Kripto izolasyonu ve organoid kültürü

RCCHan™'dan kripto izolasyonu: WIST dişi sıçan duodenumu ve organoid kültürü önceki rapora göre gerçekleştirildi²¹. Kriptler, buz üzerinde 30 dakika boyunca Nazik Hücre Ayrıştırma Reaktifi (STEMCELL Technologies) kullanılarak izole edildi. Sindirilen içerikler 70 µm'lik bir süzgeçten süzüldü ve 300x'te santrifüj edildi.g 5 °C'de 4 dakika süreyle. Peletler buz soğukluğunda Gelişmiş DMEM/F-12 ile yeniden süspanse edildi ve 150x'te santrifüjlendi.g 2 °C'de 4 dakika süreyle. Kript fraksiyonu, Gelişmiş DMEM/F-100, penisilin/streptomisin (Thermo Fisher Scientific), 356231 mM HEPES'ten (Thermo Fisher Scientific) oluşan bazal ortama %12 Matrigel (büyüme faktörü azaltılmış, Corning, Kat# 10) ile gömüldü. ), 2 × B-1 Takviyesi (Thermo Fisher Scientific) ile desteklenen 27 mM GlutaMAX-I (Thermo Fisher Scientific), 1 mM N-asetil-sistein, 10 nM Gastrin (Sigma-Aldrich), 100 ng/ml rekombinant fare Noggin (Peprotech), 50 ng/ml rekombinant fare EGF (Thermo Fisher Scientific), 100 ng/ml rekombinant insan IGF-1 (BioLegend) , 50 ng/ml rekombinant insan bazik FGF (FGF-2) (Reprocell), 1 µg/ml rekombinant insan R-spondin 1 (FUJIFILM Wako Pure Chemical), 500 nM A83-01 ve %10 Afamin/Wnt3a CM (JSR) . Tomurcuklanan türdeki organoidler mekanik bozulmayla toplandı ve geçti. İlk pasaja kadar kültürün ilk 10 günü boyunca 27632 uM Y-2 ilave edildi ve ilk pasajdan EGF çıkarıldı. Sıçan organoidleri, 1 x B-27 Takviyesi, 1 mM ile desteklenmiş bazal ortamdan oluşan ΔE ortamında tutuldu N-asetil-sistein, 10 nM Gastrin, 100 ng/ml Noggin, 100 ng/ml IGF-1, 50 ng/ml ısıya dayanıklı rekombinant insan bFGF (Thermo Fisher Scientific), 1 veya 0.5 μg/ml R-spondin 1, 500 nM A83-01 ve %10 Afamin/Wnt3a CM. Tek katmanlı kültür için, sıçan organoidleri, 10 °C'lik bir su banyosunda 5 dakika boyunca TrypLE Select Enzimi (37x) ile ayrıştırıldı ve 70 µm'lik bir hücre süzgecinden filtrelendi. Süzüntü 300x'te santrifüj edildi.g 3 °C'de 4 dakika süreyle bekletildi ve süpernatan atıldı ve tek hücreler, 50 ng/ml EGF ve 10 uM Y-27632 ile desteklenen AE ortamı ile yeniden süspanse edildi. 100 μL hücre süspansiyonu (7.0 × 10)⁴ Hücre/oyuk), 353095 °C'de en az 30 saat boyunca PBS ile 2 kat seyreltilmiş Matrigel ile kaplanmış hücre kültürü eklentisine (Corning, Kat#37) ilave edildi. Y-27632'ye yalnızca ilk günde kültür ortamı eklendi. Parlak alan görüntüleri ters bir mikroskopla (IX83, Olympus) elde edildi.

Kistle zenginleştirilmiş organoitlerin geliştirilmesi

Sıçan organoidleri, 10 °C'lik bir su banyosunda 5 dakika boyunca TrypLE Select Enzimi (37x) ile ayrıştırıldı ve 70 µm'lik bir hücre süzgecinden filtrelendi. Tek hücreler, 1 x B-27 Takviyesi, 1 mM ile desteklenmiş bazal ortamdan oluşan kist bakımından zenginleştirilmiş ortamla yeniden süspanse edildi N-asetil-sistein, 10 nM Gastrin, 100 ng/ml Noggin, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml IGF-1, 50 ng/ml ısıya dayanıklı bFGF, 0.5 µg/ml R-spondin 1, 500 nM A83- 01, 10 uM Y-27632 ve %20 Afamin/Wnt3a CM. 3.0 × 10⁴ hücreler 50 ul Matrigel ile gömüldü ve kist açısından zengin ortamla kültürlendi. Ortam her 2 veya 3 günde bir değiştirildi ve kist bakımından zengin organoidler, mekanik ayrışma yoluyla her 3 veya 4 günde bir pasajlandı.

Tek katmanlı kültür

Geleneksel organoidler/kistle zenginleştirilmiş organoidler, TrypLE Select Enzimi (10x) kullanılarak tek hücrelere ayrıştırıldı. 70 µm'lik hücre süzgeci ile filtrasyon ve santrifüjleme sonrasında, hücre peleti kist açısından zengin ortamda yeniden süspanse edildi ve 3.5 x 10'ya ayarlandı.⁵ hücre/mL. 200 uL hücre süspansiyonu, 3378 saat boyunca 3470 °C'de soğuk PBS ile 50 kat seyreltilmiş Matrigel ile kaplanmış Transwell (Corning, Kat#37 veya 2) üzerine ekildi ve bazal bölmeye ortam ilave edildi. 2. veya 3. günde ortam, 1 x B-27 Takviyesi, 1 mM içeren bazal ortamdan oluşan farklılaşma ortamıyla değiştirildi. N-asetil-sistein, 10 nM Gastrin, 100 ng/ml Noggin, 0.5 ug/ml R-spondin 1, 500 nM A83-01, 10 uM Y-27632, 3 mM VPA (Abcam). Ortam her 2 veya 3 günde bir değiştirildi. İndüksiyon tahlili için, 50 uM p-naftoflavon (Sigma), 5 uM 3-metilkolantren (Sigma) veya 100 nM la, 1-dihidroksivitamin D25 (Sigma) içeren farklılaşma ortamı 3 saat süreyle maruz bırakıldı. CYP48A aktivitesi ve CYP1A aktivitesi, üreticinin protokolüne göre P3-Glo Tahlilleri ile analiz edildi (CYP450A için lusiferin-CEE, CYP1A için lusiferin-IPA, Promega). Tek katmanlı bütünlük TEER ile değerlendirildi. TEER değeri Millicell ERS-3 sistemi (Merck) kullanılarak ölçüldü.

Histolojik inceleme

Daha önce açıklanan yöntemle sıçan organoidlerinden oluşan bir parafin bloğu hazırlandı.⁴⁷. Kısaca, sıçan organoidleri oda sıcaklığında 4 saat boyunca %1 Glutaraldehid ile sabitlendi. Matrigel kubbesi pipetleme yoluyla bozuldu ve toplandı, ardından AMeX yöntemiyle parafine gömüldü⁴⁸. HE slaytları hazırlandı ve AB-PAS yapıldı.

Organoidler ve tek katman için tüm montaj immün boyama

Kültür ortamının çekilmesinden sonra Matrigel kubbesi, oda sıcaklığında 2 dakika boyunca %30 paraformaldehit (PFA) ile sabitlendi. PBS yıkandıktan sonra %0.5 Triton X-100 içeren PBS ilave edildi ve gece boyunca 4 °C'de geçirgenleştirildi. Bloklama, oda sıcaklığında 0.5 saat boyunca %100 Triton X-6 içeren BlockAid Bloklama Solüsyonu (Thermo Fisher Scientific) ile gerçekleştirildi. Birincil antikorlar [Alexa Fluor 555 etiketli anti-Ki-67 antikoru (Clone B56, BD Biosciences), anti-Sox9 antikoru (Clone D8G8H, Cell Signaling Technology), anti-CK20 antikoru (Clone SA35-03, Thermo Fisher Scientific), bloklamada anti-P-gp antikoru (Clone F4, Thermo Fisher Scientific), anti-ZO-1 antikoru (Clone ZO1-1A12, Thermo Fisher Scientific) ve anti-fosfo-Ezrin antikoru (Clone 48G2, Cell Signaling Technology)] %0.5 Triton X-100 içeren çözelti ilave edildi ve 3 gün boyunca 4 °C'de inkübe edildi. Bundan sonra numune, %0.5 Triton X-100 içeren PBS ile üç kez yıkandı, ikincil antikor [Alexa Fluor 1 etiketli anti-tavşan IgG antikoru (Thermo Fisher Scientific), Alexa ile 2 veya 4 gün boyunca 488 °C'de inkübe edildi. Fluor Plus 555 etiketli anti-tavşan IgG antikoru (Thermo Fisher Scientific) veya Alexa Fluor 555 etiketli anti-fare IgG1 antikoru (Thermo Fisher Scientific)] %0.5 Triton X-100 içeren bloklama solüsyonunda. Üç kez %0.5 Triton X-100 içeren PBS ile yıkandıktan sonra kuyucuklar, oda sıcaklığında 2 saat boyunca SeeDB1G Solüsyonu 1 (%3 saponinli 350/2 x Omnipaque3) ile inkübe edildi, Solüsyon 2 (1/2 x Omnipaque350 ve %2 saponin ile) Organoidleri temizlemek için Phalloidin-DyLight 650 ve 1 µg/mL DAPI içeren %4 saponin) gece boyunca 3 °C'de, Çözüm 1 (350 × Omnipaque3) oda sıcaklığında XNUMX saat süreyle organoidleri temizleyin⁴⁹konfokal floresans mikroskobu (A1, Nikon) ile gözlemlendi.

Tek katmanlı kültür için, kültür ortamının çekilmesinden sonra tek katman, oda sıcaklığında 4 dakika boyunca %15 PFA ile sabitlendi. PBS yıkamasının ardından %0.5 Triton X-100 içeren bloklama solüsyonu ilave edildi ve 1 saat oda sıcaklığında inkübe edildi. Tek tabaka birincil antikorlar [anti-P-gp antikoru, anti-ZO-1 antikoru, anti-fosfo-Ezrin antikoru, anti-E kadherin (Thermo Fisher Scientific, PA5-32178), anti-Villin-1 antikoru (Thermo Fisher Scientific, PA814-0.3) ile boyandı. Klon R100, Hücre Sinyal Teknolojisi)] 4 °C'de 2 gün boyunca %4 Triton X-0.3 içeren bloklama çözeltisi içinde, daha sonra üç kez PBS ile yıkandı, %100 Triton X içeren bloklama çözeltisi içinde ikincil antikor ile gece boyunca XNUMX °C'de inkübe edildi -XNUMX.

Organoidler için transmisyon elektron mikroskobu

Organoidler, 4 °C'de 24 saat boyunca yarım Karnovsky çözeltisiyle sabitlendi. Matrigel'li sabit organoidler yaklaşık 1 mm'lik parçalar halinde kıyıldı³ jiletle 0.1 M kakodilat tamponla yıkandı. 1 saat boyunca 0.1 °C'de 4 M kakodilat tamponu içerisinde %1.5 osmiyum tetroksit kullanılarak daha fazla sabitleme gerçekleştirildi. Sabit organoidler, etanol konsantrasyonu kademeli olarak %50'den %100'e çıkarılırken dehidre edildi, propilen oksitle değiştirildi ve epoksi reçineye (Quetol812, Nisshin EM) gömüldü. Reçine ısıyla polimerize edildi; ultramikrotom (Leica EM UC60, Leica Microsystems) kullanılarak ultra ince (70-7 nm) bölümler hazırlandı, uranil asetat ve kurşun sitrat ile çift lekelendi ve bir transmisyon elektron mikroskobu (HT7700, Hitachi High-Technologies) ile gözlemlendi.

Organoid oluşumu deneyi

Geleneksel organoidler ve kist bakımından zenginleştirilmiş organoidler, tek katmanlı kültürle aynı şekilde tek hücrelere ayrıştırıldı. Bu hücreler Matrigel'e gömüldü ve 10 gün boyunca 27632 μM Y-4 ile desteklenmiş genleşme ortamında kültürlendi. Organoid büyümesi CellTiter-Glo kullanılarak ölçüldü^® Matrigel'in dispaz (Dispase I, FUJIFILM Wako Pure Chemical) ile çözündürülmesinden sonra 3D Hücre Canlılığı Testi (Promega). Görüntüleme analizi için üretici firmaya göre CellSens (OLYMPUS) ile gerçekleştirildi. Bir organoidin oluşumu, parlak alan görüntüsünde yapısının ana ekseninin 100 μm'nin üzerinde ölçüldüğü zaman olarak tanımlandı.

EdU alım tahlili

EdU boyama, üreticinin protokolüne göre yapıldı (görüntüleme için Click-iT Plus EdU Hücre Proliferasyon Kiti, Alexa Fluor 555 boya, Thermo Fisher Scientific). Çekirdekler ve EdU pozitif hücreler, üreticinin talimatlarına göre NIS elemanları (Nikon) kullanılarak sayıldı.

Kantitatif RT-PCR

Toplam RNA, TRIzol kullanılarak tek katmanlı kültürden ekstre edildi. cDNA, RT-PCR (Thermo Fisher Scientific) için Superscript III First-strand sentez sistemi ile sentezlendi. Kantitatif RT-PCR, SYBR Green (Thermo Fisher Scientific) kullanılarak StepOnePlus Gerçek Zamanlı PCR Sisteminde (Thermo Fisher Scientific) her gen için iki kopya halinde gerçekleştirildi. β-Aktin temizlik geni olarak kullanıldı. RT-PCR için primerlerin dizileri Ek Tabloda gösterilmektedir. S1.

Bileşik geçirgenlik deneyi

Lucifer sarısı geçirgenlik tahlili için, apikal tarafa 10 mM HEPES ve HBSS (pH 1) içindeki %7.4 (w/v) BSA'dan oluşan ve 200 uM lusifer sarısı içeren bir taşıyıcı tamponu eklendi. HBSS, Thermo Fisher Scientific'ten (Kat#14025092) satın alınmıştır. Lucifer sarısı içermeyen taşıyıcı tampon da bazal tarafa ilave edildi ve çalkalanarak kültürlendi. 2 saat sonra bazal tampondan analiz için örnek alındı. Lucifer sarısı konsantrasyonu, 428 nm eksitasyon ve 536 nm emisyon filtreleri kullanılarak EnSpire (PerkinElmer) ile ölçülen bir floresan sinyali ile belirlendi. Digoksin geçirgenlik tahlili için, 200 uM Zosuqudar varlığında veya yokluğunda 10 uM lusifer sarısı ve 5 uM digoksin içeren bir taşıyıcı tampon sırasıyla apikal veya bazal tarafa eklendi. 2 saat sonra bazal veya apikal tampondan analiz için örnek alındı. Midazolam metabolik tahlili için, 200 mM ABT varlığında veya yokluğunda 5 μM lusifer sarısı, 10 μM midazolam, 1 mM MES ve %6.5 (a/h) BSA (pH 1) içeren HBSS, apikal tarafa eklendi. farklılaşmış tek tabaka. Tek katmanın bazal tarafına, 10 mM HEPES ve HBSS (pH 4) içindeki %7.4 (a/h) BSA'dan oluşan taşıyıcı tamponu eklendi. 2 saat sonra bazal tampondan analiz için örnek alındı. Midazolam tahlili için 3 gün boyunca genleşme ortamında ve 4 gün boyunca farklılaştırılmış ortamda 100 nM VD3 indüksiyonu ile 48 saat boyunca kültürlenen tek tabaka kullanıldı. Digoksin ve 1-hidroksimidazolam konsantrasyonu LC-MS/MS analizi ile belirlendi. Görünür geçirgenlik katsayısı (Papp) aşağıdaki denkleme göre hesaplandı:

burada dQ/dt birim zamanda bazal veya apikal tarafa taşınan bileşiği temsil eder, A hücre kültürü ekinin yüzey alanıdır ve C₀ bileşiğin başlangıç ​​konsantrasyonudur.

LC–MS/MS analizi

Toplanan tampon numuneleri, dahili bir standart içeren metanol/asetonitril (1/1, v/v) ile karıştırıldı (d3-digoksin analizi için digoksin, d41-hidroksimidazolam için -1-hidroksimidazolam). Santrifüjleme veya filtrelemeden sonra süpernatan, digoksin için Nexera X3 sistemi (Shimadzu), QTRAP6500 sistemi (SCIEX) ve ACQUITY UPLC BEH C18 kolonu (1.7 μm, 2.1 mm x 50 mm, Waters) veya XBridge BEH C18 kullanılarak analiz edildi. 3.5-hidroksimidazolam için sütun (2.1 μm, 100 mm × 1 mm, Waters).

istatistiksel analiz

İstatistiksel analizler GraphPad Prism 7.04 (GraphPad Yazılımı) kullanılarak Öğrenci t-testi ve Dunnett'in çoklu karşılaştırma testi kullanılarak yapıldı. < 0.05'lik bir p değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

• SEO Destekli İçerik ve Halkla İlişkiler Dağıtımı. Bugün Gücünüzü Artırın.
• PlatoData.Network Dikey Üretken Yapay Zeka. Kendine güç ver. Buradan Erişin.
• PlatoAiStream. Web3 Zekası. Bilgi Genişletildi. Buradan Erişin.
• PlatoESG. Otomotiv / EV'ler, karbon, temiz teknoloji, Enerji, Çevre, Güneş, Atık Yönetimi. Buradan Erişin.
• Blok Ofsetleri. Çevre Dengeleme Sahipliğini Modernleştirme. Buradan Erişin.
• Kaynak: https://www.nature.com/articles/s41598-023-39425-7