etik beyan

Tokyo Üniversitesi'nde gerçekleştirilen deneyler için hayvan bakımı ve kullanımına yönelik tüm yöntemler, Tokyo Üniversitesi Bilim Fakültesi'nin kurumsal inceleme komiteleri tarafından onaylandı. HHMI Janelia Araştırma Kampüsü'ndeki deneyler için tüm cerrahi ve deneysel prosedürler, HHMI Janelia Araştırma Kampüsü Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi ve Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi tarafından onaylanan protokollere uygun olarak gerçekleştirildi. Kopenhag Üniversitesi'ndeki deneyler için hayvan bakımı, cerrahi, in vivo görüntüleme ve numune hazırlamayı içeren prosedürler yerel araştırma etik kurulu (Kopenhag Üniversitesi Deneysel Tıp Bölümü) tarafından onaylandı ve Danimarka Hayvan Deneyleri Müfettişliği'ne uygun olarak yürütüldü. . Kagoshima Üniversitesi'ndeki tüm hayvan deneyleri, Kagoshima Üniversitesi Deneysel Hayvan Araştırma Komitesi (Onay numarası: MD22086) ve Kagoshima Üniversitesi Gen Rekombinasyon Deneyi Güvenlik Komitesi (Onay numaraları: 22S018) tarafından onaylandı ve ARRIVE yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi. Laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımına ilişkin Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) kılavuzu ve hayvan deneyleri için Dünya Tabipler Birliği Etik Kuralları (http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/legislation_en.htm). Stony Brook Üniversitesi'ndeki tüm ameliyatlar ve deneysel prosedürler, Stony Brook Üniversitesi Hayvan Kullanımı Komitesi tarafından incelenip onaylandı ve NIH'nin yönergeleri izlendi. Stony Brook Üniversitesi IACUC tarafından izlenen Laboratuvar Hayvanları Kaynakları Bölümü tüm hayvanların bakımını yaptı. Calgary Üniversitesi'nde gerçekleştirilen deneylerde, hayvan bakımı ve kullanımına ilişkin tüm yöntemler Calgary Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygundu.

Genel yöntemler ve materyaller

LldR, CanlonicSF, Green Lindoblum, GEM-IL ver.3 ve FiLa'yı kodlayan sentetik DNA, Integrated DNA Technologies'den satın alındı. Laconic'i kodlayan bir gen, Addgene'den (Addgene plazmidi #44238; http://n2t.net/addgene:44238). Rutin polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) amplifikasyonları için Phusion yüksek kaliteli DNA polimeraz (Thermo Fisher Scientific) kullanıldı ve hataya açık PCR için Taq DNA polimeraz (New England Biolabs) kullanıldı. Kısıtlama endonükleazları, hızlı DNA ligasyon kitleri ve GeneJET miniprep kitleri Thermo Fisher Scientific'ten satın alındı. PCR ürünleri ve kısıtlama sindirimlerinin ürünleri, agaroz jel elektroforezi ve GeneJET jel ekstraksiyon kiti (Thermo Fisher Scientific) kullanılarak saflaştırıldı. DNA sekansları, Fasmac Co., Ltd.'nin DNA sekans servisi tarafından analiz edildi. Floresan uyarımı ve emisyon spektrumları, bir Spark plaka okuyucusuna (Tecan) kaydedildi.

R-iLACCO1'in yapısal modellemesi

R-iLACCO1'in modelleme yapısı AlphaFold2 (ref. ^41,42MMseqs2 sunucusunun bulunduğu Söding laboratuvarında barındırılan bir API kullanarak⁴³ Çoklu dizi hizalaması için kullanıldı.

eLACCO2.1 ve R-iLACCO1 Mühendisliği

Daha önce bildirilen yeşil hücre dışı l-laktat biyosensör ara ürünü eLACCO0.9 (ref. ⁹) yinelenen bir kütüphane oluşturma ve tarama sürecine tabi tutuldu. E. coli 10 μg mL-100 ile desteklenmiş LB ortamındaki DHXNUMXB suşu (Thermo Fisher Scientific)^-1 ampisilin ve %0.02 l-arabinoz. Kütüphaneler, tüm genin hataya açık PCR'si ile oluşturuldu. Yönlendirilmiş evrimin iki turu, eLACCO1.2'nin tanımlanmasına yol açtı. Cys340Ser mutasyonu eLACCO1.2'ye dahil edildi. Ortaya çıkan ve eLACCO1.3 olarak adlandırılan varyant, yinelemeli bir kütüphane oluşturma ve tarama işlemine tabi tutuldu. E. coli tüm genin hataya açık PCR'si ile. Her turda ~200-400 floresan koloni toplandı, kültürlendi ve bir plaka okuyucu altında 96 oyuklu plakalarda test edildi. eLACCO6 tanımlanmadan önce 2 tur tarama yapıldı. Son olarak, eLACCO79'ye Leu2Ile mutasyonu eklendi. l-laktat afinitesi. Ortaya çıkan mutant, eLACCO2.1 olarak belirlendi. ortadan kaldırmak için eLACCO444'ye Asp2Asn mutasyonu eklendi. l-laktat bağlanması. Parlaklığı artırmak için üç tur yönlendirilmiş evrim gerçekleştirildi. Ortaya çıkan kontrol mutantı, deLACCO1 olarak belirlendi.

N- ve C- terminal bağlayıcıları (sırasıyla DW ve EREG) ile cpmApple'ı kodlayan gen, kırmızı bir hücre dışı kullanılarak büyütüldü l-laktat biyosensörü R-eLACCO1 geni şablon olarak¹⁸, ardından LldR'nin Leu109 ve Val110 arasındaki bölgeye yerleştirilmesi l-Gibson düzeneği (New England Biolabs) tarafından bir pBAD'de (Invitrogen) laktat bağlayıcı protein. Ortaya çıkan varyant, R-iLACCO0.1 olarak belirlendi. R-iLACCO0.1'in N- ve C-terminal bağlayıcıları, farklı bağlayıcı uzunluğuna sahip varyantlar sağlamak üzere Q5 yüksek doğruluklu DNA polimeraz (New England Biolabs) kullanılarak silindi. Varyantlar şu şekilde ifade edildi: E. coli. Proteinler, B-PER bakteriyel protein ekstraksiyon reaktifi (Thermo Fisher Scientific) kullanılarak ekstre edildi ve floresans parlaklığı ve l-laktata bağımlı yanıt. R-iLACCO0.2 olarak belirlenen en umut verici varyant, yinelemeli bir kütüphane oluşturma ve tarama sürecine tabi tutuldu. E. coli. Kütüphaneler, tüm genin sahaya yönelik rastgele mutajenezi veya hataya açık PCR'si ile oluşturuldu. Her turda yaklaşık 200-400 floresan koloni toplandı, kültürlendi ve bir plaka okuyucu altında 96 oyuklu plakalarda test edildi. R-iLACCO11, R-iLACCO1 ve R-iLACCO1.1 tanımlanmadan önce 1.2 tur tarama yapıldı. Bu kuralı ortadan kaldırmak için R-iLACCO69'e Asp1Asn mutasyonu eklendi. l-laktat afinitesi. Parlaklığı artırmak için iki tur yönlendirilmiş evrim gerçekleştirildi. Ortaya çıkan kontrol mutantı, R-diLACCO1 olarak belirlendi.

Protein saflaştırması ve in vitro karakterizasyonu

N-terminalinde bir poli-histidin etiketi bulunan eLACCO2.1 ve R-iLACCO varyantlarını kodlayan gen, pBAD vektöründen eksprese edildi. Bakteriler bir hücre bozucuyla (Branson) parçalandı ve ardından 15,000°C'de santrifüjlendi. g 20 dakika boyunca bekletildi ve proteinler, Ni-NTA afinite kromatografisi (Agarose Bead Technologies) ile saflaştırıldı. Numunelerin absorpsiyon spektrumları bir Lambda950 Spektrofotometre (PerkinElmer) ile toplandı. ELACCO2.1 için pH titrasyonları gerçekleştirmek üzere protein çözeltileri, 4 mM trisodyum sitrat, 11 mM sodyum borat, 30 mM MOPS, 30 mM KCl, 30 mM CaCl100 içeren tamponlara (pH 1'ten XNUMX'e) seyreltildi.₂ve ya hayır l-laktat veya 100 mM l-laktat. R-iLACCO varyantlarına yönelik pH titrasyonları gerçekleştirmek için protein çözeltileri, 4 mM trisodyum sitrat, 11 mM sodyum borat, 30 mM MOPS, 30 mM KCl içeren tamponlar (pH 30'ten 100'e) halinde seyreltildi ve ya hayır l-laktat veya 100 mM l-laktat. Daha sonra pH'ın bir fonksiyonu olarak floresans yoğunlukları, p'yi belirlemek için sigmoidal bir bağlanma fonksiyonu ile donatıldı.K_a. Için leLACCO2.1'in laktat titrasyonu, tamponlar bir karışımın karıştırılmasıyla hazırlandı. l-laktat (-) tampon (30 mM MOPS, 100 mM KCl, 1 mM CaClXNUMX)₂, pH 7.2) ve bir l-laktat (+) tampon (30 mM MOPS, 100 mM KCl, 1 mM CaClXNUMX)₂100 mM l-laktat, pH 7.2) sağlamak için l-laktat konsantrasyonları 0°C'de 100 mM ile 25 mM arasında değişir. İçin lR-iLACCO varyantlarının -laktat titrasyonu, tamponlar bir karışımın karıştırılmasıyla hazırlandı. l-laktat (-, Ca olmadan²⁺) tampon (30 mM MOPS, 100 mM KCl, pH 7.2) ve bir l-laktat (+, Ca olmadan²⁺) tampon (30 mM MOPS, 100 mM KCl, 100 mM l-laktat, pH 7.2) sağlamak için l-laktat konsantrasyonları 0°C'de 100 mM ile 25 mM arasında değişir. Floresan yoğunlukları buna karşı çizildi l-laktat konsantrasyonları ve Hill katsayısını ve görünen değeri belirlemek için sigmoidal bir bağlanma fonksiyonu ile donatılmıştır K_d. Ca için²⁺ titrasyon, bir Ca karıştırılarak tamponlar hazırlandı.²⁺ (-) tampon (30 mM MOPS, 100 mM KCl, 10 mM EGTA, 100 mM l-laktat, pH 7.2) ve bir Ca²⁺ (+) tampon (30 mM MOPS, 100 mM KCl, 10 mM CaEGTA, 100 mM l-laktat, pH 7.2) Ca sağlamak için²⁺ 0 °C'de 39 μM ile 25 μM arasında değişen konsantrasyonlar. Ca'lı Tamponlar²⁺ 39 μM'den fazla konsantrasyonlar, bir Ca karıştırılarak hazırlandı.²⁺ (-, EGTA olmadan) tampon (30 mM MOPS, 100 mM KCl, 100 mM l-laktat, pH 7.2) ve bir Ca²⁺ (+, EGTA olmadan) tampon (30 mM MOPS, 100 mM KCl, 100 mM CaClXNUMX)₂100 mM l-laktat, pH 7.2).

eLACCO2.1 ve R-iLACCO1'in iki fotonlu uyarılma spektrumları ve iki fotonlu absorpsiyon kesitleri, ref.'de açıklanan genel yöntemlere ve protokollere göre ölçüldü. ⁴⁴. Kısaca, bir PC1 Spektroflorometre (ISS, Champaign, IL) içindeki numunenin floresansını uyarmak için ayarlanabilir bir femtosaniye lazer InSight DeepSee (Spectra-Physics, Santa Clara, CA) kullanıldı. İki fotonlu uyarım spektral şekillerini ölçmek için emisyon kanalında 633SP ve 770SP kısa geçiş filtrelerini kullandık. Spektral standartlar olarak 798:1 CHCl2:CDCl3 içindeki LDS 3 ve DMSO içindeki Coumarin 540 A kullanıldı. Proteinlerdeki ve standartlardaki floresans yoğunluğunun ikinci dereceden güce bağımlılığı, spektrum boyunca çeşitli dalga boylarında kontrol edildi. İki fotonlu kesit (σ₂eLACCO2.1 ve R-iLACCO1'deki kromoforun anyonik formunun ) ref.'de açıklandığı gibi ölçüldü. ⁴⁵. Metanol içindeki Rodamin 6 G, 1060 nm'de uyarma ile referans standart olarak kullanıldı (ref. ⁴⁴). Tek foton uyarımı için 532 nm'lik bir diyot lazer hattı (Tutarlı) kullandık. Bu ölçümler için floresans kanalında 770SP ve 561LP filtrelerinin bir kombinasyonu kullanıldı. Sönme katsayıları, ref.'de detaylandırıldığı gibi alkalin denatürasyonuyla belirlendi. ⁴⁶. İki fotonlu absorpsiyon spektrumları ölçülen σ'ya normalleştirildi₂ değerler. Toplam iki foton parlaklığına normalleştirmek için (F₂), spektrumlar daha sonra kuantum verimi ve σ'nun ilgili kromofor formunun göreceli fraksiyonu ile çarpıldı.₂ ölçüldü. Veriler bu şekilde sunulmuştur çünkü eLACCO2.1 ve R-iLACCO1, kromoforun nötr ve anyonik formlarının bir karışımını içerir. Yöntem referanslarda daha ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. ^46,47.

Memeli ifade vektörlerinin inşası

Hücre yüzeyi ekspresyonu için, eLACCO2.1'i kodlayan genler PCR ile amplifiye edildi, ardından BglII ve EcoRI ile sindirim yapıldı ve ardından N-terminal lider sekansı ve C-terminal ankoru içeren bir pcDNA3.1 vektörüne (Thermo Fisher Scientific) bağlandı. N-terminal lider dizileri ref'den türetildi. ¹⁸ ve C-terminal ankrajları referanslardan kaynaklanmıştır. ^18,20. Hücre içi ekspresyona yönelik R-iLACCO varyantlarını oluşturmak için pBAD vektöründe R-iLACCO varyantlarını kodlayan gen, XhoI ve HindIII ile sindirildi ve ardından pcDNA3.1 vektörüne bağlandı. Birincil nöronlarda, astrositlerde, ex vivo ve in vivo ekspresyona yönelik plazmidler oluşturmak için, pcDNA3.1 vektöründeki lider ve çapa dizisini içeren R-iLACCO varyantlarını veya eLACCO varyantlarını kodlayan gen ilk önce PCR ile amplifiye edildi, ardından Nhel ile sindirim yapıldı. ve eLACCO için XhoI ve R-iLACCO için BamHI ve HindIII ve daha sonra insan sinapsini (hSyn) veya gfaABC1D promotörünü içeren bir pAAV plazmitine bağlanır. Temel kortikal nöronlarda in vivo ekspresyon için plazmidler oluşturmak amacıyla, pcDNA3.1 vektöründeki lider ve çapa dizisini içeren eLACCO varyantlarını kodlayan gen ilk önce PCR ile amplifiye edildi, ardından BamHI ve HindIII ile sindirim yapıldı ve daha sonra içeren bir pAAV plazmitine bağlandı. insan Ca²⁺/calmodulin'e bağımlı protein kinaz II a (CaMKIIa, 1.3 kbp) promoteri.

HeLa, HEK293T ve T98G hücre hatlarında eLACCO ve R-iLACCO varyantlarının görüntülenmesi

HeLa (Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu, ATCC, #CCL-2) ve HEK293T (Thermo Fisher Scientific, #R70007) hücreleri, %10 fetal sığır serumu (FBS; Sigma-) ile desteklenmiş Dulbecco'nun değiştirilmiş Eagle ortamında (DMEM; Nakalai Tesque) tutuldu. Aldrich) ve 1 °C'de %37 penisilin-streptomisin (Nakalai Tesque) ve %5 COXNUMX₂. T98G hücreleri (ATCC, #CRL-1690), %10 FBS, %1 penisilin-streptomisin, %1 esansiyel olmayan amino asit (Nakalai Tesque) ve 1 mM sodyum piruvat (Nakalai) ile desteklenmiş minimum temel ortamda (Nakalai Tesque) tutuldu. Tesque) 37 °C ve %5 COXNUMX'de₂. Hücreler, 35 mm'lik cam tabanlı hücre kültürü kaplarına (Iwaki) ekildi ve polietilenimin (Polysciences) kullanılarak oluşturulan plazmid ile geçici olarak transfekte edildi. Transfekte edilmiş hücreler, bir pE-83 LED ışık kaynağı (CoolLED), 300x objektif lens (sayısal açıklık (NA) = 40; yağ), bir ImagEM X1.3 EM- ile donatılmış bir IX2 geniş alanlı floresan mikroskobu (Olympus) kullanılarak görüntülendi. CCD kamera (Hamamatsu), Cellsens yazılımı (Olympus) ve bir STR sahne kuluçka makinesi (Tokai Hit). Canlı hücre görüntülemede kullanılan filtre setleri aşağıdaki spesifikasyona sahipti. eLACCO varyantları, iLACCO1, CanlonicSF, Green Lindoblum, FiLa (örn. 470 nm) ve EGFP: uyarma 470/20 nm, dikroik ayna 490 nm dclp ve emisyon 518/45 nm; R-iLACCO varyantları, mRFP1 ve mApple: uyarma 545/20 nm, dikroik ayna 565 nm dclp ve emisyon 598/55 nm; GEM-IL ve Laconic (CFP): uyarım 438/24 nm, dikroik ayna 458 nm dclp ve emisyon 483/32 nm; Laconic (FRET): uyarım 438/24 nm, dikroik ayna 458 nm dclp ve emisyon 542/27 nm; FiLa (örn. 405 nm): uyarma 405/20 nm, dikroik ayna 425 nm dclp ve emisyon 518/45 nm. Floresan görüntüleri ImageJ yazılımı (Ulusal Sağlık Enstitüleri) ile analiz edildi.

Fotostabilite testi için, ilgili genlerle transfekte edilmiş HeLa hücreleri, %100 LED yoğunluğunda (~10 mW cm-) uyarma ışığı ile aydınlatıldı.^-2 ve ~4 mW cm^-2 (sırasıyla eLACCO ve R-iLACCO varyantları için objektif lens üzerinde) ve floresans görüntüleri, 4 ms'lik maruz kalma süresiyle ve aralık süresi olmadan 50 dakika boyunca kaydedildi.

Görüntülenmesi için l-laktata bağlı floresans değişiklikleri, lamellerin üzerine ekilen HeLa hücreleri, eLACCO veya R-iLACCO varyantlarını kodlayan plazmitlerle transfekte edildi. Transfeksiyondan kırk sekiz saat sonra lamelleri, 10 mM HEPES ve 1 uM AR-C155858 (Tocris) ile desteklenen Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS(+); Nakalai Tesque) içeren Attofluor™ Hücre Odasına (Thermo Fisher Scientific) aktarıldı. Görüntü sırasında banyo solüsyonlarının değişimi, ev yapımı bir solüsyon çıkarıcı kullanılarak çıkar ve ekle yöntemiyle gerçekleştirildi.⁹.

Ca'nın görüntülenmesi için²⁺-bağımlı floresans, lamellerdeki HeLa hücreleri Attofluor'a aktarıldı^TM 10 mM HEPES ve 10 mM ile desteklenmiş HBSS(-) tamponlu (Nakalai Tesque) Hücre Odası l-laktat, eLACCO varyantlarının transfeksiyonundan 48 saat sonra. Diğer banyo çözeltileri Ca ile desteklendi²⁺ 100 nM, 1 μM, 10 μM, 100 μM, 300 μM, 1 mM, 3 mM ve 10 mM. Görüntüleme sırasında banyo solüsyonlarının değişimi, görüntüleme ile aynı şekilde gerçekleştirildi. l-laktata bağlı floresan değişiklikleri.

Birincil nöronlarda ve astrositlerde eLACCO ve R-iLACCO varyantlarının görüntülenmesi

Nöron görüntüleme daha önce tarif edilmişti⁹. Kısacası, P0 yavrularından (erkek ve dişilerden toplanmış dokular) alınan sıçan kortikal / hipokampal birincil kültürleri, 24 x 0.5 olacak şekilde cam tabanlı 10 oyuklu plakalara kaplandı.⁶ hücreler üç kuyucuk için kullanıldı. Kültürler kaplama sırasında nükleofekte edildi ve 14 gün sonra görüntülendi. Birincil astrositlerin görüntülenmesi için, tek zamanlı hamile Sprague Dawley sıçanından (Charles River Laboratories, Japan SLC, Inc.'den satın alınan) erkek ve dişi yavrular elde edildi. Deneyler, cam tabanlı 21 oyuklu plakalara (Cellvis) kaplanmış E24'den (hamile sıçanın C bölümünden sonra) kortikal / hipokampal birincil kültürlerle gerçekleştirildi; burada 0.5 x 10⁶ hücreler bir kuyucuk için kullanıldı. Kültürler, Nucleofector 4D (Lonza) ile kaplama sırasında nükleofector ile enfekte edildi ve 5 gün sonra görüntülendi. Astrositler, 10 °C'de %1 FBS ve %37 penisilin-streptomisin ve %5 COXNUMX ile desteklenmiş DMEM'de kültürlendi.₂. Kültür ortamı, 1 mL görüntüleme tamponu (145 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM) ile değiştirildi d-glikoz, 10 mM HEPES, 2 mM CaClXNUMX₂, 1 mM MgCl₂, pH 7.4) görüntüleme için.

R-iLACCO1.2'nin miyotüplerde görüntülenmesi

Fare C2C12 miyoblastları (#CRL-1772, ATCC), farklılaşmanın indüklenmesinden önce %10 FBS ile desteklenmiş DMEM'de büyütüldü. Tohumlamadan 2 gün sonra birleşme noktasına ulaştıktan sonra, kültür ortamı bir farklılaşma ortamı (%1 at serumu (Gibco) ile desteklenen DMEM) ile değiştirildi ve ortam, farklılaşmadan sonraki 2 güne kadar her 6 günde bir değiştirildi. Retrovirüsler, C1.2C1 miyotüplerinde R-iLACCO2 ve R-diLACCO12'i eksprese etmek için kullanıldı. Retrovirüs vektörleri oluşturmak için R-iLACCO1.2 ve R-diLACCO1'i kodlayan genler PCR ile amplifiye edildi, ardından BamHI ve EcoRI ile sindirim yapıldı ve ardından bir pMX vektörüne bağlandı. Retrovirüs, TransIT-LT1 reaktifi (TakaraBio) kullanılarak pMX plazmitleri ile transfekte edilmiş plat-E paketleme hücreleri (Cell Biolabs) kullanılarak üretildi. Retrovirüs içeren süpernatanlar transfeksiyondan 60 saat sonra toplandı. Retrovirüsün transdüksiyonu için, farklılaşmamış C2C12 miyoblastları %35 birleşim noktasında 40 mm'lik bir tabağa yerleştirildi. Retrovirüs, ortama 6 saatlik aralıklarla üç kez ilave edildi ve ortam, son enfeksiyondan 12 saat sonra kültür ortamına değiştirildi. Miyotüplerde glukoza bağlı floresansın gözlemlenmesi için, R-iLACCO1.2 veya R-diLACCO1'i ifade eden farklılaşmamış miyoblastlar, sekiz oyuklu μ-Slide'a (ibidi) ekildi ve miyotüplere farklılaştırıldı. Kültür ortamı, glikoz içermeyen görüntüleme tamponu (Krebs-Ringer fosfat tamponu; 5 mM KH) ile değiştirildi₂PO₄, 136 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1 mM CaClXNUMX₂, 1 mM MgSXNUMX₄, 25 mM NaHCO₃, 20 mM HEPES) gözlemden 2 saat önce. Miyotüpler, UPLXAPO 1200x hava/kuru objektif (NA 10) ve R-iLACCO0.40 ve R-diLACCO559 uyarımı için 1.2 nm lazer ile donatılmış bir FV-1 lazer taramalı konfokal floresan mikroskobu (Olympus) kullanılarak görüntülendi. Miyotüpler, bir üst düzey inkübatör (STX, Tokai Hit) ile 37 °C'de tutuldu.

kümeleme analizi

Kümeleme analizleri R (R sürüm 4.2.3; R Çekirdek Ekibi) kullanılarak yapıldı. Kümeleme analizi için Δ izleriF/F glikozla uyarılmış hücrelerden kullanıldı. Analiz edilen 42 hücre arasında 21 hücre, MCT inhibitörü AR-C155858 ile ön işleme tabi tutuldu. Glikoz eklenmesi üzerine benzer floresans izleri gösteren hücreleri gruplandırmak için Ward yöntemiyle Öklid mesafesi kullanılarak hiyerarşik kümeleme yapıldı. Ortaya çıkan dendrogram ve bir ısı haritası, R paketi “ggplot2” kullanılarak oluşturuldu.

Transgenik hat üretimi Drosophila melanogaster

İlgili biyosensörün kodlama dizisi pcDNA3.1'den PCR ile amplifiye edildi ve ardından In-Fusion Snap Assembly Master Mix (Takara) kullanılarak pUAST-attB vektörünün EcoRI/XbaI bölgesine yerleştirildi. Transgenik çizgiler, attp2 iniş yerinde (Rainbow Transgenik Flies Inc) sinek genomuna Φ integraz aracılı rekombinasyon yoluyla üretildi.

Ex vivo'nun canlı görüntülenmesi Drosophila yetişkin beyni

Ex vivo'nun canlı görüntülenmesi Drosophila yetişkin beyinleri (3-5 günlük dişiler), LSM800 konfokal mikroskop (Zeiss) ile oda sıcaklığında gerçekleştirildi. Tüm beyin görüntüleri, tek düzlem modunda (tarama hızı 20; 0.8 × 8 piksel; piksel başına 1024 bit; ortalama sayı 1024; iğne deliği 8-16 AU) 1x Plan-Apokromat hedefi (NA 1.5) ile yakalandı. Zaman serisi görüntüleri, z-yığın modunda (tarama hızı 60; 5 × 63 piksel; piksel başına 1.4 bit; ortalama sayı 8; iğne deliği 1024–1024 AU; z yığını 8 dilim). Yetişkin beyinleri hızlı bir şekilde Schneider Drosophila Medium'da (Gibco) parçalara ayrıldı ve ardından HL4 tamponu (1 mM NaCl, 1.5 mM KCl, 5 mM MgCl3) ile doldurulmuş poli-lizin kaplı bir cam alt tabağa (Matsunami Glass Ind. Ltd.) yerleştirildi.₂, 10 mM NaHCO₃, 115 mM sakaroz, 5 mM HEPES; pH 7.2) 5 mM ile desteklenmiştir d-glikoz, 1 mM l-laktat ve 0.5 mM piruvat¹¹. Kap mikroskop tablasına yerleştirildi ve kaptaki ortam, 3 mM oksamat içeren bir HL6 tamponu ile değiştirildi. 5 dakika sonra, l-laktat, 10 mM'lik nihai konsantrasyona kadar ilave edildi. Numuneler 561 nm'de heyecanlandı ve emisyon 566-700 nm'de kaydedildi.

Adeno ilişkili virüslerin (AAV'ler) paketlenmesi ve saflaştırılması

AAV'ler, HEK293T17 hücrelerinde, bir yardımcı plazmid pXX680'in, AAV2/5 veya AAV2/9 rep/cap'ı kodlayan bir plazmidin ve karşılık gelen LACCO biyosensörünü kodlayan bir pAAV plazmidinin üçlü transfeksiyonu yoluyla üretildi. Transfeksiyondan kırk sekiz saat sonra hücreler, hafifçe kazıyarak toplandı ve 2300 x'te santrifüjleme yoluyla topaklandı. g. Viral parçacıklar, kuru buz/etanol üzerinde dört dondurma-çözme döngüsüyle serbest bırakıldı ve serbest DNA, benzonaz ile sindirildi. AAV parçacıkları, süreksiz bir iyodiksanol gradyanı (%15-25-40-60) ve ultrasantrifüjleme (462,000 x) ile saflaştırıldı. g 70 °C'de 16 dakika). Viral preparasyon daha sonra yıkandı ve 100 kD'lik bir amicon filtreden konsantre edildi. Son konsantrasyon adımı sırasında tampon %5'e ayarlandı. d-sorbitol ve depolama ve deney için %0.001 pluronik asit. Titrasyon, AAV2 ters çevrilmiş terminal tekrarına (ITR) özel primerler kullanılarak TaqMan dijital damlacık PCR ile gerçekleştirildi.

Fare akut kortikal beyin diliminin hazırlanması

AAV kodlayan hSyn-HA-eLACCO4-NGR veya gfaABC2.1D-HA-eLACCO1-NGR'nin enjeksiyonundan 2.1 hafta sonra farelere (C57Bl6, erkek, P28, 21 °C'de %47 nem ile muhafaza edildi) anestezi uygulandı. gaz halindeki izofloran (%5) ve daha sonra başı kesildi. Beyin çıkarıldı, ardından 2 dakika süreyle aşağıdakileri içeren buz gibi dilimleme çözeltisine batırıldı: 119.9 mM N-metil-d-glukamin, 2.5 mM KCl, 25 mM NaHCO₃, 1.0 mM CaClXNUMX₂· 2H₂O, 6.9 mM MgCl₂· 6H₂O, 1.4 mM NaH₂PO₄· H₂O ve 20 mM d-glikoz. Beyin daha sonra bir vibratom tepsisine (Leica Instruments, VT1200S) Krazy Yapıştırıldı ve ardından buz gibi dilimleme çözeltisine yeniden daldırıldı. Bir vibratom kullanılarak somatosensoriyel korteksten (400 mikron kalınlığında) akut koronal dilimler hazırlandı. Dilimler, aşağıdakileri içeren yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) ile doldurulmuş bir geri kazanım odasında 45 °C'de 33 dakika boyunca inkübe edildi: 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 25 mM NaHCO₃, 1.3 mM CaClXNUMX₂· 2H₂O, 1.2 mM MgCl₂· 6H₂O, 1.25 mM NaH₂PO₄· H₂O ve 10 mM d-glikoz. İyileşmeden sonra, görüntüleme deneyleri sırasında odak düzlemini korumak için astrosit süreçlerini görselleştirmek için dilimler astrosit işaretleyici sülforhodamin 101 (SR101, 10 dakika boyunca 20 μM, 1 saat boyunca kurtarma) ile boyandı. Boyunca beyin dilimlerine sürekli olarak karbojen (%95 oksijen, %5 COXNUMX) verildi.₂).

Akut kortikal beyin diliminde eLACCO2.1'in iki foton mikroskopisi

Beyin dilimleri, bir Ti:Sapphire lazer kaynağı (Coherent Ultra II, 4 nm'de ~800 W ortalama çıktı, ~80 MHz) ile beslenen özel yapım iki fotonlu bir mikroskop kullanılarak görüntülendi. Görüntü verileri, açık kaynaklı tarama mikroskobu kontrol yazılımı ScanImage'ı (versiyon 2013, HHMI/Janelia Araştırma Kampüsü) çalıştıran MATLAB (3.81) kullanılarak elde edildi. Görüntüleme 940 nm'lik bir uyarma dalga boyunda gerçekleştirildi. Mikroskop, 695 nm'de birincil bir dikroik ayna ile donatıldı ve yeşil ve kırmızı floresans, 560 nm'de ikincil bir dikroik ve iki bant geçiren emisyon filtresi kullanılarak bölündü ve filtrelendi: 525–540 nm ve 605–670 nm (Chroma Technologies). Zaman serisi görüntüleri, 0.98 x 512 piksel yoğunluğu ve ~512 μm görüş alanı boyutuyla 292 Hz'de elde edildi. Görüntülemede ×40 suya daldırmalı objektif lens (NA 1.0, WD 2.5 mm, Zeiss) kullanıldı. Görüntüleme oda sıcaklığında gerçekleştirildi.

Akut beyin dilimlerindeki aglisemi deneyleri için ACSF'ye glikoz eklenmedi ve onun yerine ozmolariteyi (5 mosmol) korumak için 10 mM ekstra NaCl ilave edildi. Akut dilimlerde elektriksel afferent stimülasyon için bir Grass S88X uyarıcısı, bir voltaj izolasyon ünitesi ve bir eşmerkezli bipolar elektrot (FHC) düzeneği kullanıldı. Elektrot, ilgilenilen bölgeden ~300 µm uzakta bir mikro-manipülatör tarafından dilimin yüzeyine yerleştirildi. Doku, bir teta patlama modeli (1 ms için 1.2 Hz, 100 Hz'de tekrarlanan) kullanılarak 50 V'de 4 ms uzunluğunda monofazik darbelerle uyarıldı. Teta patlaması ayrı deneylerde 5, 15 ve 30 saniye süreyle uygulandı. Farklı stimülasyon uzunlukları benzer sonuçlar üretti ve veriler bir araya toplandı.

eLACCO2.1'in in vivo doğrulaması

Fareler (C57BL6/J, erkek, 8-9 hafta, 23 °C'de %40-70 nem ile barındırıldı), 0.75 mg kg-XNUMX'den oluşan karışımın intraperitoneal (ip) enjeksiyonu ile anestezi uygulandı.^-1 medetomidin (Domitor® Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Japonya), 4.0 mg kg-^-1 midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma Inc., Tokyo, Japonya) ve 5.0 mg kg-^-1 butorfanol (Vetorphale®, Meiji Seika Pharma, Co., Ltd., Tokyo, Japonya). Kafatasına delikler açıldı. Cam iğneler (Ringcaps, Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co. Eberstadt, Almanya) bir çekici (PE-22, Narishige, Tokyo, Japonya) tarafından çekildi ve görsel kortekse stereotaksik olarak yerleştirildi. Yarım mL AAV9-CaMKIIα-HA-eLACCO2.1-NGR veya AAV9-CaMKIIα-HA-deLACCO1-NGR (4 × 10)¹³ viral genom (vg) mL^-1 (her biri) tek taraflı olarak enjekte edildi ve viral vektörleri etkisiz hale getirmek için enjekte edilen yerlere 10 dakika boyunca iğneler yerleştirildi. Viral enjeksiyonun ardından aynı görsel kortekse bir fiber optik kanül (Lucir, Tsukuba, Japonya) implante edildi. İntraserebroventriküler (icv) enjeksiyon için lateral ventriküle kılavuz kanül (Eicom, Kyoto, Japonya) yerleştirildi. Belirli beyin bölgelerinin koordinatları şu şekildeydi: görsel korteks (yanal, +2.7 mm; arka, bregmadan ve ventralden -2.8 mm, beyin yüzeyinden -0.4 mm) ve lateral ventrikül (yanal, -1.0 mm) ; fare beyni atlasına göre posterior, bregmadan ve ventralden -0.2 mm, beyin yüzeyinden -1.8 mm). Farelerin kafataslarına dental kompozit reçine kullanılarak bir fiber optik kanül ve bir enjeksiyon kanülü sabitlendi. Daha sonra farelere 0.75 mg kg-XNUMX enjekte edildi.^-1 onları uyandırmak için atipamezol (ip, FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Osaka, Japonya) ve enfeksiyonları önlemek için fare başına 0.8 mg penisilin G (sc, FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation). Üç hafta sonra fareler icv'ye tabi tutuldu. l-laktat enjeksiyonu.

Deneyin yapıldığı gün, bir fiber optik kanüle bir optik fiber bağlandı ve bir kılavuz kanülün içine bir enjeksiyon kanülü yerleştirildi. l-Laktat (300 nmol ve 1 μmol) veya salin intraserebroventriküler olarak enjeksiyon kanülü (1 mL dk-XNUMX) aracılığıyla uygulandı.^-1). eLACCO floresansı, fiber fotometri sistemi (COME2-FTR/GFP, Lucir, Tsukuba, Japonya) tarafından elde edildi. Fiber bağlantılı bir LED (LEDD1B/M470F3, Thorlabs, Newton, NJ), silika fiberin ucunda 470 mW gücünde uyarım mavi ışığı (0.1 nm) üretti; uyarma bant geçiş filtresinden (geçiş bandı 475 ± 12.5 nm) geçen mavi ışık, dikroik bir ayna-1 tarafından yansıtıldı ve tek silika fibere (çap 400 µm; NA 0.6) katıldı. Fiber optik kanülün ucundan yayılan mavi ışık, eLACCO floresan proteinlerini yansıtıyordu; yansıyan yeşil floresans sinyalleri aynı silika fibere iletildi. Dikroik aynadan geçecek sinyaller, dikroik ayna-2 tarafından yansıtılarak bant geçiren emisyon filtresinden (geçiş bandı: 510 ± 12.5 nm) geçirilmiştir. Son olarak sinyaller bir fotoçoğaltıcıya (PMTH-S1-1P28, Zolix Instruments, Pekin, Çin) yönlendirildi. Sinyaller bir A/D dönüştürücü (PowerLab2/25, AD Instruments Inc., Dunedin, Yeni Zelanda) tarafından dijitalleştirildi ve LabChart sürüm-7 yazılımı (AD Instruments Inc.) ile kaydedildi. Veriler 1 Hz'de elde edildi. Temel floresans yoğunluğu (F₀) önceki 10 saniyenin ortalaması olarak hesaplandı l-laktat uygulaması ve floresans yoğunluğu (F) her zaman noktasında Δ hesaplamak için kullanıldıF/F = (F-F₀)/F₀. Eğri altındaki alan (AUC), Δ eklenerek hesaplandı.F/F 5 dakikadan fazla süre sonra l-laktat veya salin uygulaması.

İn vivo eLACCO2.1 görüntüleme

Tüm fareler, 12-18 °C'de ve %26-30 nemde 70 saatlik aydınlık/karanlık döngüsü koşulunda barındırıldı. Tüm davranışsal deneyler ışık döngüsü sırasında gerçekleştirildi. Farelere yiyecek ve suya istenildiği kadar erişim sağlandı. Ameliyatlar 8-10 haftalık erkek fareler (C57BL/6, Charles River Laboratories) kullanılarak gerçekleştirildi. Farelere indüksiyon için %4 izofluran ve ameliyat sırasında 1.5 L dk-2 ile %0.4-XNUMX oranında anestezi uygulandı.^-1 O₂Anestezi derinliği solunum hızı ile izlendi. AAV9-hSyn-HA-eLACCO2.1-NGR veya AAV9-hSyn-HA-deLACCO1-NGR, dorsal dentat girusa stereotaksik olarak enjekte edildi (AP: −2.0, ML: 1.5, DV: 2.5). Viral enjeksiyondan yaklaşık 1 saat sonra, entegre bir GRIN lensi (dış çap: 1.0 mm, uzunluk: 4.0 mm), dentat granül hücre (DGC) katmanının yaklaşık 200 mm yukarısına implante edildi. Farelere viral ekspresyon ve ameliyattan sonra iyileşme için 4 hafta süre verildi. Tüm in vivo görüntüleme videoları, minyatür bir mikroskop ve nVue veri toplama sistemi (Inscopix, Palo Alto, CA) kullanılarak ev kafeslerinde serbestçe hareket eden hayvanlardan (ameliyattan 4-5 hafta sonra) 20 Hz kare hızında kaydedildi. Her kayıt için hayvanlara kayıt düzenini tanımaları için 10 dakika süre tanındı ve insülin tedavisinden önce 10 dakikalık bir temel kayıt yapıldı (ip enjeksiyon, 0.75 U kg-XNUMX)^-1). Bazı kayıt paradigmalarıyla aynı hacimde salin enjeksiyonu bir kontrol deneyi olarak ayarlandı. Tedavi ve kontrol kayıtlarının sırası rastgele atandı. Görüntülerin ilgi konusu bölgesinin floresans yoğunluğu Inscopix Imaging Processing'de (ver. 1.8.0) analiz edildi. Daha ileri analiz ve nihai veri grafiği için MATLAB (R2022) kullanıldı.

İn vivo R-iLACCO görüntüleme

Farelere (C57BL/6 J, erkek, 8 - 15 hafta, %21 - 40 nem ile 60 °C'de tutuldu) indüksiyon için %3-4 izofluran ile anestezi uygulandı ve anestezi, onlar uyurken %1-1.5 izofluranda tutuldu. stereotaksik çerçeveye monte edilmiştir. Ameliyat boyunca vücut ısısı 37°C'de tutuldu. Lokal analjezi (lidokain, 0.2 mg mL) uygulandıktan sonra kafatası açığa çıkarıldı.^-1) kafa derisine bir kesi yapılarak ve daha sonra diş çimentosu (Super Bond C&B, Sun Medical, Shiga, Japonya) kullanılarak kafatasına metal bir çerçeve (baş plakası) takıldı. Somatosensoriyel korteks üzerinden 4 mm çapında kraniyotomi yapıldı ve dura mater cerrahi olarak çıkarıldı. AAV'ler somatosensoriyel kortekse 300 μm (1.3–1.5 x 10) derinlikte enjekte edildi.¹² vg mL'si^-1 PBS içinde, 500 nL) bir mikromanipülatöre ve bir mikroenjektöre (FemtoJet, Eppendorf) bağlı bir cam pipet kullanılarak. Beyni kaplayacak şekilde 4 mm çapında otoklavlanmış bir lamel dikkatlice yerleştirildi ve daha sonra diş çimentosu ile kapatıldı. Farelere deri altından karprofen (5 mg kg-XNUMX) uygulandı.^-1) ameliyattan sonra sistemik analjezi için ve en az üç hafta boyunca ev kafeslerinde iyileştiler. Performansını araştırmak için l-duyusal uyaranlara yanıt olarak laktat biyosensörleri, yüzeysel anestezi (70 mg kg-XNUMX)^-1 ketamin + 10 mg kg-^-1 xylazine) fareler, floresans makroskobu (kendi kendine inşa edilmiş, Thorlabs) altında sağlam bir şekilde sabitlendi. Örnek, bir LED (pE4000, CoolLED), 488/561 çift bantlı filtre seti (59904, Chroma) ve bir EM-CCD kamera (Andor iXon 888, kare hızı 10 Hz) kullanılarak floresansın toplanması için heyecanlandı. Duyusal uyaran için, farenin bıyık yastığına 50 saniye boyunca hava üflemeleri (20 ms, 5 psi, 30 Hz, Picospritzer, Parker) sunuldu. Duyusal uyarım seansı, 8 saniyelik başlangıç ​​ve 30-120 saniyelik uyarım sonrası dönemler dahil olmak üzere 180 kez tekrarlandı.

İstatistikler ve tekrarlanabilirlik

Tüm veriler, şekil açıklamalarında belirtildiği gibi ortalama ± sd veya ortalama ± sem olarak ifade edilir. Şekiller için kutu grafikleri kullanılmıştır. 3c, f, g, j, k, m, n ve 4b, d–j. Bu kutu grafiklerinde yatay çizgi ortancadır; üst ve alt yatay çizgiler veriler için 25. ve 75. yüzdelik dilimlerdir; ve bıyıklar siyah dolu daire olarak temsil edilen ortalamadan bir standart sapma aralığına uzanır. Örnek boyutları (n) her deneyde listelenir. Hiçbir numune analizin dışında bırakılmadı ve tüm deneyler tekrarlanabilirdi. Şekil XNUMX'deki temsili floresans görüntülerinde. 3a, b, h, ben ve 6b, e, hBeşten fazla hücrede benzer sonuçlar gözlendi. İstatistiksel analiz iki kuyruklu Öğrenci kullanılarak yapıldı. t şekil açıklamalarında belirtildiği gibi Dunnett'in post hoc testleri (GraphPad Prism 9) ile test veya tek yönlü varyans analizi (ANOVA). Şekil XNUMX'in grafiğini çizmek için Microsoft Excel yazılımı kullanıldı. 1d, e, g, h.

Raporlama özeti

Araştırma tasarımı hakkında daha fazla bilgi Doğa Portföyü Raporlama Özeti bu makaleye bağlantılı.

• SEO Destekli İçerik ve Halkla İlişkiler Dağıtımı. Bugün Gücünüzü Artırın.
• PlatoData.Network Dikey Üretken Yapay Zeka. Kendine güç ver. Buradan Erişin.
• PlatoAiStream. Web3 Zekası. Bilgi Genişletildi. Buradan Erişin.
• PlatoESG. karbon, temiz teknoloji, Enerji, Çevre, Güneş, Atık Yönetimi. Buradan Erişin.
• PlatoSağlık. Biyoteknoloji ve Klinik Araştırmalar Zekası. Buradan Erişin.
• Kaynak: https://www.nature.com/articles/s41467-023-42230-5