Etik bildirimi

Tüm hayvan çalışmaları, Kanada Hayvan Bakımı Yönergeleri Konseyi'ndeki tavsiyelere uygun olarak yapılmıştır. Makalede bu verilerin raporlanması, ARRIVE yönergelerindeki tavsiyelere uygundur. Calgary Üniversitesi Sağlık Bilimleri Hayvan Bakım Komitesi, bu çalışmada kullanılan tüm hayvan protokollerini ve cerrahi prosedürleri onayladı (Ethics ID# AC16-0043).

iPSC nesil

C57BL/6 embriyoları (12.5. gün) toplandı, Dulbecco fosfat tamponlu salin (DPBS) içinde durulandı ve yumuşatıldı. %0.25 tripsin ile muameleden sonra, elde edilen hücre süspansiyonu birikintileri çıkarmak için filtrelendi ve yüksek glukozlu DMEM (Gibco), %10 FBS (Gibco), 1 x MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler (Gibco), 50 birim/ml Penisilin içinde kaplandı –Streptomisin (Gibco). Ortaya çıkan fare embriyonik fibroblastları (MEF'ler), iPSC'leri üretmek üzere hücresel yeniden programlama için Applied Biological Materials Inc.'e (Richmond, BC) gönderildi. MEF'ler, Lentivirüsler SFFV-OCT4, -SOX2 ve -KLF4 ile dönüştürüldü. Bir hafta sonra, ESC benzeri koloniler, besleyicilerle taze kuyulara aktarıldı. Besleyici hücrelerde iki geçişin ardından, fare iPSC'leri UCalgary'ye gönderildi. GFP'yi genoma dahil etmek için, homolojiden bağımsız hedeflenmiş entegrasyon (HITI) tekniği kullanılarak fare güvenli liman ROSA9 lokusuna 6 kb'lik bir transgen eklemek için CRISPR/Cas26 kullanıldı [136]. Her bir nükleofeksiyon reaksiyonu için, iPSC'ler için 10 ng/μl'den 916 μl CRISPR DNA ve 10 ng/μl'den 719 μl DNA Cas9 DNA yapısı ile 28.98 ng/μl GFP yapısından 414 μl karıştırılarak kullanıldı. Tüm DNA yapıları suda çözüldü. Her nükleofeksiyon reaksiyonu için, üreticinin talimatına göre A-1001 programında nükleofection kiti (fare nükleofektör kiti, Lonza, Kat. No.VPH-023) ile üç milyon iPSC'li yapılar kullanıldı. Nükleofekte edilmiş iPSC'ler, iki gün boyunca ESC ortamı ile jelatin ve MEF'ler kaplı plakalar üzerinde büyütüldü. Daha sonra SSEA1 işaretleyicili FACS yapıldı. iPSC'ler, 0.25 °C'de 5 dakika boyunca %37 tripsin ile enzimatik olarak sindirildi. Tek hücreler iki kez soğuk DPBS ile yıkandı ve 1 dakika boyunca 1 μg/ml (Santa cruz: sc-21702 PE) konsantrasyonuyla konjuge SSEA15-PE ile boyandı. GFP ve SSEA1 iPSC'ler için çifte pozitif, jelatin kaplı 96 oyuklu plakalar halinde, bir hücre/kuyu olarak sıralandı. ROSA26 lokusunda transgenin doğru pozisyonunu ve oryantasyonunu belirlemek için klonlar dizildi. Hücrelerin işlevsel iPSC'ler olarak kaldığını doğrulamak için, 1.10'un bulunduğu yerlerde teratom tahlilleri yapılmıştır.⁶ hücreler, SCID-bej farelerin sırt bölgesine deri altından nakledildi. Numuneler sabitlendi, işlendi ve parafine gömüldü. 10 uM kalınlığında kesildiler ve Safranin O ile boyandılar.

iPSC kültürü

Murin iPSC'leri, T25 şişelerinde (Fisher) mitotik olarak inaktive edilmiş fare embriyonik fibroblastlarında (MEF'ler) rutin olarak kültürlendi. Kültür ortamı, %1 esansiyel olmayan amino asit, %1 Anti-Anti, %15 fetal sığır serumu (FBS) ve 0.1 mM β-merkaptoetanol (tümü Invitrogen) ile desteklenmiş yüksek glukozlu Dulbecco's Modifiye Eagle Medium'dan (DMEM, Lonza) oluşuyordu. . iPSC pluripotensini korumak için kültür ortamına 1000 U/ml lösemi inhibe edici faktör (LIF) eklendi. Hücreler, her üç ila dördüncü günde bir yaklaşık %80 birleşmeye ulaştıktan sonra rutin olarak pasajlandı ve %5 CO ile nemlendirilmiş bir inkübatörde tutuldu.₂ 37 °C'de. Hücreler, kollajen yapı iskelesine eklenmeden bir geçiş önce, fazla MEF'leri çıkarmak için jelatin (%0.1, Fisher) kaplı şişeler üzerinde kültürlendi.

iskele hazırlığı

Kollajen-I iskelesi daha önce yayınlanmış yöntemlere göre hazırlandı.^7,14,18. Sığır fibriler kollajen I (3 mg/ml, PureCol, Advanced Biomatrix), 3D jel olarak polimerize edildi. Kısaca, %80 v/v 3 mg/ml tip I kollajen solüsyonu, 1 milyon hücre/ml iPSC süspansiyonu ve 20 x konsantre Dulbecco içinde çözülmüş %5 v/v beta-gliserol fosfat (βGP, Sigma Aldrich) ile karıştırıldı. Kartal ortamı (DMEM)¹⁸. Ardından, %15 FBS (Invitrogen), %1 esansiyel olmayan amino asitler, %1 Anti-Anti ve 0.1 mM β-merkaptoetanol (tümü Invitrogen) eklendi¹⁸. Kollajen-I/iPSC yapısı, oyuk başına 96 ul hacme sahip 100 oyuklu bir plakaya dağıtıldı. Polimerize yapı iskelesi, 37 °C'de ve %5 COXNUMX'de bir inkübatöre yerleştirildi.₂ hayvan modelinde in vivo implantasyondan 5 gün önce ön farklılaşma. Yalnızca kollajen iskele kontrolü için yukarıdaki protokol de gerçekleştirildi, ancak iPSC'ler eklenmedi. Sürecin genel bir özeti Ek Şekil XNUMX'de gösterilmektedir. S1.

Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR)

iPSC'lere sahip kollajen-I yapı iskeleleri, tohumlamadan 0, 1, 3, 5, 8, 11, 13, 15, 18 ve 21 gün sonra zaman noktalarında toplandı. Trizol (Invitrogen) ilave edildi ve Trizol içindeki kollajen/hücre matrisini parçalamak için 26 ½ gauge iğne kullanıldı. RNA, üreticinin tavsiye ettiği protokol kullanılarak izole edildi. cDNA, Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon Kiti (ThermoFisher) kullanılarak hazırlandı. RT-PCR, yine problar kullanılarak bir ABI QuantStudio 6'da gerçekleştirildi Sp7 (Mm04209856_m1) ve bglap (Mm03413826_mH), Ibsp (Mm00492555_m1), sox9 (Mm00448840_m1), Col2a1 (Mm01309565_m1), Oct4 (Mm03053917_g1), nanog (Mm02019550_s1) ve temizlik kontrolü olarak 18S (Mm03928990_g1) ile.

Akış sitometrisi ile canlılık değerlendirmesi

Hücreler, kolajenaz I işlemiyle tek hücreli süspansiyonlara ayrıldı ve analiz için bir Attune NXT ve FlowJo yazılımı kullanılarak akış sitometrisine tabi tutuldu. Numune başına en az on bin olay kaydedildi ve hücresel enkaz ve kümelenmeleri önlemek için uygun dağılım kapıları kullanılarak tüm hücrelerin analizi yapıldı. Üreticinin talimatları izlenerek Annexin-PI kiti (ThermoFisher) kullanılarak hücreler boyandı.

Hayvan modelleri

MPC soy izleme fareleri (Hic1^cre-ERT2:ROSA^tdDomates) bir C57BL/6 arka planı üzerinde Dr. T. Michael Underhill (British Columbia Üniversitesi) tarafından sağlanmıştır. Bu çalışmada 8-12 haftalık erkek ve dişiler kullanıldı. Bozulmamış ve ovariektomi (OVX) farelerinde kemik hasarı için deneysel tasarım, Ek Şekil XNUMX'de gösterilmektedir. S2.

Bu fare modelinde, endojen MPC'ler, tdTomato post-tamoksifen indüksiyonu ile kalıcı olarak etiketlenmiştir. Farelere anestezi uygulandı ve tamoksifenin aktif izomerinin ((Z)-4-Hydroxytamoxifen, Sigma) sterilize ayçiçek yağında çözüldü. Farelere 100 gün boyunca günde bir kez 100 ul tamoksifen solüsyonu (4 mg/kg) enjekte edildi, ardından rekombinasyona izin vermek için 1 haftalık bir bekleme süresi verildi.

Son tamoksifen enjeksiyonundan bir hafta sonra burr-hole (kritik olmayan boyutta) bir yaralanma gerçekleştirildi. Çapak deliği yaralanması, daha önce Taiani ve arkadaşları tarafından açıklanan prosedürler izlenerek gerçekleştirildi..^12,13,19, daha önce Uusitalo ve diğerleri tarafından yayınlanan yöntemlerden değiştirilmiş.²⁰ Farelere veteriner izofluran ile anestezi uygulandı ve ameliyattan önce deri altından 0.1 ml buprenorfin uygulandı. Proksimal tibia metafizinin medüller boşluğuna (karşı tarafa zarar vermeden) 0.7 mm çapında bir delik açmak için yüksek hızlı bir mikro matkap (Fine Science Tools) kullanıldı.¹⁹.

Homeostatik kırık modelinde, fareler üç gruba ayrıldı: tedavi edilmemiş kontrol, boş kolajen I yapısı ve kolajen I + iPSC'ler. Çapak deliği yaralanmasının hemen ardından, tedavi edilmeyen kontrol farelerinin derisi, kesi bölgesini kapatmak için zımbalandı. Boş kollajen I ve kollajen I + iPSC ile tedavi edilen fareler için, (fare başına 100 iPSC) veya hücresiz 100,000 ul jel, çapak deliği kusuruna implante edildi. Kesi yeri daha sonra zımbalarla kapatıldı ve fareler kafeslerine geri kondu ve ameliyatın hemen ardından ağırlık taşımalarına izin verildi.

Homeostatik kırık iyileşme modelinin deneysel tasarımına benzer, Hic1^cre-ERT2:ROSA^tdDomates 4 gün boyunca günde bir kez intraperitoneal tamoksifen enjeksiyonları aldı. Son tamoksifen enjeksiyonundan bir hafta sonra farelere OVX ameliyatı uygulandı. Kısaca, farelere anestezi uygulandı ve ameliyattan önce 0.1 ml buprenorfin verildi. Her iki yumurtalık bulundu ve eksize edildi. OVX ameliyatından bir hafta sonra burr-hole ameliyatı yapıldı. OVX fareleri üç gruba ayrıldı: OVX işlenmemiş kontrol, OVX boş kolajen I yapısı ve OVX ve kolajen I + iPSC'ler.

Histoloji ve immünofloresan

Tibialar dekalsifiye edildi, işlendi ve parafin mumu içine gömüldü ve 10 um'de enine kesit alındı. Safranin-O/fast-green boyama ve immünofloresan yapıldı. Kullanılan spesifik belirteçler şunlardı: TdTomato, GFP, Anti-Mo/Rt Ki-67 eFluor 660 Clone SolA15 (Invitrogen, Ki67), Bone sialoprotein (BSP) Clone WVID1(9C5) (Developmental Studies Hybridoma Bank). Slaytlar, EverBrite™ Hardset Mounting Media with DAPI (Biotium) ile işlendi ve Zeiss Axioscan mikroskobu kullanılarak görüntülendi.

doku sitometrisi

Kantitatif analiz için, ilgi alanı dijital gri tonlamalı görüntüler olarak elde edildi. Belirli bir fenotipin hücreleri, TissueQuest yazılımı (TissueGnostics) kullanılarak belirlendi ve negatif kontrollere (boyanmamış ve tek başına ikincil kontroller) göre belirlenen kesme değerleri ile ölçüldü. Tek/çift pozitif hücrelerin sınırlanması ve miktar tayini, bu eşikler kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

X-ışını mikroskobu (Xradia)

C57BL/6 farelerinde (normal ve OVX) X-ışını mikroskobu (XRM) görüntülemesi, yaralanma alanı içindeki kemik yapısını ve kallus oluşumunu değerlendirmek için kullanıldı. Tibialar (yumuşak doku ve kas dahil) toplandı ve 10 saat boyunca %24 nötr tamponlu formalin (NBF) içinde sabitlendi. 24 saat sonra, tüm yumuşak doku ve kas kemikten çıkarıldı. Numuneler, XRM görüntülemesine kadar %70'lik alkol içerisine yerleştirildi. XRM için numune hazırlamak üzere kaval kemiği alkolden çıkarıldı ve dik bir tutucuda köpük kullanılarak sabitlendi. Görüntüleme sırasında hidrasyonu sağlamak için PBS kullanıldı. Üç kalsiyum hidroksiapatit (CHA) kemik kalibrasyon fantomu (yoğunluklar 50, 1000 ve 1200 mg/cm³) aynı hizada oturması için ince bir köpük tabakasının üzerine yerleştirildi ve bant kullanılarak tutucuya sabitlendi. Düşük enerjili (40 kVp voltaj, 3 W güç) XRM taramaları, 4 × objektif kullanılarak gerçekleştirildi. Her projeksiyonun maruz kalma süresi 3 s idi ve dönüş başına 2001 projeksiyonu toplandı. Görüntüler, 4.9 um'lik bir izotropik voksel boyutuna göre yeniden yapılandırıldı. XRM taramasından elde edilen ham veriler, Amira yazılımı ve özel SimpleITK komut dosyaları (v0.10.0, http://www.simpleitk.org/)²¹. Çapak deliği kusurunu içeren tüm dilimler, kortikal kemiğin bittiği yere kadar olan alan ve kusur bölgesinden uzanan yeni oluşan tüm kemik nasırları dahil olmak üzere bölümlere ayrıldı (Ek Şekil XNUMXa). S3). İlgi alanları (ROI'ler), ITK-SNAP (v3.8.0, vXNUMX, http://www.itksnap.org/)²². Her ROI'de ortalama lineer zayıflama hesaplandı ve XRM görüntülerini kalibre etmek için bir lineer kalibrasyon denklemi uyduruldu. Tüm kalibrasyonlar için, R² > %99. 800 mg/cm yoğunluk eşiği³ tamamen mineralize dokuyu segmentlere ayırmak için kullanıldı. Kallus kemik hacmi kırığı (BV/TV), kallus segmentasyonundaki tamamen mineralize voksel sayısının kallus segmentasyonundaki toplam voksel sayısına bölümü olarak hesaplandı. Kallus kemiği mineral yoğunluğu (BMD), kallus segmentasyonu içindeki ortalama yoğunluk olarak hesaplandı. Nasır işlemeleri, ParaView (5.7.0) yazılımı kullanılarak üretildi. Üç filtre uygulandı: (1) Eşik—minimum 0.5'te, (2) Çıkarma yüzeyi ve (3) Pürüzsüz—400 yinelemede.

istatistiksel analiz

Tüm veriler GraphPad Prism 9 kullanılarak analiz edildi. İkiden fazla deney grubu içeren tüm veri setleri, bir Fisher's LSD post-hoc testiyle %95 güven aralığında (α = 0.05) tek yönlü bir varyans analizi (ANOVA) kullanılarak analiz edildi. . Yalnızca iki grup içeren veri setleri, %95 güven aralığı (α = 0.05) ile iki kuyruklu eşleştirilmemiş bir parametrik t-testi kullanılarak analiz edildi.

• SEO Destekli İçerik ve Halkla İlişkiler Dağıtımı. Bugün Gücünüzü Artırın.
• EVM Finans. Merkezi Olmayan Finans için Birleşik Arayüz. Buradan Erişin.
• Kuantum Medya Grubu. IR/PR Güçlendirilmiş. Buradan Erişin.
• PlatoAiStream. Web3 Veri Zekası. Bilgi Genişletildi. Buradan Erişin.
• Kaynak: https://www.nature.com/articles/s41598-023-36609-z