilen proteinlerin hedefidir. Garip bir şekilde, bazı güçlendiriciler düzenledikleri genlerden onbinlerce baz çifti uzaktadır ve onlara yalnızca paketlenmiş bir kromozomdaki DNA döngülerinin fiziksel olarak yeniden düzenlenmesi yoluyla yaklaşırlar.

Ökaryotik gen düzenlemesi, tipik olarak, bir veya daha fazla transkripsiyon faktörü ve diğer moleküllerin yanı sıra, bu çok çeşitli düzenleyici DNA bloklarını içerir; hepsi, bir genin ne yapması gerektiğine karar vermek için toplanan bir komite gibi bir genin etrafında toplanır. Gevşek ve yoğun bir küme halinde toplanırlar.

Çoğunlukla moleküler katılımcılar, moleküler biyolojide yaygın olan son derece seçici "kilit ve anahtar" eşleşmeleri yoluyla etkileşime girmiyor gibi görünüyor. Bunun yerine, çok daha az seçicidirler, sanki ortalıkta dolaşıyormuş ve birbirleriyle kısa sohbetler başlatıyormuş gibi, oldukça zayıf ve seçici olmayan bir şekilde etkileşime girerler.

Aslında, transkripsiyon faktörlerinin ökaryotlarda DNA'ya nasıl bağlandığı bir gizemdi. Uzun zamandır, bir transkripsiyon faktörünün bir kısmının, tıpkı bir yapbozun parçaları gibi, DNA'daki bağlayıcı bir "motif" dizisiyle yakından eşleşmesi gerektiği varsayılmıştı. Ancak bu tür motiflerden bazıları tanımlanmış olsa da bunların varlığı, bilim adamlarının hücrelerde DNA'ya yapışan transkripsiyon faktörlerini buldukları yerle her zaman çok iyi bir şekilde ilişkili değildir. Bazen transkripsiyon faktörleri herhangi bir motifin olmadığı bölgelerde kalırken, transkripsiyon faktörlerine güçlü bir şekilde bağlanması gerekiyormuş gibi görünen bazı motifler boş kalır.

Fordyce, "Geleneksel olarak genomikte amaç, genomik bölgeleri transkripsiyon faktörleriyle 'bağlı' veya 'bağlanmamış' olarak ikili bir şekilde sınıflandırmaktı, dedi. “Fakat resim bundan çok daha incelikli.” Bu gen düzenleme "komitelerinin" bireysel üyeleri, toplantılarda her zaman mevcut veya toplantılarda bulunmuyor gibi görünüyor; daha ziyade, orada bulunup bulunmama konusunda farklı olasılıklara sahipler.

Biyofizikçi, ökaryotlardaki gen düzenlemesinin büyük moleküler kompleksler arasındaki çok çeşitli zayıf etkileşimlere dayanma eğiliminin "teorik olarak ele alınmasını oldukça zorlaştıran şeylerden biri" olduğunu söyledi. Thomas Kuhlman Riverside'daki Kaliforniya Üniversitesi'nden şunları yazdı: bir yorum Fordyce laboratuvarının makalesinde Bilim. Görünüşte kaotik olan bu süreçten, genleri açıp kapatmaya ilişkin kesin kararların nasıl ortaya çıktığı derin bir bilmecedir.

Bu karar sürecinin gizemli bulanık mantığının ötesinde, tüm komite üyelerinin doğru odaya nasıl gidip orada kaldıkları sorusu da var. Moleküller genellikle hücrenin etrafında difüzyon yoluyla hareket eder, su gibi çevredeki diğer tüm moleküller tarafından darbelenir ve rastgele yönlerde dolaşırlar. Bu gevşek komitelerin düzenleyici işlerini yapamayacak kadar hızlı bir şekilde dağılmalarını bekleyebiliriz.

Fordyce ve meslektaşları, STR'lerin devreye girdiği yerin burası olduğunu düşünüyor. STR'ler, DNA'nın güçlendirici bölgelerinde dikkat çekici derecede yaygın. Araştırmacılar makalelerinde STR'lerin, transkripsiyon faktörlerini bir araya getiren ve onların kaybolmasını engelleyen yapışkan yamalar gibi davrandığını ileri sürüyorlar.

Yapışkanlığın İnce Ayarını Yapmak

Fordyce'in grubu, STR sekansındaki farklılıkların transkripsiyon faktörlerinin bir bağlanma motifine yapışmasını nasıl etkilediğini sistematik olarak araştırdı. Belirli bir altı bazlı motife bağlı olan iki faktöre (biri mayadan, diğeri insanlardan) baktılar. Araştırmacılar, motif rastgele bir dizi yerine bir STR ile kuşatıldığında hem bu bağlanmanın gücünü (veya afinitesini) hem de transkripsiyon faktörlerinin takılıp kalma hızını (kinetik) ölçtüler. Karşılaştırma için faktörlerin yalnızca STR'ye ve tamamen rastgele bir DNA dizisine ne kadar kolay bağlandığına baktılar.

"Bu alandaki en büyük zorluklardan biri, genomun belirli bir pozisyonunda transkripsiyon faktörünün bağlanmasını etkileyen sayısız değişkenin çözülmesidir" dedi. David Suterİsviçre'deki Lozan İsviçre Federal Teknoloji Enstitüsü'nde moleküler biyolog. DNA şekli, diğer DNA bölümlerine yakınlık ve DNA moleküllerindeki fiziksel gerilim, transkripsiyon faktörünün bağlanmasında rol oynayabilir. Bu parametrelerin değerleri muhtemelen genomun her pozisyonunda ve belki de hücre tipleri arasında ve belirli bir pozisyondaki tek bir hücre içinde zaman içinde farklılık gösterebilir. Suter, "Bu, ölçülmesi çok zor olan, bilinmeyen değişkenlerden oluşan geniş bir alan" dedi.

Kuhlman, Stanford ekibinin yaptığı gibi iyi kontrol edilen deneylerin bu kadar faydalı olmasının nedeninin bu olduğunu ekledi. Genellikle araştırmacıların bu gibi zayıf etkileşimleri ölçmesi gerektiğinde iki seçeneği vardır: Çok ayrıntılı, son derece hassas birkaç ölçüm yapıp bunlardan genelleme yapabilirler ya da çok sayıda hızlı ve kirli ölçüm alıp matematiksel olarak karmaşık hesaplamalar yapabilirler. Sonuç çıkarmak için istatistiksel yöntemler. Ancak Kuhlman, Fordyce ve meslektaşlarının "her iki açıdan da en iyisini elde etmek amacıyla" yüksek verimli deneyler sırasında hassas ölçümler yapmak için otomatik, mikroakışkan çip tabanlı bir prosedür kullandığını söyledi.

Stanford ekibi, farklı STR dizilerinin, transkripsiyon faktörlerinin DNA'ya bağlanma afinitelerini 70 katına kadar değiştirebildiğini buldu; bazen transkripsiyon faktörü bağlanması üzerinde bağlanma motifinin dizisini değiştirmekten daha fazla etkiye sahiptirler. Ve baktıkları iki farklı transkripsiyon faktörü için etkiler farklıydı.

Dolayısıyla STR'ler, transkripsiyon faktörlerinin bir DNA bölgesine yerleşme ve dolayısıyla bir geni düzenleme becerisine ince ayar yapabiliyor gibi görünüyor. Ama tam olarak nasıl?

Gene Yakın Bir Bekleme Odası

Araştırmacılar, bir transkripsiyon faktörünün DNA'yı bağlayan kısmının bir STR ile zayıf bir şekilde etkileşime girebileceğini ve bu afinitenin tam gücünün STR dizisine bağlı olduğunu düşündüler. Böyle bir bağlayıcılık zayıf olduğundan pek bir özgüllüğü olmayacaktır. Ancak bir transkripsiyon faktörü bir STR tarafından tekrar tekrar gevşek bir şekilde yakalanır ve serbest bırakılırsa, kümülatif etki, transkripsiyon faktörünü genin yakınında tutmak ve böylece gerektiğinde motif bölgesine güvenli bir şekilde bağlanma olasılığını artırmak olacaktır.

Fordyce ve meslektaşları, STR'lerin bu nedenle transkripsiyon faktörlerinin düzenleyici bir bağlanma bölgesinin yakınında geçici olarak toplanabileceği bir "lobi" veya kuyu görevi gördüğünü öngördü. "Bir STR'nin tekrarlayan doğası, onu oluşturan herhangi bir tek bağlanma bölgesinin zayıf etkisini güçlendirir" dedi. Connor HortonÇalışmanın ilk yazarı olan ve şu anda Berkeley'deki California Üniversitesi'nde doktora öğrencisi olan Dr.

Tersine, bazı STR'lerin aynı zamanda transkripsiyon faktörlerini düzenleyici dizilerden uzaklaştırarak, transkripsiyon faktörlerini başka bir yerde bir sünger gibi emerek hareket edebildiğini de ekledi. Bu şekilde gen ifadesini engelleyebilirler.

Suter, çalışmanın "STR'lerin in vitro transkripsiyon faktörlerinin bağlanmasını doğrudan etkilediğini ikna edici bir şekilde gösterdiğini" söyledi. Dahası, Stanford ekibi, in vitro deneylerinde görülen etkilerin, canlı hücrelerde (yani in vivo) da meydana geldiğini göstermek için bir makine öğrenme algoritması kullandı.

Fakat Robert TjianBerkeley'den bir biyokimyacı ve Howard Hughes Tıp Enstitüsü'nden bir araştırmacı, belirli bir STR-transkripsiyon faktörü kombinasyonunun gerçek hücrelerde gen ekspresyonu üzerinde ne gibi bir etkiye sahip olduğundan emin olmak için henüz çok erken olabileceğini düşünüyor.

Tjian, Xavier Darzacq ve Berkeley'de birlikte işlettikleri laboratuvardaki meslektaşları, STR'lerin transkripsiyon faktörlerini gen düzenleyici bölgelerin yakınında yoğunlaştırmanın bir yolunu sunduğu konusunda hemfikir. Ancak transkripsiyonu aktive etmek için faktörlerin birbirine ne kadar yakın olması gerektiğini bilmeden, bu sonucun işlevsel önemini anlamak zordur. Tjian, bir STR'nin canlı bir hücreye dahil edilmesinin hedef genin ekspresyonunu öngörülebilir şekilde etkileyip etkilemediğini görmek istediğini söyledi. Şu anda "STR'lerin in vivo [düzenleyici] mekanizmaların önemli bir yönü olacağına ikna olmadığını" söyledi.

Kombinatoryal Dilbilgisi

STR kuyucuklarındaki transkripsiyon faktörü bağlanmasının hem gücü hem de seçiciliği zayıf olduğundan, böyle bir mekanizmanın hücrelerin ihtiyaç duyduğu kesin gen düzenleme türünü nasıl güvenilir bir şekilde sağladığı hala devam eden bir bulmacadır. Fordyce, bu tür bir etki özgüllüğünün birçok kaynaktan gelebileceğini düşünüyor; yalnızca STR dizilerindeki farklılıklardan değil, aynı zamanda transkripsiyon faktörleri ve düzenlemede yer alan diğer proteinler arasındaki işbirlikçi etkileşimlerden de.

Horton, tüm bunlar göz önüne alındığında, belirli bir STR-transkripsiyon faktörü kombinasyonunun bir genin ifadesi üzerindeki etkisini tahmin etmenin kolay olup olmayacağının açık olmadığını söyledi. Sürecin mantığı aslında bulanık. Horton, etkinin "gramerinin" muhtemelen kombinatoryal olduğunu ekledi: Sonuç, transkripsiyon faktörleri ve diğer moleküllerin farklı kombinasyonlarına bağlıdır.

Stanford ekibi, transkripsiyon faktörlerinin belki de %90'ının STR'lere duyarlı olduğunu, ancak insan genomunda STR türlerinden çok daha fazla türde transkripsiyon faktörü bulunduğunu düşünüyor. Horton, "Bir STR dizisinin mutasyona uğraması, o hücre tipindeki 20 farklı transkripsiyon faktörünün bağlanmasını etkileyebilir ve bu da herhangi bir spesifik transkripsiyon faktörünü etkilemeden yakındaki genin transkripsiyonunda genel bir azalmaya yol açabilir" dedi.

Yani aslında Stanford ekibi, canlı hücrelerdeki gen düzenlemesinin tek ve basit bir mekanizma tarafından yönlendirilmeyeceği konusunda Tjian'la aynı fikirde. Aksine, transkripsiyon faktörleri, bunların DNA bağlanma bölgeleri ve diğer düzenleyici moleküller, etkilerini kolektif olarak uygulayan yoğun toplantılar halinde bir araya gelebilir.

"Artık DNA elemanlarının transkripsiyon faktörlerini kofaktörlerle yoğunlaşacak kadar kalabalıklaştırabileceği fikrini destekleyen çok sayıda örnek var" dedi. Richard GençMassachusetts Teknoloji Enstitüsü'nün Whitehead Enstitüsü'nden hücre biyoloğu. Arttırıcılar bu kalabalığı oluşturmak için birçok transkripsiyon faktörünü bağlar. STR'ler, transkripsiyon faktörlerinin bir genin yakınında toplanmasına yardımcı olan bir bileşen olabilir, ancak hikayenin tamamı bunlar olmayacaktır.

Prokaryotlarda baskın olan düzenleyici proteinler ve DNA bölgeleri arasındaki güçlü ve spesifik etkileşimlere güvenmek yerine neden genleri bu kadar karmaşık bir şekilde düzenliyoruz? Büyük ve karmaşık metazoaları mümkün kılan şeyin böyle bir bulanıklık olması mümkündür.

Yaşayabilen türler olabilmek için organizmaların gelişebilmesi ve değişen koşullara uyum sağlayabilmesi gerekir. Hücrelerimiz çok büyük ama sıkı bir şekilde belirlenmiş gen düzenleyici etkileşimler ağına bağlı olsaydı, tüm mekanizmayı bozmadan bu düzende herhangi bir değişiklik yapmak zor olurdu; tıpkı herhangi bir parçayı çıkarırsak (veya hatta biraz yerinden çıkarırsak) bir İsviçre saatinin arıza yapması gibi. sayısız dişli çarkından. Bununla birlikte, düzenleyici moleküler etkileşimler gevşekse ve oldukça belirsizse, sistemde yararlı bir gevşeklik vardır; tıpkı bir komitenin, üyelerinden biri hasta olsa bile genellikle iyi bir karara varabilmesi gibi.

Fordyce, bakteriler gibi prokaryotlarda, aranacak genomun daha küçük olması nedeniyle transkripsiyon faktörlerinin bağlanma bölgelerini bulmasının nispeten kolay olabileceğini belirtiyor. Ancak genom büyüdükçe bu daha da zorlaşıyor. Fordyce, ökaryotların büyük genomlarında, "geçici olarak 'yanlış' bir bağlanma bölgesinde sıkışıp kalma riskine artık tahammül edemezsiniz" dedi, çünkü bu, değişen çevre koşullarına hızlı tepki verme yeteneğini tehlikeye atacaktı.

Üstelik STR'lerin kendisi de oldukça evrimleşebilir. Dizilerinin uzaması veya kısalması ya da "transkripsiyon faktörü kuyusunun" boyutunda ve derinliğinde bir değişiklik, DNA replikasyonu veya onarımındaki aksilikler veya kromozomların cinsel rekombinasyonu yoluyla kolaylıkla meydana gelebilir. Fordyce'e göre bu, STR'lerin "bu nedenle, hayvanların ve bitkilerin gelişimini yönetenler gibi, hassas transkripsiyonel programlar için yeni düzenleyici unsurların geliştirilmesi ve mevcut düzenleyici modüllerin ince ayarının yapılması için hammadde olarak hizmet edebileceğini" öne sürüyor.

Zayıf Etkileşimlerin Gücü

Bu tür düşünceler, moleküler biyologların genomdaki zayıf ve nispeten seçici olmayan etkileşimlere daha fazla dikkat etmelerine yol açıyor. Bunların çoğu, sabit ve kesin bir yapıya sahip olmak yerine, gevşek ve gevşek, biyokimyacıların ifadesiyle "doğal olarak düzensiz" proteinler içerir. Young, eğer proteinler yalnızca katı yapısal alanlarda çalışıyorsa, bunun yalnızca düzenleyici sistemlerin ne kadar iyi gelişebileceğini değil, aynı zamanda yaşamda görülen dinamik düzenleme türlerini de sınırlayacağını açıkladı. Young, "İsviçre saatlerindeki gibi yalnızca kararlı yapısal unsurlarla çalışan canlı bir organizma, hatta bir virüs bile bulamazsınız" dedi.

Belki de evrim, ökaryotlarda gen düzenlemesine yönelik böylesine karmaşık ama sonuçta daha etkili bir çözümün bir bileşeni olarak STR'lere rastlamıştır. STR'lerin kendileri çeşitli şekillerde ortaya çıkabilir; örneğin, DNA replikasyonundaki hatalar veya genom boyunca kendilerinin kopyalarını oluşturan, transposable elementler adı verilen DNA bölümlerinin aktivitesi yoluyla.

Kuhlman, "Proteinler ve tekrarlayan diziler arasında ortaya çıkan zayıf etkileşimler, meydana geldiği hücrelere seçici avantaj sağlayabilecek bir şeydi" dedi. Onun tahmini, bu bulanıklığın muhtemelen ökaryotlara dayatıldığı, ancak "sonradan bunu kendi çıkarları için kullanabildikleri" yönünde. Bakteriler ve diğer prokaryotlar, iyi tanımlanmış "dijital" düzenleyici mantığa güvenebilirler çünkü hücreleri, hareket etme ve çoğalma gibi yalnızca birkaç basit, farklı durumda var olma eğilimindedir.

Ancak metazoanların farklı hücre durumları "çok daha karmaşık ve bazen bir sürekliliğe yakın" dedi Suter, bu nedenle daha belirsiz "analog" düzenlemeyle daha iyi hizmet veriyorlar.

Tjian, "Bakterilerdeki ve ökaryotlardaki gen düzenleyici sistemler oldukça farklılaşmış gibi görünüyor" dedi. Monod'un bir zamanlar şunu belirttiği söylenirken, "için doğru olan şey E. coli fil için de geçerli”, öyle görünüyor ki bu her zaman böyle değil.