Ekipman, reaktif ve/veya malzeme sağlayan şirketler: Abcam, Cambridge, MA; ACD Laboratuvarları, Toronto, CA; Acris Antikorları, Inc), San Diego, CA; Advanced Bioscience Resources, Inc (ABR), Rockville, MD; Agilent Teknolojileri, Santa Clara, CA; Alpco Diagnostics, Salem, NH; Uygulamalı Biyosistemler, Foster City, CA; BD Pharmingen, San Jose, CA; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ; Betil Laboratuvarları, Montgomery, TX; BioAssay Systems, Hayward, CA; Cambridge İzotop Laboratuvarları, Tewksbury, MA; Biotime, Inc, Alameda, CA; Carl Zeiss Mikroskopisi, Thornwood, NY; Carolina Liquid Chemistries, Corp., Winston-Salem, NC; Charles River Laboratories International, Inc, Wilmington, MA; Chenomx, Inc, Alberta, Kanada; Cole-Parmer, Court Vernon Hills, IL; DiaPharma, West Chester Kasabası, OH; Fisher Scientific, Pittsburgh, PA; Gatan, Inc, Pleasanton, CA; Illumina, San Diego, CA; Yaratıcılık, Redwood City, CA; Life Technologies Corp., Grand Island, NY; Leica, Washington, DC; LifeSpan Biosciences, Inc, Seattle, A; Molecular Devices, Sunnyvale, CA; Olympus Scientific Solutions Americas Corp., Waltham, MA; PhoenixSongs Biologicals (PSB), Branford, CT; Polysciences, Inc, Warrington, PA; Qiagen, Germantown, MD; Ar-Ge Sistemleri, Minneapolis, MN; RayBiotech, Norcross, GA; Roche Diagnostics, Mannheim, Almanya;Santa Cruz Biotechnology, Inc), Dallas, TX; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; Sofregen, Medford, MA; Takara, Otsu, Japonya; Tousimis Research Corp., Rockville, MD; Üçgen Araştırma Laboratuvarları (TRL), Araştırma Üçgeni Parkı, NC; Umetrics, Umea, İsveç; Varian Medical Systems, Inc), Palo Alto, CA; Vektör Laboratuvarları, Burlingame, CA; VWR Scientific, Radnor, PA.

Etik ifadeler, hayvanların nasıl korunduğunu özetler. Tüm hayvan deneyleri, Raleigh'deki North Carolina Eyalet Üniversitesi'nin (NCSU) ve Chapel Hill'deki North Carolina Üniversitesi'nin (UNC) onaylı Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitelerine sıkı sıkıya bağlı olarak gerçekleştirildi ve bu nedenle Bildirge'de belirtilen ilkeler izlendi. tüm insan veya hayvan deneysel araştırmaları için Helsinki. Hayvan çalışmalarında kullanılan ve insan dokularının kullanımını içeren tüm prosedürler, her iki kurumdaki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) ve Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) komiteleri tarafından onaylanmıştır: UNC ve NCSU'daki Veterinerlik Fakültesi . IACUC onay numaraları 16-316.0 ve 17-225.0'dır. Bu projede insan hücreleri için yapılan çalışmalar KİK komitesi tarafından değerlendirilmiş ve 97-1063 KİK onay numarası verilmiştir.

İnsan örnekleri, her bir örnekle ilgili bilgileri ve tüm örnekler için genel bilgileri içerir ve önceki çalışmalarda ayrıntılı olarak sağlanır:^39,41,42

Fetal karaciğer dokusu, akredite bir kuruluş (Advanced Biological Resources, San Francisco, CA) tarafından gebeliğin elektif olarak sonlandırılmasıyla elde edilen 18 ila 22 haftalık gebelik haftaları arasındaki fetüslerden sağlandı. Araştırma protokolü, UNC'deki İnsan Araştırma Çalışmaları için IRB tarafından gözden geçirildi ve onaylandı. Tüm numuneler çeşitli patojenler için tarandı ve sadece bunlardan ari olanlar araştırma çalışmaları için kabul edildi.

Doğum sonrası karaciğerler, kadavradan neonatal, pediatrik ve yetişkin donörlerden elde edildi ve UNOS aracılığıyla organ bağışı programları aracılığıyla elde edildi. Bu çalışmalar için kullanılanlar, aşağıdaki patojen taramaları da dahil olmak üzere hiçbir hastalık süreci kanıtı olmaksızın normal kabul edildi. Araştırma amacıyla karaciğerlerin kullanımı için en yakın akrabalardan bilgilendirilmiş onam alındı, protokoller IRB onayı aldı ve işleme, İyi Üretim Uygulamalarına uygun oldu.

Domuz örnekleri, North Carolina Eyalet Üniversitesi'ndeki (NCSU, Raleigh, NC) Veterinerlik Koleji'ndeki tesislerde tutulan hayvanlardan alındı. Bazıları konakçı veya hücreler için donör olarak kullanıldı. Bu tesislerde ameliyatlar, otopsiler ve tüm biyolojik sıvı ve dokuların toplanması gerçekleştirildi.

Aşılar için kullanılan domuz konakçıları, altı farklı ırkın bir karışımıydı: Yorkshires, Large Whites, Landraces (dişi domuzlardan), Durocs, Spots ve Pietrans'tan (yaban domuzlarından) oluşan altı yollu bir melez. Bu oldukça heterojen genetik arka plan, insan popülasyonlarının heterojen genetik yapılarına paralel olması açısından arzu edilir.⁶⁵. Ev sahibi hayvanların hepsi dişiydi, ~6 haftalık ve ~15 kg.

Yeşil floresan proteini (GFP)⁺ H2B histon-eGFP transgeni taşıyan transgenik domuz donörleri oluşturuldu. GFP⁺ donör hayvanlar, standart suni tohumlama ile yabani tip yaldızlı bir transgenik H2B-GFP domuzu yetiştirilerek elde edildi.⁶⁶. Model, IRES-pH9B-eGFP'nin CRISPR-Cas2 aracılı homolojiye yönelik onarımı (HDR) yoluyla endojen β-aktin (ACTB) lokusuna geliştirildi. Transgenik hayvanlar, tüm dokularda her yerde bulunan pH2B-eGFP ifadesini gösterir. GFP'nin H2B'ye füzyonu, GFP işaretleyicisinin nükleozoma lokalizasyonuyla sonuçlanır ve net nükleer görselleştirmenin yanı sıra kromozom dinamiklerinin incelenmesine izin verir. Kurucu çizgi kapsamlı ve her yerde analiz edildi ve nükleer lokalize ifade doğrulandı. Ek olarak üreme, H2B-GFP'nin bir sonraki nesle aktarıldığını göstermiştir. Tüm hayvanlar sağlıklıydı ve pH2B-eGFP'nin iletimi için beklenen Mendel oranını gösteren soy ile çoğul gebelikler kuruldu. Erkek yavrular doğumda genotiplendi ve transgen için pozitif olanlar, doku toplanması ve donör hücrelerinin izolasyonu için insanca ötenazi edildi.

Domuz hayvanların genotiplemesi yapıldı. Her donör ve alıcı hayvan için, domuz lökosit antijeni sınıf I (SLA-I) ve sınıf II (SLA-II) lokusları, PCR'ye dayalı olarak bu bölgelerdeki bilinen alelleri çoğaltmak üzere tasarlanmış primerler kullanılarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile çoğaltılmıştır. -diziye özgü-primer stratejisi¹⁸. Sistem, SLA-47, SLA-1 ve SLA-2 lokuslarını güçlendiren 3 ayrımcı SLA-I primer setinden ve DRB47, DQB1 ve DQA lokuslarını güçlendiren 1 ayrımcı SLA-II primer setinden oluşur.⁶⁷. Bu primer setleri, benzer sekans motiflerini paylaşan gruplar tarafından alelleri ayırt etmek için geliştirilmiştir ve bilinen SLA-I ve SLA-II alellerini kolayca ve açık bir şekilde saptadığı gösterilmiştir. Birlikte kullanıldıklarında, bu primer setleri, test edilen her hayvan için etkili bir şekilde bir haplotip sağladı, böylece donör ve alıcı hayvanlarda eşleşen veya eşleşmeyen bir haplotipi kolayca doğrulamak için bir tahlil sağladı.

Domuzlar üzerindeki ameliyatlar, IV veya 2 mg/kg ketamin artı 3 g/kg ksilazin IM enjekte edilen ketamin/ksilazin (her biri 20-2 mg/kg ağırlık) kombinasyonu uygulanarak indüklenen anestezi kullanılarak yapıldı ve oksijen içinde izofluran ile sürdürüldü. kapalı devre gaz anestezik ünitesi ile uygulandı. Karaciğerdeki greftlerde ve genel cerrahi prosedürlerde, domuzlar sırt üstü yatırıldı ve ventral karın, ksifoidden pubise kırpıldı. Cilt, dönüşümlü olarak iyotlu ovma ve alkol solüsyonları ile aseptik olarak hazırlandı. Ameliyathaneye giriş sonrası steril teknikle cilt hazırlığı tekrarlandı ve steril cerrahi örtü uygulaması öncesinde bölge topikal iyotlu solüsyon ile kapatıldı. Cerrahlar uygun bir aseptik teknik kullandılar. Mid-ventral insizyon deri ve subkutan dokular içinden yapıldı ve çizgi alba, ksifoid süreçten başlayarak ve kaudal olarak 8–12 cm uzanan. Sol hepatik bölüm açığa çıkarıldı ve karaciğerin ventral yüzeyine gömülü BTSC organoidleri ile 3X hiyalüronan hidrojel (~4.5 Pa) içeren ve 1X hiyalüronan hidrojel (~ 60 Pa); yama, karaciğer kapsülünün yüzeyine doğrudan temas edecek şekilde yerleştirildi. Yama greft karaciğere 10-760 basit, kesikli 4-6 polipropilen sütür kullanılarak dikildi. Greftin açıkta kalan yüzeyi daha sonra 4 ml 0X hiyalüronan hidrojel (~2–2 Pa), greftin dışına boyanmasına veya kaplanmasına izin verecek kadar sıvı olan bir sertlik düzeyi ile işlendi; komşu dokulardan yapışıklıkları en aza indirmeye daha fazla hizmet etti. Cerrahi greftin yerleştirilmesini takiben, çizgi alba 0-PDS kullanılarak basit sürekli sütür ile kapatıldı. bu çizgi 2 mg/kg %0.5 bupivakain, IM ile bloke edildi. Deri altı dokular ve cilt sırasıyla 2-0 PDS ve 3-0 Monocryl dikişlerle kapatıldı. Deri yüzeyine doku yapıştırıcısı yerleştirildi.

Pankreas üzerindeki greftler için, domuzlara yönelik cerrahi prosedürler, pankreasın boyutlarını barındıran herhangi bir boyutta olabilen bir greftten yararlanmıştır. Pankreasın açığa çıkması için inen duodenuma dikiş atıldı. Greft, pankreas ile doğrudan temas halinde olan organoidleri içeren yumuşak hiyalüronan (~60 Pa) hidrojel ve ipek içindeki daha sert hiyalüronan hidrojel (~760 Pa) ile pankreasın başına ve duodenuma bitişik olarak yerleştirildi. destek. Dört köşede dikiş kullandık (4-0 Prolen); ilk iki köşe dikişi inen duodenuma yerleştirildi; diğer 2 tanesi mezentere yerleştirildi ve pankreas parankiminden kaçınıldı (pankreas tarafından herhangi bir otoliz eğilimini en aza indirmek için). Adezyonları en aza indirmek için greftin serozal yüzeyi daha sonra 2X hiyalüronan (~200–300 Pa) hidrojel ile kaplandı. Karın linea, subkutan ve subkutiküler tabakalarda sürekli emilebilir (PDS) sütürlerle kapatıldı. Cilt dikişlerini önlemek için ciltte doku yapıştırıcısı kullanıldı.

Transgenik domuzlardan vahşi tip alıcılara yapılan nakiller allojenik olduğu için immünosupresyon gerekliydi. Kullanılan bağışıklık bastırma protokolleri, başkaları tarafından oluşturulmuş olanlardır.^68,69. Tüm domuzlara, ameliyattan 0.5 saat önce başlayarak günde iki kez immünsüpresif ilaçlar, Takrolimus (500 mg/kg) ve Mikofenolat (24 mg) oral dozları verildi. İlaçlar, tüm deney süresi boyunca sürekli olarak verildi. Bunlar, en sevdikleri yiyeceklerle karıştırılarak hayvanlara kolayca verilebilir.

Normal dokuların izolasyonu, yeni doğmuş domuz yavrularından ve daha yaşlı, 12 haftalık domuzlardan yapıldı. Yeni doğan domuz yavruları ~10 lb ağırlığındaydı; 12 haftalık daha yaşlı domuzlar ~ 50-60 lb idi. Domuzlar, delici tutsak cıvata ötenazi ve ardından juguler kan kaybıyla kurban edildi. Yöntem, Amerikan Veteriner Hekimler Birliği'nin domuzlarda ötenazi için önerilen yönergelerini karşılar.⁶⁵. Domuz yavrularından veya yetişkin domuzlardan safra dokuları için kullanılan donörlerin listesi Ek Tabloda verilmiştir. 4.

Tüm ortamlar steril olarak filtrelendi (0.22 um filtre) ve kullanımdan önce 4 °C'de karanlıkta tutuldu. Bazal ortam ve fetal sığır serumu (FBS), GIBCO/Invitrogen'den satın alınmıştır. Tüm büyüme faktörleri Ar-Ge Sistemlerinden satın alınmıştır. Belirtilenler dışındaki tüm diğer reaktifler Sigma'dan temin edildi.

500 ml bazal ortamdan (örn. RPMI 1640; Gibco # 11875-093) oluşan hücre yıkama tamponları, 0.5 g serum albümini (Sigma, # A8896-5G, yağ asidi içermez), 10^-9 M selenyum ve 5 ml antibiyotik (Gibco #35240-062, AAS). İşleme sırasında dokuları ve hücreleri yıkamak için kullanıldı.

Kollajenaz tamponu, safra ağacı (kanalları) dokusu için 100 U/ml (R5138 600 mg) ve organlar için 1451 U/ml (25 mg) nihai konsantrasyona sahip kollajenaz (Sigma # C300) ile desteklenmiş 12.5 ml hücre yıkamasından oluşuyordu ( örneğin karaciğer).

Kubota's Medium, orijinal olarak hepatoblastlar için tasarlanmış tamamen tanımlanmış, serumsuz bir besiyeri⁷⁰ve daha sonra safra ağacı kök hücrelerinin, hepatik kök hücrelerin ve pankreas kök hücrelerinin ve progenitörlerinin bakımı için başarılı bulundu (ve daha sonra değerlendirilen tüm endodermal kök/progenitörler için genel olarak başarılı bulundu), hücre süspansiyonları, organoidler hazırlamak için kullanıldı ve hiyalüronan hidrojelleri. Bu besiyeri, bakır içermeyen, düşük kalsiyum (1640 mM), 0.3 nM selenyum, %1 serum albümin (saflaştırılmış, yağ asidi içermeyen; fraksiyon V), 0.1 mM nikotinamid, 4.5 içermeyen herhangi bir bazal ortamdan (burada RPMI 0.1) oluşur. nM çinko sülfat heptahidrat, 5 µg/ml transferrin/Fe, 5 µg/ml insülin, 10 µg/ml yüksek yoğunluklu lipoprotein ve yağ asidi içermeyen, yüksek oranda saflaştırılmış albümin ile kompleks halinde sunulan saflaştırılmış serbest yağ asitlerinin bir karışımı . Serbest yağ asidi karışımı, palmitik asit, palmitoleik asit, stearik asit, oleik asit, linoleik asit ve linolenik asitten oluşuyordu. Kubota'nın ortamı şu adresten ticari olarak temin edilebilir: PhoenixSongs Biyolojik (Branford, BT).

Kullanılan Hiyalüronanlar (HA'lar), HA'nın çözünür, uzun zincirli formlarını (Sigma Katalog #52747) içerir ve organoid kültürlerin stabilizasyonunda ve hücre süspansiyonlarının kriyoprezervasyonunda kullanılmıştır.^71,72. Hidrojelleri yapmak için kullanılanlar, tiyole modifiye edilmiş HA'lar, daha önce Lineage Cell Therapeutics'in (Alameda, CA) bir yan kuruluşu olan Glycosan Biosciences'tan alındı ​​ve şimdi Advanced Biomatrix'ten (Carlsbad, CA) klinik olmayan dereceli formda sunuluyor ve Sentrex Animal Care'den (Salt Lake City, UT) klinik dereceli formda (G. Prestwich, kişisel iletişim). Bu tiyole modifiye edilmiş HA'ların bileşenleri, özel bir bakteriyel fermantasyon işlemi kullanılarak yapılmıştır. Bacillus subtilis bir ISO 9001:2000 sürecinde ana bilgisayar olarak (www.biopolymer.novozymes.com/). Bileşenler, Novozymes tarafından HyaCare® ticari adı altında üretilmiştir ve %100 hayvansal türevli materyaller ve artık organik solvent içermez. Üretimde hiçbir hayvansal içerik kullanılmaz; çok düşük protein seviyeleri vardır ve endotoksin yoktur. Üretim, Avrupa Farmakopesi tarafından belirlenen standartları takip eder. HA hidrojelleri, oksijen varlığında disülfid köprüleri oluşturmak üzere tetiklenebilen tiol modifiyeli HA'lar olan Glycosil (HyStem® HAs, ESI BIO-CG313) kullanılarak veya polietilen glikol diakrilat (PEGDA) kullanılarak tio-eter bağlantıları oluşturarak hazırlandı. ). Glycosil®, gazı giderilmiş su kullanılarak veya bizim durumumuzda serumsuz Kubota Ortamı kullanılarak %1 fosfat tamponlu salin (PBS) içinde %1 tiyolatlı HA çözeltisi olarak yeniden oluşturulur. Sulandırıldıktan sonra birkaç saat sıvı kalır, ancak oksijene maruz kaldığında bir miktar jelleşmeye uğrayabilir. Glycosil, PEGDA gibi bir çapraz bağlayıcı ile işlenirse, birkaç dakika içinde jelleşmenin oluşmasına neden olursa, sıcaklık veya pH değişikliği olmadan daha kesin jelleşme meydana gelir.^73,74,75,76.

Çapraz bağlanma seviyesi, sertlik (viskoelastisite) veya sertlik seviyesine birincil katkı sağlar ve tiyolle modifiye edilmiş hiyalüronanların PEGDA'ya oranı ayarlanarak kontrol edilebilir.⁷⁶. Önceki çalışmalarda, hepatik kök hücre popülasyonları, değişen sertlik seviyelerine sahip HA hidrojellerinde test edilmiş ve hem antijenik hem de fonksiyonel olarak (örneğin, göç etme kabiliyeti ve kök hücre ile ilişkili genlerin ekspresyonu açısından) kök hücreler olarak kaldıkları bulunmuştur. pluripotens genleri ve matriks metaloproteinazlar gibi), sadece rijitlik seviyesi ~100 Pa'dan az ise⁷⁶. Bu bulguyu, BTSC'lerin organoidlerini gömmek için yumuşak bir tabakaya (~100 Pa veya daha az) sahip greftler tasarlamak ve diğer yönlerde göçe karşı bir bariyer oluşturmak için sırtta daha sert tabakalara (~700 Pa) hiyalüronan hidrojellere sahip greftler tasarlamak için kullandık. adezyonları en aza indirgemek için hedef dokudan ve orta düzey sertlikte (~200–300 Pa) olanlardan daha fazla.

Hiyalüronan hidrojellerinin makro ölçekli reolojik özellikleri, stres kontrollü bir koni ve plaka reometresi (TA Instruments, AR-G2, 40 mm koni çapı, 1° açı) kullanılarak belirlendi. Jeller, çapraz bağlama reaksiyonlarının yeterli şekilde tamamlanmasını sorgulamak için sürekli olarak izlenen modül ile 1 rad/s frekansında ve 0.6 Pa gerilim genliğinde salınırken reometre üzerinde aktif olarak polimerize oldu. Dengelendikten sonra, hidrojeller bir salınımlı frekans taramasına tabi tutuldu (stres genliği: 0.6 Pa, frekans aralığı: 0.01–100 Hz).

Hücrelerin hazırlanması, domuzlardan [veya insan dokusundan] elde edilen ekstrahepatik safra ağacı dokusundan (safra kesesi, ortak kanal, hepatik kanallar) yapıldı. Normal hücrelerin organoidlerini oluşturmak için kullanılan dokular için, intrahepatik ve ekstrahepatik safra kanallarının bağlantısını dikkatle koruyarak parankimal hücreleri ortadan kaldırmak için dokular sterilize edilmiş, paslanmaz çelik bir tokmakla dövüldü. Safra ağacı daha sonra antibiyotikler, %0.1 serum albümin ve 1 nM selenyum (10^-9 M). Daha sonra çapraz neşterlerle mekanik olarak ayrıştırıldı ve agregatlar, %1640 sığır serum albümini (BSA) [veya insan dokuları için, insan serum albümini, HAS], 0.1 nM selenyum, 1 ile desteklenmiş RPMI-300'ta bir hücre süspansiyonuna enzimatik olarak dağıldı. U/ml tip IV kolajenaz, 0.3 mg/ml deoksiribonükleaz (DNAz) ve antibiyotikler. Sindirim, 32-30 dakika boyunca sık karıştırma ile 60 °C'de yapıldı. Çoğu doku, iki tur sindirim ve ardından 1100 °C'de 4 rpm'de santrifüjleme gerektirdi. Hücre topakları birleştirildi ve hücre yıkamasında yeniden süspanse edildi. Hücre süspansiyonu 30x'te santrifüjlendig Kırmızı kan hücrelerini çıkarmak için 5 °C'de 4 dakika. Hücre peletleri tekrar hücre yıkamasında yeniden süspanse edildi ve taze hücre yıkamasıyla 40 um'lik bir naylon hücre süzgecinden (Becton Dickenson Falcon #352340) süzüldü. Hücre sayıları belirlendi ve canlılık, Trypan Blue kullanılarak değerlendirildi. Rutin olarak %90-95'in üzerinde hücre canlılığı gözlendi.

Organoidlerin oluşumu, serumsuz Kubota ortamında çok oyuklu, düz tabanlı hücre kültürü plakalarına (Corning #353043) eklenen hücre süspansiyonlarından yapıldı ve olgun mezenkimal hücrelerin (örn. olgun stroma) bağlanmasını kolaylaştırmak için 37 °C'de ~ bir saat süreyle inkübe edildi , olgun stellat hücreler). Ortam serumsuz olmasına rağmen ~15 dakika içinde tabaklara bağlanan olgun mezenkimal hücreler. Süspansiyonda kalan olgunlaşmamış hücreler başka bir tabağa aktarıldı ve tekrar bir saate kadar inkübe edildi. Bu, olgun mezenkimal hücrelerin önemli bir kısmının tükenmesini sağlamak için birkaç kez tekrarlandı. Olgun mezenkimal hücrelerin tükenmesinden sonra, kalan yüzen hücreler ~ 2 x 10'da ekildi.⁵ Corning'in ultra düşük bağlantı tabaklarında (Corning #3471) serumsuz Kubota ortamında kuyu başına hücreler ve bir CO37 içinde XNUMX °C'de gece boyunca inkübe edildi₂ kuluçka makinesi. Biliyer ağaç kök hücrelerinden (BTSC'ler) oluşan organoidler, gece boyunca oluşan erken soy evresi mezenkimal hücrelerle (ELMSC'ler) ortak oldu. ELMSC'ler, spesifik yüzey antijenlerinin ekspresyonu ile anjiyoblastlar (CD117) olarak bulundu.⁺, CD31^-, VEGFr⁺) ve endotel öncülleri (CD31⁺, VEGFr⁺) ve yıldız hücrelere (ICAM-1⁺, CD146⁺). Bu ELSMC'lerin daha kapsamlı karakterizasyonları yapılmıştır ve bulgular daha önce yayınlanmıştır.^77,78. Organoid kültürler, özellikle ortam hiyalüronanların (Sigma) çözünür biçimleriyle (%0.1) desteklenmişse, Kubota ortamında haftalarca hayatta kaldı.

Hücreler ayrıca aşağıda açıklandığı gibi dondurularak saklanabilir. Domuz safra ağacı dokusunun her bir gramından ~1.5 × 10 elde ettik.⁷ hücreler. ~3–6 × 10 kullandık⁵ 6 oyuklu, ultra düşük bağlantı plakasının kuyusu başına hücreler ve serumsuz Kubota ortamında inkübe edildi. Hücreler ortalama olarak 6000–20,000 küçük organoid üretti (~50–100 hücre/organoid/kuyu). Greftler için en az 100,000 organoid kullandık (>10⁷ hücreler). Desteğin boyutuna bağlı olarak greftlerdeki organoid sayısını >10'a kadar çıkarabildik.⁸ organoidler (yani ~10⁹ 1 cm x 3 cm arkalık üzerinde ~4.5 ml yumuşak hiyalüronan hidrojel içine gömülmüş toplam hücreler) veya daha fazlası.

Kök/progenitörlerin kriyoprezervasyonu, izole edilmiş hücrelerin veya olgun mezenkimal hücrelerin sayısını en aza indirmek için kaydırma prosedürlerine tabi tutulmuş küçük hücre kümelerinin kriyoprezervasyonuyla en başarılı şekilde yapıldı. Antifriz faktörleri, dekstran ve DMSO (Bioliife, Seattle, WA) içeren bir izotonik kriyoprezervasyon tamponu olan Cryostor10'da kök/progenitörler ve erken soy evresi mezenkimal hücrelerin karışımı dondurularak saklanabilir. Hücrelerin yaşayabilirliği, %0.1 HA'lar (Sigma #52747) ile takviye ile daha da iyileştirildi.^71,72. Organoidlerin en yüksek yaşayabilirliği, taze çözülmüş, kriyoprezerve edilmiş hücre süspansiyonlarından hazırlandığında; dondurularak saklanan, tamamen oluşturulmuş organoidlerde daha düşük canlılık gözlendi. Kriyoprezervasyon, CryoMed™ Kontrollü Hızlı Dondurucular kullanılarak yapıldı. Bir hücre süspansiyonu olarak dondurularak saklanan ve daha sonra çözdürme üzerine organoidler oluşturmak için kullanılanlar için çözme sırasında canlılık %90'dan fazlaydı.^71,72.

Yama greftler, büyük sayıları (örn. >10⁸th) organoidlerin katı organlara dönüştürülmesi ve organoidlerin bir hafta içinde organlarla tam olarak bütünleşmesi ve bir hafta içinde yetişkin hücrelere olgunlaşması. Organoidlerin katı organlara yama aşılanması için mantık, stratejiler ve yöntemler hakkında daha fazla ayrıntı önceki yayınlarımızda verilmiştir.^54,55. Greftler, üzerine yumuşak hiyalüronan hidrojellere (~50–100 Pa) gömülü kök/progenitör organoidlerin yerleştirildiği bir destek, Contour Seri-ipek (Sofregen, Medford, MA) kullanılarak oluşturuldu. Bunlar vaktinden önce kolayca hazırlandı ve gece boyunca bir inkübatörde bir kültür çanağında tutuldu. Organoidleri yumuşak hidrojeller içinde dondurarak saklama girişimlerinin başarısız olması, organoidlerin yumuşak hidrojele gömülmesinin, greftleri takmak için ameliyattan hemen önce yapılması gerektiği anlamına geliyordu.

Güncelleme: Contour Seri-ipeğin artık üreticiden temin edilemediğini öğrendik. Vivex Biologics'ten (Miami, FL) alınanlar gibi amniyon bazlı matris malzemeleri uygun bir ikame sağlamalıdır ve klinik veya klinik olmayan amaçlar için FDA onaylı bir implant malzemesidir. Bunlar, greftler için yeterli mekanik destek sağlamalıdır ve donör organoidler üzerindeki etkilerde makul ölçüde nötr olduğu varsayılmaktadır; bu, organoidlerin, aşılama ve göç için gerekli olan matris metaloproteinazları (MMP'ler) ifade etmelerini sağlayan kök hücre özelliklerini korumalarını sağlamak için önemlidir.⁵⁴. Bu tür amniyon türevli matrislerin klinik kullanımları yakın tarihli bir incelemede başkaları tarafından tartışılmıştır.⁷⁹. Bariyer görevi görmesi gereken amniyon içindeki karmaşık matris kimyası göz önüne alındığında, daha sert hiyalüronan hidrojelinin (~700 Pa) gerekli olmayacağı varsayılmaktadır. Bununla birlikte, hedef bölgeye bağlandıktan sonra, bir amniyon matris bariyerinin yine de her iki tarafında hiyalüronanlar ve serumsuz Kubota's Medium ile ve orta sertlik seviyesinde (~200–300 Pa) hazırlanmış hiyalüronanla kaplamayı gerektirebileceği varsayılmaktadır. ). Ameliyat sırasında serozal taraftaki kaplama, komşu dokulara yapışıklıkları en aza indirmelidir.

Otopsi prosedürleri için tüm hayvanlar, belirlenen zaman noktasında Ketamin/Ksilazin ve izofloran anestezisi ile sedasyon ve ardından ölümcül dozda sodyum pentobarbitalin intravenöz enjeksiyonu ile insani bir şekilde ötenazi edildi. Ölümün doğrulanması üzerine karkas dikkatlice parçalara ayrıldı ve hedef organlar çıkarıldı ve laboratuvara taşınmak üzere soğutulmuş Kubota's Medium'a yerleştirildi. Karaciğere ek olarak akciğerler, kalp, böbrek ve dalak toplandı ve %10 nötr formalinde sabitlendi.

Domuzlardan yeni disseke edilmiş dokuların kısımları üzerinde histoloji yapıldı veya karaciğer veya pankreas üzerindeki aşılar %4 paraformaldehit (PFA) ile sabitlendi ve ardından parafine gömüldü. Rutin histolojik analizler için beş mikronluk kesitler kesildi ve hematoksilen-eozin ile boyandı. Yenidoğan domuzlarından elde edilen dokular, safra ağacı ve pankreas kanalı sistemi boyunca bağlantıların analizini kolaylaştırmak için büyük parafin bloklarında numuneler (karaciğer, pankreas, safra ağacı ve duodenum) olarak da hazırlandı.

Çeşitli belirteçlerin ve özelliklerin analizleri için immünohistokimya (IHC) kullanıldı. İmmünofloresan boyama için, 5 um donmuş kesitler veya kültürlenmiş hücreler, oda sıcaklığında 4 dakika süreyle %20 paraformaldehit (PFA) ile sabitlendi, PBS ile durulandı, PBS içinde %10 keçi serumu ile 2 saat süreyle bloke edildi ve durulandı. Sabit hücreler, birincil antikorlarla 4 °C'de 14 saat süreyle inkübe edildi, yıkandı, etiketli izotipe özgü ikincil antikorlarla 1 saat süreyle inkübe edildi, yıkandı ve görselleştirme için 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile zıt boyama yapıldı. hücre çekirdekleri ve Leica DMIRB ters mikroskop (Leica, Houston, TX) veya bir Zeiss ApoTome Axiovert 200 M (Carl Zeiss Inc, Thornwood, NY) kullanılarak görüntülendi.

IHC için dokular gece boyunca %4 PFA içinde sabitlendi ve %70 etanol içinde saklandı. Parafine gömüldüler ve 5 μm'lik kesitler halinde kesildiler. Deparafinizasyondan sonra, 6.0 dakika boyunca bir buharlayıcıda sodyum sitrat tamponu (pH 8.0) veya etilendiamintetraasetik asit (EDTA) tamponu (pH 20) ile antijen geri kazanımı gerçekleştirildi. Endojen peroksidazlar, %15 H içinde 3 dakika inkübasyon yoluyla bloke edildi.₂O₂. Kesitler, ImmPRESS peroksidaz boyama kitleri ve 30'-diaminobenzidin substratları (Vector Laboratories) ile oda sıcaklığında 3,3 dakika inkübe edildi. Kesitler hematoksilin ile karşıt boyandı. Kullanılan antikorlar Ek Tabloda listelenmiştir. 1.

Genetik çalışmalar için hücre popülasyonlarının saflaştırılması, çeşitli analizler için önemliydi. İzole edilen alt popülasyonların saflığı, hücrelerin izolasyonu için stratejilerin bir kombinasyonu tarafından belirlendi. Yetişkin hepatositleri, standart kollajenaz sindirimi ve percoll fraksiyonasyonu ile yenidoğan, pediatrik ve yetişkin insan karaciğerlerine karşı yenidoğan domuz karaciğerlerinden yeni izole edilmiştir.⁸⁰. İzole edilmiş yetişkin hepatosit fraksiyonları (ortalama çapları 17 um'nin üzerinde olanlar), hücrelerin izolasyonunda kullanılan enzimleri etkisiz hale getirmek için %1640 serumla desteklenmiş RPMI2 içinde durulandı; daha sonra serumsuz RPMI 1640 ortamı ile çok sayıda durulama işlemi uygulandı; ve son olarak, sıvı nitrojen kullanarak dondurun. Hücreler kültürlenmedi.

Hem insan hem de domuz olan kök/progenitörlerin alt popülasyonları, fetal veya neonatal safra ağacından (safra ağacı kök hücreleri), fetal veya neonatal karaciğerlerden (hepatik kök hücreler ve hepatoblastlar) veya fetal veya neonatalden yeni izole edilmiş hücrelerden hazırlandı. pankreaslar (pankreas kök hücreleri ve duktal progenitörler); yüzey antijenleri için bir immüno-seçim kombinasyonu ile saflaştırılmış, ayrı hücresel alt-popülasyonların izolasyonunu sağlar^39,41,50,54. Ek Tablo 5 özellikle geçmiş çalışmalarda kapsamlı bir şekilde karakterize edilen alt popülasyonların belirteçlerini özetler^{31,32,33,38,39,40,41,42,43,49,50}.

İmmün seçili hücreler, serumsuz Kubota's Medium içinde süspanse edildi⁸¹, endodermal kök hücreler için tasarlanmış ve organoidlerin oluşumunu sağlayan 6-12 saat boyunca düşük bağlanma kültür tabaklarına ekilmiştir. Bu 6-12 saat içinde oluşan organoidler, erken soy evresi mezenkimal hücrelerle ortak olan endodermal kök hücrelerden oluşuyordu: anjiyoblastlar ve endotelyal ve yıldızsı hücrelerin öncüleri (not: olgun mezenkimal hücreler, tükenme ile belirtildiği gibi immün seçim işlemiyle en aza indirildi. olgun hemopoietik ve mezenkimal hücreler için yüzey antijenleri için hücreler).

RNA dizilimi ve gen ekspresyonu analizi, domuz (veya insan) yetişkin karaciğeri, pankreas, safra kesesi ve safra ağacı dokusundan ve hepatositlerin (AHeps), hepatik kök hücrelerin (HpSC'ler) izole hücre süspansiyonlarından Qiagen RNeasy Kit kullanılarak saflaştırılmış RNA'yı içermiştir. safra ağacı kök hücreleri (BTSC'ler), her biri insan hücreleri için üç farklı donörden ve domuz hücreleri için beş farklı donörden (Ek Tablolar) 6 ve 7). RNA-seq veri toplama ve kalite kontrol analizleri, önceki çalışmamızda özel olarak tasvir edilmiştir.⁵². LIMMA (sürüm 3.50.1) boru hattı, diferansiyel olarak ifade edilen genleri (DEG'ler) tanımlamak için kullanıldı. Gen ekspresyon profilleri, Pearson ve Spearman'ın korelasyon analizleri kullanılarak karşılaştırıldı. Temel bileşen analizi (PCA) ve hiyerarşik kümeleme, R'de (R sürüm 4.1.0) gerçekleştirildi.

Kantitatif ters transkripsiyon ve polimeraz zincir reaksiyonu, hücrelerden alınan toplam RNA kullanılarak yapıldı. Toplam RNA, Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) kullanılarak hücrelerden ekstre edildi. Prime script kullanılarak sentezlenen birinci iplikçik cDNA 1. iplikçik cDNA sentez kiti (Takara, Otsu, Japonya), PCR amplifikasyonu için bir şablon olarak kullanıldı. ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA) ile Faststart Universal Probe Master (R oche Diagnostics, Mannheim, Almanya) kullanılarak mRNA seviyelerinin kantitatif analizleri yapıldı. Primerler, Universal Probe Library Tahlil Tasarım Merkezi (Roche Applied Science) ile tasarlanmıştır. Astar dizileri Ek Tabloda listelenmiştir. 4a. Primerler 50 °C'de 2 dakika ve 95 °C'de 10 dakika tavlandı, ardından 40 döngü 95 °C (15 s) ve 60 °C'de (1 dakika) tavlandı. Gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz (GAPDH) ifadesi genellikle bir standart olarak kullanılmıştır.

istatistiksel analiz

Numuneler arasındaki istatistiksel olarak anlamlı farklar, Student 2 kuyruklu kullanılarak hesaplanır. t-test ve sonuçlar ortalama ± SD olarak sunulur. P <0.05 değerleri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Raporlama özeti

Araştırma tasarımı hakkında daha fazla bilgi Doğa Portföyü Raporlama Özeti bu makaleye bağlantılı.

• SEO Destekli İçerik ve Halkla İlişkiler Dağıtımı. Bugün Gücünüzü Artırın.
• PlatoData.Network Dikey Üretken Yapay Zeka. Kendine güç ver. Buradan Erişin.
• PlatoAiStream. Web3 Zekası. Bilgi Genişletildi. Buradan Erişin.
• PlatoESG. Otomotiv / EV'ler, karbon, temiz teknoloji, Enerji, Çevre, Güneş, Atık Yönetimi. Buradan Erişin.
• Blok Ofsetleri. Çevre Dengeleme Sahipliğini Modernleştirme. Buradan Erişin.
• Kaynak: https://www.nature.com/articles/s41536-023-00303-5