Nanobot sentezi

Nanobotlar daha önce anlatıldığı gibi hazırlandı³³. Kısaca MSNP'ler değiştirilmiş bir Stöber yöntemi kullanılarak sentezlendi.⁴¹, trietanolamin (35 g), ultra saf su (20 ml) ve hekzadesiltrimetilamonyum bromürün (CTAB; 570 mg) 95 °C'de 30 dakika boyunca karıştırılarak reaksiyona sokulması. Daha sonra tetraetil ortosilikat (1.5 ml) damla damla ilave edildi; karışım 2°C'de 95 saat süreyle reaksiyona girmeye bırakıldı ve elde edilen MSNP'ler santrifüjleme yoluyla toplandı ve etanol içinde yıkandı (üç kez, 2,500g, 5 dakika). CTAB şablonunu çıkarmak için MSNP'ler, 1.8 saat boyunca asidik metanol (30 ml HCI, 24 ml metanol) içerisinde geri akış altına yerleştirildi. Daha sonra MSNP'ler santrifüjleme yoluyla toplandı ve üç kez etanolde yıkandı (2,500g, 5 dk) MSNP'lere (6 mg ml) APTES (mg MSNP başına 1 μl) ekleyerek amin modifikasyonunu dahil etmeden önce^-1) 70 °C'de %70 etanolik çözelti içerisinde, 1 saat boyunca kuvvetlice karıştırılarak. MSNP'ler-NH₂ toplandı ve santrifüj yoluyla üç kez etanolde ve üç kez suda yıkandı (üç kez, 1,150g, 5 dakika). MSNP'ler-NH₂ 1 mg ml konsantrasyonunda PBS içerisinde yeniden süspanse edildi^-1 ve toplam hacim 900 ul'dir ve oda sıcaklığında 100 saat süreyle glutaraldehid (2.5 ul) ile aktive edilir. Aktive edilmiş MSNP'ler-NH₂ toplandı ve üç kez santrifüjleme yoluyla PBS içerisinde yıkandı (1,150g, 5 dk), bir üreaz çözeltisi (3 mg ml) içerisinde yeniden süspanse edildi^-1) ve heterobifonksiyonel PEG (mg 1 kDa HS-MSNPs-NH başına 5 μg PEG)₂) PBS içerisinde reaksiyona sokuldu ve oda sıcaklığında 24 saat reaksiyona sokuldu. Ortaya çıkan nanobotlar daha sonra toplandı ve üç kez santrifüjleme yoluyla PBS'de yıkandı (1,150g, 5 dk) daha önce açıklandığı gibi hazırlanan AuNP'lerin bir dispersiyonunda yeniden süspanse edilmeden önce⁵¹10 dakika boyunca reaksiyona girmelerini sağlayın ve santrifüjleme yoluyla iyice yıkayın (üç kez, 1,150g, 5 dk).

MSNP'lerin, MSNP'lerin-NH'nin hidrodinamik boyut dağılımı ve yüzey yükü₂, nanobotlar ve AuNP ile dekore edilmiş nanobotlar, sırasıyla bir Wyatt Mobius dinamik ışık saçılım sistemi ve bir Malvern Zetasizer kullanılarak belirlendi. Tüm durumlarda konsantrasyon 20 µg ml idi^-1 ve deneme başına üç çalıştırma kullanılarak edinme süresi 5 s. Parçacık türü başına üç ölçüm yapıldı.

FITC MSNP'lerin Sentezi

FITC (2 mg), etanol (5 ml) ve APTES (400 ul) karışımı hazırlandı ve 30 dakika karıştırıldı. Daha sonra, FITC-APTES karışımı (1.25 ul) ile kombinasyon halinde tetraetil ortosilikatı (250 ml) damla damla eklememiz dışında MSNP sentezi için daha önce açıklanan protokol takip edildi. FITC etiketli nanobotları elde etmek için işlevselleştirme adımları yukarıda belirtildiği gibiydi.

AuNP'lerin sentezi

AuNP'ler bildirilen bir yöntem kullanılarak sentezlendi³³. Kısaca tüm malzemeler taze hazırlanmış kral suyu kullanılarak temizlendi, su ile iyice durulandı ve havayla kurutuldu. Daha sonra 1 mM AuCl₄ çözelti, geri akış sistemine entegre edilmiş yuvarlak dipli bir şişede karıştırılarak kaynama noktasına kadar ısıtıldı. Bunu takiben 10 ml sodyum sitrat çözeltisi (30.8 mM) ilave edildi ve çözelti 20 dakika kaynatılarak kırmızı bir renk elde edildi. Daha sonra çözeltinin 1 saat karıştırılarak oda sıcaklığına soğumasına izin verildi. Ortaya çıkan AuNP'ler karanlıkta saklandı ve karakterizasyon, transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak yapıldı.

Enzimatik aktivite

Nanobotların enzimatik aktivitesi, ¹⁸F-nanobotlar ve ¹³¹I-nanobotlar fenol kırmızısı kullanılarak ölçüldü. Bunu yapmak için 2 µl nanobot (1 mg ml)^-1) 96 oyuklu bir plakaya eklendi ve 200 mM fenol kırmızısı içindeki 0 ul farklı üre çözeltileri (50, 100, 200, 1.1 mM) ile karıştırıldı. 560 nm'deki absorbans, zaman içinde 37°C'de ölçüldü.

Optik mikroskopla nanobot hareket dinamiği

Nanobotların optik videoları, Hamamatsu yüksek hızlı CCD kamera ve ×1.25 objektifle birleştirilmiş bir Leica Thunder mikroskobu kullanılarak elde edildi. Bunun için nanobotlar santrifüjlendi ve 50 µl PBS (nihai konsantrasyon 20 mg ml) içerisinde yeniden süspanse edildi.^-1). Daha sonra bir Petri kabı 3 ml PBS veya 300 mM üre çözeltisi (PBS içinde) ile dolduruldu ve mikroskop altında gözlemlendi. Nanobotlarla 5 µl'lik bir damla (20 mg ml)^-1) daha sonra sıvı dolu Petri kabına eklendi ve saniyede 25 kare hızında videolar kaydedildi. ROI'lerdeki video piksel yoğunluğu dağılımları, ImageJ yazılımı kullanılarak 15 saniyelik aralıklarla analiz edildi.

Nanobotların radyoetiketlemesi [¹⁸F]F-PyTFP

[Sentezi¹⁸F]F-PyTFP

[¹⁸F]F-PyTFP, daha önce bildirilen bir yöntem izlenerek bir Neptis xSeed modülünde (Optimize Edilmiş Radyokimyasal Uygulamalar) sentezlendi.³³.

Sentezi ¹⁸F etiketli nanobotlar

Nanobotlar [ ile etiketlendi¹⁸F]F-PyTFP, küçük değişikliklerle önceden belirlenmiş bir prosedüre dayanmaktadır³³. Kısaca, 200 µl nanobot çözeltisi (1 mg ml)^-1) santrifüj edildi (10 dakika, 13,853g), 10 µl PBS (1 mM, pH 8) içerisinde yeniden süspanse edildi ve 4 μl [¹⁸Oda sıcaklığında 37 dakika boyunca asetonitrilde (yaklaşık 35 MBq) F]F-PyTFP. İnkübasyondan sonra reaksiyon karışımı su (200 ul) ile seyreltildi ve santrifüjleme (5 dakika, 13,853 dakika) ile saflaştırıldı.g). Ortaya çıkan pelet daha sonra bir doz kalibratöründe (CPCRC-25R, Capintec) ölçülmeden önce üç kez suyla durulandı. Radyokimyasal verim, yıkamadan sonra nanobotlarda bulunan radyoaktivite miktarı ile başlangıçtaki radyoaktivite miktarı arasındaki oran olarak hesaplandı. Saflaştırmadan sonraki radyokimyasal saflık, iTLC-SG kromatografi kağıdı (Agilent Technologies) ve sırasıyla sabit ve hareketli fazlar olarak diklorometan ve metanol (99:2) kullanılarak radyo ince tabaka kromatografisi (radyo-TLC) ile belirlendiği üzere ≥%1 idi. TLC plakaları bir TLC okuyucu (MiniGITA, Raytest) kullanılarak analiz edildi.

kararlılığı ¹⁸F-nanobotlar

istikrarı ¹⁸F etiketli nanobotlar aşağıdaki ortam kullanılarak belirlendi: (1) 300 mM üre, (2) su ve (3) tümör taşıyan hayvanlardan alınan idrar. ¹⁸F etiketli nanobotlar (10 ul), karşılık gelen çözeltiyle (100 ul) oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edildi. Daha sonra nanobotlar ve süpernatan santrifüjleme yoluyla ayrıldı ve toplandı ve radyoaktivite bir doz kalibratöründe (CPCRC-25R) ölçüldü.

Nanobotların radyoetiketlenmesi ¹³¹I

Üreaz nanobotlarının radyoiyotlanması, nanobotların enjekte edilebilir maddelerle inkübe edilmesiyle gerçekleştirildi.¹³¹I]NaI çözeltisi (925 MBq ml)^-1; GE HealthCare). Kısaca, 400 µl üreaz nanobot çözeltisi (1 mg ml)^-1) santrifüj edildi (13,853g, 5 dk), 100 µl PBS (10 mM, pH 7.4) içinde yeniden süspanse edildi ve 25 ul veya 185 ul enjekte edilebilir [¹³¹İstenilen son aktiviteye bağlı olarak 42.55 dakika süreyle I]NaI (sırasıyla yaklaşık 277.5 veya 30 MBq). İnkübasyonun ardından reaksiyon karışımı santrifüjleme yoluyla saflaştırıldı (13,853g, 5 dakika). Ortaya çıkan çökelti üç kez su (100 ul) ile yıkandı. Süpernatan ve çökeltideki radyoaktivite, bir doz kalibratörü (CPCRC-25R) kullanılarak belirlendi ve her iki fraksiyon da radyo-TLC ile analiz edildi. ¹⁸F-nanobotlar.

Hayvan modeli geliştirme

Fareler, Avrupa Konseyi Direktifi 2010/63/UE ve iç yönergelere uygun olarak muhafaza edildi ve kullanıldı. Tüm deneysel prosedürler CIC biomaGUNE etik kurulu ve yerel yetkililer (Diputación Foral de Guipuzcoa, PRO-AE-SS-276) tarafından onaylandı. Görüntü analizi (hem PET hem de MRI), hayvanların grup dağılımına göre körleştirildi.

Mesane kanserinin ortotopik fare modeli, MB49 hücrelerinin (fare karsinomu mesane hücre çizgisi) C57BL/6JRj dişi farelere (8 haftalık, Janvier) intravezikal uygulanmasıyla oluşturuldu. Tümör birikimini belirlemeyi amaçlayan deneyler için (dört grup; ayrıntılar aşağıda), aşağıdaki varsayımlarla kesinlik analizi kullanılarak belirlendiği şekilde grup başına altı hayvan aşılandı: gerekli hassasiyet, %20; beklenen s.d., ±%20; güven, %95; hayvan kaybı, %20. Terapötik etkinlik deneyleri için (altı grup; ayrıntılar aşağıda), tek kuyruklu Öğrenci kullanılarak hesaplandığı üzere grup başına on hayvan dahil edildi. t-test, aşağıdaki varsayımlarla iki bağımsız araç arasındaki fark: boş hipotez, tedavi tümör büyümesini etkilemez; α, 0.05; 1 − β, 0.95; s.d., ±%50; gruplar arasında beklenen farklar %50; hayvan kaybı, %20. Deney, operasyonel nedenlerden dolayı iki parti halinde yürütüldüğünden, her iki partiye de birer kontrol grubu dahil edildi (Tablo XNUMX). 2) ve sonra tüm hayvanlar havuzda toplandı. Tümör oluşumu için farelere saf O3 içindeki %XNUMX izofluran solunarak anestezi uygulandı.₂ ve %1.0 O içerisinde %1.5-100 izofluran ile muhafaza edilir₂. Daha sonra mesane boşaltıldı ve intravezikal olarak 50 µl poli-l-lizin (Sigma-Aldrich) 24 kalibrelik bir kateter yoluyla 15 dakika boyunca. Daha sonra mesane tekrar boşaltıldı ve MB49 hücreleri (10⁵ Yüksek glikozlu DMEM (100 ul) içindeki hücreler), kateteri çıkarmadan ve mesaneyi karın masajı yoluyla boşaltmadan önce 1 saat süreyle aşılandı. Deneyler boyunca fareler sağlık ve refahın izlenmesi amacıyla izlendi ve tartıldı. Kilo kaybı %20'yi aşarsa veya sorumlu veteriner hekimin kriterlerine göre klinik semptomlara dayalı olarak bir insan son noktası uygulandı.

Tümör boyutu takibi

MRI çalışmaları, 7 mT m'lik bir BGA-14S gradyan eki ile donatılmış bir 7 T Bruker BioSpec USR 70/30 tarayıcı (Bruker BioSpin) kullanılarak tümör indüksiyonundan 12 ve 440  gün sonra gerçekleştirildi.^-1 ve radyofrekans için 112/086 QSN rezonatörü (T12053V3)¹⁴ iletim ve RF alımı için bir sıçan beyni yüzey bobini (T11205V3) (her ikisi de 300 MHz'de çalışıyor). Hayvanlara izofluran (%4 O1.5 içeren bir ortamda indüksiyon için %50 ve bakım için %XNUMX) ile anestezi uygulandı.₂/%50 N₂ karışımı) ve MR uyumlu bir kızağa yerleştirildi. Vücut ısısı ve solunum hızı, vücut ısısını korumak için küçük kemirgen hava ısıtıcı sistemine bağlanan MR uyumlu bir izleme cihazı (model 1030 SA, Small Animal Instruments) kullanılarak sürekli olarak izlendi. Referans görüntüleri elde ettikten sonra, aşağıdaki parametreler kullanılarak tümörleri görüntülemek için spin-eko bazlı difüzyon ağırlıklı bir görüntüleme dizisi kullanıldı: eko süresi (T_E) = 22.3 ms, tekrarlama süresi (T_R) = 2,500 ms, n = 2 ortalama, bir A0 görüntüsü (temel görüntü b = 0 sn mm^-2) ve bir gradyan süresi ile (1, 0, 0) yönündeki difüzyon gradyanları kullanılarak elde edilen bir DW görüntüsü δ = 4.5 ms ve gradyan ayrımı Δ = 10.6 ms, verir b = 650 sn mm^-2, 16 × 16 mm² görüş alanı, 160 × 160 noktalı görüntü matrisi boyutu, 20 mm kalınlıkta ardışık 0.5 dilim (boşluk yok, aralıklı modda elde edilmiştir) ve piksel başına 192.9 Hz bant genişliği. Tümörleri görselleştirmek için görüntüler ImageJ yazılımıyla son işleme tabi tutuldu ve elde edilen görüntüler bir difüzyon gradyanı ile bölündü (b = 650 sn mm^-2) olmadan edinilenler tarafından (b = 0 sn mm^-2) ve 3B Gauss filtresinin uygulanması (σ_x = σ_y = σ_z = 0.7) sonuca. Hacimlerini belirlemek için tümörlerin sınırları manuel olarak belirlendi.

İn vivo biyodağılım

Tümör indüksiyonundan sonraki 15. günde fareler, gruplar arasında homojen ortalama tümör hacmi dağılımları elde etmek için dört gruba randomize edildi. PET-CT taramaları (MOLECUBES β ve X-CUBE tarayıcıları), 3 µl'lik intravezikal uygulamadan 100 saat sonra elde edildi. ¹⁸F-BSA (grup 1 ve 2) veya ¹⁸3 μg ml konsantrasyonunda F-üreaz (grup 4 ve 200) nanobotları^-1Araç olarak su (grup 1 ve 3) veya su içinde 300 mM üre (grup 2 ve 4) kullanılarak (Tablo 1). Görüntü elde etmek için hayvanlar anesteziyle (saf oksijende %5 izofluran) indüklendi ve mesanenin boşaltılması için karın bölgesine masaj yapılmadan önce sırtüstü pozisyona yerleştirildi. Hemen ardından ilgili ¹⁸F etiketli nanobotlar (¹⁸F-BSA/¹⁸Su/üre içindeki F-üreaz) 24 kalibrelik bir kateter yoluyla mesaneye aşılandı ve kateteri çıkarmadan, mesaneyi boşaltmadan ve fareleri anesteziden sonra iyileşmeye bırakmadan önce 1 saat boyunca inkübe edildi. Şu tarihte: t Uygulamadan = 3 saat sonra hayvanlara yeniden anestezi uygulandı ve 10 dakikalık statik tüm vücut PET görüntüleri elde edildi, ardından CT taramaları yapıldı. PET görüntüleri, rastgele, dağılım ve zayıflama düzeltmeleri ile 3 boyutlu sıralı alt küme beklenti maksimizasyon yeniden yapılandırma algoritması kullanılarak yeniden yapılandırıldı. Aynı farenin PET-CT görüntüleri birlikte kaydedildi ve PMOD görüntü işleme aracı kullanılarak analiz edildi. Radyoaktivite konsantrasyonunun zamana karşı grafikleri, bir 3 boyutlu kontur aracı kullanılarak üst mesane bölgesinde bir ilgi hacmi oluşturularak ve organ başına kilobekerel cinsinden aktivite (bozunma düzeltilmiş) ölçülerek elde edildi. Sonuçlar bir kalibrasyon faktörü uygulanarak düzeltildi ve ardından MRI'dan türetilen tümör hacmiyle normalleştirildi.

Ex vivo çalışmalar

Histopatolojik analizler

Tüm görüntülemeler tamamlandıktan sonra seçilen mesaneler (n = 3 grup başına) tümör taşıyan ve sağlıklı hayvanlardan aseptik koşullarda çıkarıldı ve hemen %4 formaldehit içinde sabitlendi. Daha sonra hematoksilen-eozin boyama için 2-3 µm'lik kesitler alınmadan önce mesaneler parafine gömüldü. Histopatolojik inceleme için tüm koşullardan temsili görüntüler elde edildi.

ICP-MS analizi

Ölçümler, bir ASX-560 otomatik örnekleyici (CETAC Tech) ile birleştirilmiş bir Thermo iCAP Q ICP-MS (Thermo Fisher Scientific) üzerinde gerçekleştirildi. Tüm görüntüleme tamamlandıktan sonra hayvanlar öldürüldü ve mesaneler seçildi (n = 2 grup başına; dört grup) toplandı ve 1 ml HNOXNUMX'te sindirildi₃:HCl (4:1 karışım). Dispersiyon, organlar tamamen çözünene kadar kaynatıldı. Daha sonra çözelti oda sıcaklığına kadar soğutuldu ve her numunedeki Au konsantrasyonunu belirlemek için ICP-MS kullanılarak analiz edildi ve sonuçlar, doku gramı başına enjekte edilen dozun yüzdelerine (%ID g) dönüştürüldü.^-1).

İmmünohistokimya ve konfokal mikroskopi görüntüleme

İmmünohistokimya analizleri için tümör taşıyan hayvanlara su veya 300 mM üre içinde FITC etiketli nanobotlar verildi (n = grup başına 4), yukarıda açıklandığı gibi PET-CT çalışmaları için. Ek olarak, nanobotları olmayan tümör taşıyan hayvanlar da kontrol grubu olarak görev yaptı (n = 2). Tüm durumlarda mesaneler toplandı, donduruldu ve 10 µm'lik bölümler halinde kesildi; bunlar hemen %10 formaldehit içerisinde 15 dakika süreyle sabitlendi, 10 mM PBS ile yıkandı ve ardından 50 mM NHXNUMX içerisinde inkübe edildi.₄Tekrar PBS ile durulamadan önce 5 dakika boyunca PBS içerisinde Cl. Geçirgenleştirme, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca metanol:aseton (1:5) ve 0.1 dakika boyunca PBS içerisinde %5 Triton ile gerçekleştirildi. PBS yıkandıktan sonra numuneler, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içerisinde %0.5 BSA-%15 Tween çözeltisi ile doyuruldu ve %1 BSA'da fare anti-FITC (1:100, Abcam) ile oda sıcaklığında 5 saat boyunca inkübe edildi. –%0.5 Ara. Kesitler üç kez 10 mM PBS ile 5 dakika boyunca yıkandı ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ikincil antikor Alex Fluor 647 eşek anti-fare IgG (Molecular Probes, Life Technologies, 1:1,000) ile %5 BSA-%0.5 Tween içinde inkübe edildi. PBS içerisinde tekrar yıkandı (3 x 5 dk) ve 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; Molecular Probes, Life Technologies) içeren bir ProLong antifade kiti ile monte edildi. Görüntüler, tüm bölümler için aynı ayarlara sahip bir Leica STELLARIS 5 konfokal mikroskop (UPV/EHU Scientific Park) ile elde edildi: döşeme görüntüleme ve dikişle x10 büyütme (tipik olarak 4 x 5 görüş alanı). Lazer çizgisi ve algılama pencereleri DAPI için 405 nm ve 440–503 nm, FITC beyaz lazer için 489 nm ve 494–602 nm ve Alexa653 beyaz lazer için 660 nm ve 836–647 nm idi.

Optik temizleme

%4 paraformaldehit ve PBS ile perfüzyondan sonra mesane numuneleri çıkarıldı ve gece boyunca 4°C'de %4 paraformaldehit içinde tekrar sabitlendi, ardından silindirik bir blok oluşturmak ve kolay işlem sağlamak için %5 düşük erime noktalı agaroz içeren 0.8 ml'lik bir şırıngaya gömüldü. kuvars küvete monte edilir. Bloğun tamamı metanol:H kullanılarak aşamalı olarak dehidre edildi.₂4 °C'de O (%30:%70 1 saat için, %50:%50 1 saat için, %70:%30 1 saat için, %100:%0 1 saat için, ardından gece boyunca %100 metanol ve tekrar 4 h) ve son olarak görüntüleme için kırılma indeksi eşleştirme çözümü olarak benzil alkol-benzil benzoata (BABB) daldırıldı. Yeşil FITC nanobotlarının ticari kırmızı parçacıklarla in vitro karşılaştırmaları için, BABB temizliğine dirençli, 1 µm çapında DiagNano (Creative Diagnostics) kırmızı floresan silika nanoparçacıklarını kullandık.

Otofloresan ve polarize sLS görüntüleme

IRB Barselona'da geliştirilen, temizlenmiş tüm organ görüntülemeye yönelik özel bir sistem olan MacroSPIM'de ışık sayfası görüntüleme gerçekleştirildi^44,45. Kısaca, numuneler bir agaroz bloğa yerleştirilir, numuneyle birlikte temizlenir ve bir kuvars küvet içinde görüntülenir. Otofloresan görüntülemede, 488 mm akromatik çift silindirik lens (ACY561-638-A, Thorlabs) aracılığıyla aydınlatma sağlayan 50, 254 veya 050 nm'de lazerler kullanıldı. Şerit artefaktlarını azaltmak için ışık tabakası, G10 4 mm akromatik çift lensli (QI Optic Photonics) 322288322f teleskop boyunca rezonans tarayıcı SC-100 (EOPC) ile döndürülür. Doku otofloresansı, bant veya uzun geçişli floresan filtreler aracılığıyla toplanır ve bir ORCA Flash v2 kamera (Hamamatsu Photonics) ile kaydedilir. Görüntüleme ×9.6 yakınlaştırma, ×8 lens ve ×2 tüp lens ile ×0.6'da gerçekleştirildi. Işık tabakası görüş alanı boyunca düzleştirildi ve 5-6 µm eksenel çözünürlük sağlandı. 3D görüntüleme 2.5 µm'lik adımlarla yapıldı. Tüm mesane görüntülemesi 2 × 3 veya 3 × 4 boyutunda gerçekleştirildi. XY organ büyüklüğüne bağlı olarak fayanslar.

sLS görüntüleme, floresan filtrenin çıkarılmasıyla veya lazeri ileten herhangi bir filtrenin kullanılmasıyla elde edildi. Işık tabakasının döndürülmesi, lazer benek gürültüsünü azalttı, bu da daha önce gösterildiği gibi lazer tutarlılığının geçici ortalamasının alınmasına neden oldu⁵². Aydınlatmada doğrusal ışık tabakası polarizasyonunun yönelimi, yarım dalga plakasının (AHWP05M-600, Thorlabs) pivot tarayıcıdan önce döndürülmesiyle kontrol edildi. Tespit edilen sinyal, tespitte filtre tekerleğinden önce dönen bir doğrusal polarizör (LPVISC100, Thorlabs) kullanılarak polarizasyonda seçildi ve floresans tespitinde >%50 yoğunluk kaybına neden oldu. sLS sinyal dağılımı genel olarak polarizörün yönüne göre değişirken, doku otofloresans sinyali polarizörün dönüşünden etkilenmeden kalır. sLS, BABB'de 2.4 ± 0.3 μm'lik bir uzaysal çözünürlük sağlar; bu, floresan ışık sayfası görüntülemedeki çözünürlükle karşılaştırılabilir (bir Gauss fonksiyonunun XY Tek bir parçacığın görüntü tepkisi, Ek Şekil 1. 8l–m) ve havadaki teorik çözünürlüğe yakın (maksimum makro yakınlaştırma ×1.53'de sayısal açıklık (NA) = 0.2 ile 8 μm).

Görüntü işleme ve 3D analiz

Işık sayfası veri kümelerinin görüntü işleme, segmentasyonu ve analizi ImageJ/Fiji ile yapıldı; 3 ve 4 Imaris Viewer 9.9 (https://imaris.oxinst.com/imaris-viewer) ve Ek Video 3 Imaris 9 ile oluşturuldu (https://imaris.oxinst.com/) (Bitplane, Oxford Instruments). Döşemeli ışık sayfası veri kümeleri MosaicExplorerJ ile birleştirildi⁵³. Mesane dokusu 3D segmentasyonu, sanal modda büyük hacimlerin yarı otomatik 3D açıklaması için özel ImageJ/Fiji makroları kullanılarak gerçekleştirildi. Kısaca, ilk komut dosyası olan 'Makro1', 3 boyutlu görüntü yığınlarını yükler, çeşitli düzlemlerdeki ROI'lere kullanıcı açıklamalarının eklenmesini sağlar ve 3 boyutlu maskeler oluşturmak ve dışa aktarmak için ROI'leri otomatik olarak enterpolasyona tabi tutar. Ek açıklamaları makul bir minimumda tutarken iyi segmentasyon sürekliliğini kolaylaştırmak için her 15 düzlemde bir (her 37.5 µm'de bir) ROI'ler çizildi. İkinci bir komut dosyası olan 'Makro2', 3B maskeler arasında veya bir 3B maske ile orijinal veriler arasında tüm yığınları belleğe yüklemeden düzlem düzlemde matematiksel veya Boole işlemlerini gerçekleştirerek sonucu yeni bir yığın olarak kaydeder. Tüm maskeler, otofloresans görüntülerine açıklama eklenerek oluşturuldu.

Hem tümör hem de sağlıklı doku yüzey katmanları (Şekil 1). 3) bir maske içindeki mesane boşluğu üzerinde Fiji'nin asası ve kement aletleri kullanılarak tasvir edilmiştir. Bu ilk yineleme BC1 olarak adlandırıldığında, Macro1'in sonraki çalıştırmaları bu 3 boyutlu konturu otomatik olarak tanımlanmış bir piksel miktarı kadar genişleterek yeni maske yinelemeleri (BC2, BC3 vb.) artan genişlemelerle elde eder. Hem tümörü hem de sağlıklı dokuyu içeren ilk katman olan maske L1, BC1 maskesinin BC2'den çıkarılmasıyla elde edilir ve bu şekilde L2 ve L3 eşmerkezli katmanlar olarak elde edilir. Boşluğa en yakın tümör hacmi, bir T1 maskesi oluşturmak için tümörün değnek ve kement araçlarıyla açıklanmasıyla elde edilirken sağlıklı ürotelyum 3D katmanı, U1 maskesinde ayrı olarak tespit edildi. U1'in L1'den çıkarılması tümörün yüzey katmanını verir ve bu şekilde devam eder: L2 − U1, L3 − U1. Tersine, ürotelyumun ilk katmanı T1'in L1'den çıkarılmasıyla elde edilir. Şekil XNUMX'deki tüm katmanlar 3 33 μm kalınlığa sahip olduğu tanımlandı.

Mesane dokusunun iç kısmını tanımlamak ve bölümlere ayırmak ve ardından mesanenin iç doku hacmini tahmin etmek için aynı makrolar ve prosedürler paketi (ImageJ çubuk aracı, 500 µm'lik dijital erozyon vb.) kullanıldı (Şekil XNUMX). 4, ayrıntılar için yukarıya bakın). Dağınık sinyal yoğunluğunun histogramları, Fiji'de dağınık sinyal ve maskenin birleştirilmesiyle oluşturulmuştur.

RNT kullanarak ¹³¹I-nanobotlar

Tümör implantasyonundan sonraki 8. ve 15. günler arasında, hayvanlar altı gruba (grup 1-6) bölünerek gruplar arasında benzer ortalama tümör hacimleri elde edilmeye çalışıldı (Tablo). 2). Deneyler için hayvanlara anestezi (saf O5'de %XNUMX izofluran) uygulandı.₂) ve karın bölgesine masaj yaparak mesaneyi boşaltmadan önce sırtüstü pozisyon alın. Hemen ardından, 100 µg ml konsantrasyonunda 400 µl uygun tedavi^-1 (Tablo 2) 24 gauge bir kateter kullanılarak mesaneye damlatıldı. Tedavi ve araç (su veya üre), kateteri çıkarmadan önce 1 saat boyunca mesanede kaldı. Mesane karın masajı ile tekrar boşaltıldı ve fareler, radyoaktif kontaminasyonu gidermek için tedaviden 24 saat sonra hayvan kafesi talaşı ile değiştirilerek kafeslerindeki anesteziden kurtuldu.

Tedavi etkinliği MRI ile belirlendi

Her fare üzerinde iki MRI çalışması gerçekleştirildi: (1) hayvanları gruplar arasında randomize etmek ve başlangıçtaki (tedavi öncesi) tümör hacimlerini ölçmek için tümör aşılamasından sonraki 7 ile 14. günler arasında; (2) terapötik etkinliği değerlendirmek için tümör aşılanmasından (tedavi sonrası) sonraki 16 ila 21. günler arasında. MRI, kullanılabilirliğe bağlı olarak 7 T Bruker BioSpec ve 11.7 T Bruker BioSpec tarayıcılar (her ikisi de ParaVision 7 yazılımıyla birlikte) kullanılarak gerçekleştirildi. Dış alan anatomik görüntüleme için kritik olmadığından bu durum sonuçları etkilemedi.¹⁴. Görüntüleme deneyleri, yukarıda açıklandığı gibi aynı görüntüleme parametreleri ve işlemler kullanılarak gerçekleştirildi (Tümör boyutu takibi). 11.7 T tarayıcı durumunda kurulum, alım için bir fare kalp yüzeyi bobininden ve iletim için bir hacimsel bobinden oluşuyordu. Her dilimdeki tümör hacimleri, tümör alanını kapsayan manuel olarak çizilmiş ilgili hacimlerden belirlendi.

istatistiksel analiz

PET görüntüleme çalışmalarında, enjekte edilen dozun yüzdeleri (% ID) ve tümör hacmi başına enjekte edilen dozun yüzdeleri (% ID cm)^-3) tek yönlü ANOVA kullanılarak karşılaştırıldı. Gruplar arasındaki farklar Tukey'in çoklu karşılaştırma testi kullanılarak belirlendi. RNT bölümündeki NTV bir kaynaktan alınmıştır. t-eşleştirilmemiş değerlerin testi. Veri dağılımının normal olduğu varsayıldı ancak bu resmi olarak test edilmedi. İstatistiksel analizler GraphPad Prism v.8 ile yapıldı.

Raporlama özeti

Araştırma tasarımı hakkında daha fazla bilgi Doğa Portföyü Raporlama Özeti bu makaleye bağlantılı.

• SEO Destekli İçerik ve Halkla İlişkiler Dağıtımı. Bugün Gücünüzü Artırın.
• PlatoData.Network Dikey Üretken Yapay Zeka. Kendine güç ver. Buradan Erişin.
• PlatoAiStream. Web3 Zekası. Bilgi Genişletildi. Buradan Erişin.
• PlatoESG. karbon, temiz teknoloji, Enerji, Çevre, Güneş, Atık Yönetimi. Buradan Erişin.
• PlatoSağlık. Biyoteknoloji ve Klinik Araştırmalar Zekası. Buradan Erişin.
• Kaynak: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01577-y