Peptidlerin, oligonükleotidlerin ve peptit-oligonükleotit konjugatlarının sentezi ve karakterizasyonu

Tüm peptitler ve oligonükleotitler, sırasıyla CPC Scientific ve Integrated DNA Technologies (IDT) tarafından sentezlendi ve HPLC saflaştırıldı. Peptid-oligonükleotit konjugatları, bakır içermeyen tıklama kimyası ile üretildi. Konjugatlar, bir Agilent 1100 HPLC üzerinde saflaştırıldı. Konjugatların kütle spektral analizi, Bruker model MicroFlex matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon – uçuş süresi spektrometresi üzerinde yapıldı. Kullanılan tüm moleküllerin dizileri Ek Tablolarda listelenmiştir. 1 ve 3.

Cas12a floresan bölünme deneyi

libreCas12a (nihai konsantrasyon, 100 nM; New England Biolabs (NEB)) 1x NEB Tampon 2.1, crRNA (250 nM; IDT) ve tamamlayıcı DNA aktivatörleri (özel olarak tarif edilmedikçe 4 nM, çözelti içinde veya idrarda eklenmemiş; IDT; IDT) ile inkübe edildi. ) veya deney hayvanlarından toplanan idrar numuneleri, 50 °C'de 37 dakika boyunca 30 ul'lik bir reaksiyonda. Reaksiyonlar, 4 kat seyreltilerek 1 x NEB Tampon 2.1 ve ssDNA T'ye seyreltildi₁₀ FQ raportör substratı (30 pmol; IDT) oyuk başına 60 ul'lik bir reaksiyon hacmine koyun ve üç kopya halinde çalıştırın. libreCas12a aktivasyonu, bir Tecan Infinite Pro M37 plaka okuyucu (λ_ex = 485 nm, λ_em = 535 nm). Tüm oligonükleotitlerin dizileri Ek Tabloda listelenmiştir. 1. Negatif kontroller olarak arka plan koşulları için floresan (ya DNA aktivatör girişi yok ya da crRNA koşulları yok) kullanıldı. Cas12a ssDNase aktivitesi, plaka okuyucu tarafından oluşturulan kinetik eğrisinden hesaplandı (zamana karşı sentetik probun floresansı). İlk reaksiyon hızı (V₀) kinetik eğrinin lineer fazının eğimine karşılık gelir (8-10 başlangıç ​​zaman noktası). Analiz Python v.3.9'da yapılmıştır.

Yanal akış okumalı Cas12a bölünme testi

Numuneler, yukarıda açıklanan Cas30a aktivasyon tahlilinde olduğu gibi 37 °C'de 12 dakika süreyle inkübe edildi. Reaksiyonlar daha sonra 4 kat seyreltilerek 1 x NEB Tampon 2.1 ve ssDNA T'ye seyreltildi.₁₀ FAM-biyotin haberci substratı (1 pmol; IDT) 100 ul'lik bir reaksiyon hacmine dönüştürüldü ve 37 °C'de 1-3 saat inkübe edildi. HybriDetect 1 yanal akış şeritleri solüsyona (20 ul Milenia Hybridetect tamponu ile 80 ul numune) daldırıldı. Bantların yoğunluğu ImageJ v.1.49'da ölçülmüştür.

Cas12a ssDNase aktivitesi için DNA aktivatör konsantrasyonunun veya uzunluğunun karakterizasyonu

Cas12a ile saptama için en uygun uzunluğu belirlemek amacıyla, 10 ila 34 nt arasında kesik doğal ve değiştirilmiş DNA aktivatör uzunluklarını test ettik. İn vivo sağlamlığı belirlemek için, BALB/c farelerine 1 nmol'de farklı uzunluklarda fosforotioat ile modifiye edilmiş DNA aktivatörleri enjekte edildi ve enjeksiyondan 1 saat sonra idrar örnekleri toplandı. İdrar numuneleri, Cas12a flüoresan bölünme tahlilinde DNA aktivatörleri olarak kullanıldı. Her bir DNA aktivatörü tarafından tetiklenen Cas12a ssDNase aktivitesi, 24-mer modifiye edilmiş DNA aktivatörününkine normalleştirildi.

Fluidigm tespiti ve veri analizi

Cas12 algılama reaksiyonları, bir mikroakışkan Gen İfadesi (GE) 96.96 entegre akışkan devresine (IFC) (Fluidigm) yüklenmek üzere iki ayrı karışım, tahlil karışımı ve numune karışımı halinde yapıldı: tahlil karışımı 10 uM içeriyordu libreReaksiyon başına toplam 12 µl hacim için Cas1a (NEB), 1× Tahlil Yükleme Reaktifi (Fluidigm), 2.1× NEB Tampon 1 ve 16 μM crRNA. Numune karışımı 25.2 U RNase inhibitörü (NEB), 1× NEBuffer 2.1, 1× ROX Referans Boyası (Invitrogen), 1× GE Numune Yükleme Reaktifi (Fluidigm), 9 mM MgCl içermiştir.₂ ve 500 nM söndürülmüş sentetik floresan DNA raportör (FAM–T₁₀–3IABkFQ, IDT) toplam 12.6 μl hacim için. Şırınga ve 4 ul tahlil veya numune karışımları daha sonra bir mikroakışkan GE 96.96 IFC üzerindeki ilgili konumlarına yüklendi ve üreticinin talimatlarına göre çalıştırıldı. IFC, 'Load Mix' komut dosyasının çalıştırıldığı Juno'ya (Fluidigm) yüklendi. Uygun IFC yüklemesinden sonra görüntüler, Biomark HD'de özel bir protokol kullanılarak 3 saatlik bir süre boyunca toplandı.

Fluidigm sistemi tarafından üretilen verileri analiz etmek için, kılavuz-hedef çiftleri için referansla normalleştirilmiş arka plandan çıkarılmış floresan çizdik. Kılavuz-hedef çifti için (belirli bir zaman noktasında, t, ve hedef konsantrasyon), ilk olarak referans normalize edilmiş değeri şu şekilde hesapladık (medyan (P_t - P₀) / (R_t - R₀)) nerede P_t zaman noktasındaki kılavuz sinyaldir (FAM), P₀ reaksiyondan önceki arka plan ölçümüdür, R_t zaman noktasındaki referans sinyalidir (ROX), R₀ arka plan ölçümüdür ve medyan kopyalar arasında alınır. Veriler Python 3, R 4 ve Prism 9 kullanılarak görselleştirildi.

Rekombinant nanokorların klonlanması ve ifadesi

NcoI ve BlpI kısıtlama alanlarını çevreleyen ilgili nanobody'yi kodlayan çift sarmallı gBlocks gen fragmanları IDT'den sipariş edildi. Gen fragmanları, Ncol ve BlpI kısıtlama bölgelerinde Novogen pET-28a(+) ekspresyon vektörüne klonlandı ve SHuffle T7 yetkinliğine dönüştürüldü. Escherichia coli (NEB). Doğru gen eklerini kodlayan bakteri kolonileri, Sanger dizilimi ile doğrulandı. Müteakip rekombinant protein üretimi için, 500 ml'lik bir SHuffle T7 ikincil kültürü yetkin E. coli. ilgilenilen nanobody geninin kodlanması, 37 nm'de (OD3) optik yoğunluk yaklaşık 600-600'e ulaşana kadar bir gecelik 0.6 ml birincil kültürden 0.8 °C'de kanamisin takviyeli LB sıvısında büyütüldü. Nanobody ekspresyonu daha sonra izopropil β- ilavesiyle indüklendi.d-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG) (0.4 mM nihai konsantrasyon). Kültür 27 °C'de 24 saat inkübe edildi. Bakteri peleti, B-PER tam bakteri protein ekstraksiyon reaktifi (Thermo Fisher Scientific) ile parçalandı, ardından standart immobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) ile Ni-NTA agaroz (Qiagen) ile saflaştırıldı. Nanobody ürünü, SDS-poliakrilamid jel elektroforez analizi ile doğrulandı. Bu çalışmada kullanılan nanokorların dizileri Ek Tabloda listelenmiştir. 3.

Bir nanobody çekirdekli DNA kodlu sentetik idrar biyobelirteç sentezi

Nanobody (2 mg), önceden kurulmuş bir protokolü izleyerek C-terminal sisteinini seçici olarak azaltmak için Pierce immobilize edilmiş TCEP disülfit indirgeme jeli (%7.5 v/v) (Thermo Fisher Scientific) içinde oda sıcaklığında gece boyunca inkübe edildi³⁷. İndirgenmiş C-terminal sistein (1 eşdeğ.), oda sıcaklığında 4 saat PBS (pH 6.5, 1 mM EDTA) içinde sülfo DBCO-maleimid çapraz bağlayıcı (6 eşdeğ.) (Click Chemistry Tools) ile reaksiyona sokuldu, ardından fazla çapraz bağlayıcı tek kullanımlık bir PD-10 tuzdan arındırma kolonu (GE Healthcare Bio-Sciences) ile çıkarıldı. DBCO işlevli nanobody, ÄKTA hızlı protein sıvı kromatografisi (GE Healthcare) ile daha da rafine edildi. DNA raportör konjügasyonu, DBCO işlevli nanobody (1 eşdeğer) ile azid işlevli DNA raportör (1.1 eşdeğer) ile PBS (pH 7.4) içinde oda sıcaklığında 24 saat inkübe edilerek gerçekleştirildi. Fazla DNA raportörü, boyut dışlama kromatografisi yoluyla çıkarıldı. Ürün, SDS-poliakrilamid jel elektroforez analizi ile doğrulandı ve Quant-iT OliGreen ssDNA Test Kiti ile miktarı belirlendi. Bu çalışmada kullanılan DNA barkodlu sentetik idrar biyobelirteçlerinin dizileri Ek Tabloda listelenmiştir. 4.

Polimerik çekirdekli DNA kodlu sentetik idrar biyobelirteçlerinin sentezi

Maleimid-reaktif tutamaçlar (JenKem Technology) içeren çok değerlikli PEG (40 kDa, sekiz kollu), 100 mM fosfat tamponunda (pH 7.0) çözüldü ve süzüldü (gözenek boyutu, 0.2 um). Filtrelemeden sonra, sisteinle sonlanan peptit-DNA konjugatları, PEG'e 2 kat molar fazlalıkta ilave edildi ve oda sıcaklığında en az 4 saat reaksiyona sokuldu. Konjuge olmayan moleküller, bir ÄKTA hızlı protein sıvı kromatografisi (GE Healthcare) üzerinde bir Superdex 200 Artış 10/300 GL kolonu ile boyut dışlama kromatografisi kullanılarak ayrıldı. Saflaştırılan nanosensörler döndürmeli filtreler (moleküler ağırlık sınırı, 10 kDa; Millipore) ile konsantre edildi ve bir Quant-iT OliGreen ssDNA Tahlil Kiti (Thermo Fisher Scientific) ile ölçüldü. Floresan, bir Tecan Infinite Pro M200 Quant-iT plaka okuyucuda şu saatte okundu: λ_ex = 485 nm, λ_em = 535 nm. Parçacıklar, PBS içinde 4 °C'de saklandı. Nanopartiküllerin hidrodinamik çapını karakterize etmek için dinamik ışık saçılımı (Zeta Sizer Nanoseries, Malvern Instruments) kullanıldı. DNA barkodlu sentetik idrar biyobelirteçlerinin dizileri Ek Tabloda listelenmiştir. 4.

Kriyojenik transmisyon elektron mikroskobu

5-pleks polimerik çekirdek bazlı DNA-SUB'lar havuzlandı ve 0.5 mg ml-'ye konsantre edildi^-1 DNA konsantrasyonu ile. Numuneler, sürekli bir karbon filmi ile kaplanmış dantelli bir bakır ızgaraya yüklendi. Izgara daha sonra transmisyon elektron mikroskobu kolonuna yerleştirilmiş bir Gatan 626 tek eğimli kriyo tutucuya monte edildi. Numuneler sıvı nitrojen ile soğutuldu ve mikroskoba transfer sırasında soğuk tutuldu (2100 kV'da JEOL 200 FEG mikroskop seti; büyütme, 10,000–60,000). Tüm görüntüler bir Gatan 2kx2k UltraScan şarj bağlantılı cihaz kamerası kullanılarak kaydedildi.

Transkriptomik ve proteomik analiz

İnsan kolon adenokarsinomunun RNA-Seq verileri, Cancer Genome Atlas Research Network (http://cancergenome.nih.gov). DESeq2 1.10.1 ile diferansiyel ekspresyon analizleri yapıldı. İnsan kolon kanserlerinde ve normal kolon dokularında hücre dışı matrisin bileşimine ilişkin proteomik veriler, hücre dışı matris bileşenlerinin kütle spektrometresi analizi ile elde edildi ve Matrisome'den temin edilebilir (http://matrisomeproject.mit.edu/).

Hücre kültürü

Fare hücre hattı MC26-LucF (Kenneth K. Tanabe Laboratuvarı, Massachusetts General Hospital'dan ateşböceği lusiferazı taşıyan), %10 (h/h) fetal sığır serumu (Gibco), %1 ( v/v) penisilin/streptomisin (CellGro) 37 °C'de ve %5 CO₂. İnsan hücre çizgileri PC-3 (ATCC CRL-1435), %1640 (h/h) fetal sığır serumu ve %10 (h/h) penisilin/streptomisin ile desteklenmiş RPMI1'ta (Gibco) büyütüldü. RWPE1 (ATCC CRL-11609) hücreleri, 2.5 ug insan rekombinant epidermal büyüme faktörü ve 25 mg sığır hipofiz özütü eklenmiş keratinosit serumsuz ortamda (Gibco) kültürlendi. Tüm hücre çizgileri, mikoplazma kontaminasyonu açısından negatif olarak test edildi.

Hayvan modelleri

Tüm hayvan çalışmaları, Massachusetts Institute of Technology (MIT) hayvan bakımı komitesi tarafından onaylandı (MIT protokolleri 0420-023-23 ve 0220-010-23). Tüm deneyler, kurumsal ve ulusal yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi ve MIT personelinin Karşılaştırmalı Tıp Bölümü (DCM) tarafından denetlendi.

Kadın BALB/c (BALB/cAnNTac, 6–8 haftalık; Taconic Biosciences), çıplak kadın NCr (CrTac:NCr-Foxn1)^nu, 4-5 haftalık, Taconic Biosciences) ve kadın ve erkek Kras^LSL−G12D/+;Trp53^{fl / fl} Deneyler için C57L/B6 (KP) fareleri (8-16 haftalık; Tyler Jacks Laboratuvarı, MIT'den hediye) kullanıldı. Fareler, Koch Kanser Enstitüsü hayvan tesisinde, 12 saat aydınlık/12 saat karanlık döngüsüyle (07:00–19:00), ~18–23 °C'de ve ~%50 nemde tutuldu. Otoklavlanmış su ve standart yem diyeti her zaman erişilebilir durumdaydı. NCr çıplak fareler, sadece immün yetmezliği olan odalarda, otoklavlanmış kafeslerde ve kağıt yataklarda barındırıldı ve steril tekniklerle işlendi. Farelerin sağlık durumu, tümörlerin çapı >5 mm olduğunda haftalık ve günlük olarak kontrol edildi. Fareler, veterinerlerin kriterlerine göre ötenazi edildi (örneğin, tümör boyutu > 1 cm, kötü vücut koşulları). Grup başına en az üç fareden oluşan bir örneklem büyüklüğü kullandık. Üriner barkod seviyeleri (iki taraflı) karşılaştırıldığında grup boyutu beşten büyük veya beşe eşittir t-test, α 0.05 olarak ayarlandı). Aynı cinsiyetten yavrular rastgele olarak deney ve kontrol gruplarına ayrıldı.

CRC akciğer tümörlerini oluşturmak için BALB/c dişi fareler, lusiferaz ifade eden MC26-Fluc hücre hattı (fare başına 100,000 hücre) ile intravenöz enjeksiyonla aşılandı. Tümör ilerlemesi, bir IVIS görüntüleme sistemi (PerkinElmer) kullanılarak haftalık olarak izlendi ve Canlı Görüntü (PerkinElmer) üzerinde ölçüldü. PCa ksenogreft modelini oluşturmak için, NCr çıplak dişi fareler, izofluran anestezisi altındayken insan PC-3 hücre çizgileri (yan başına 5 milyon hücre, fare başına 2 yan) ile aşılanmıştır. Hücreler, %30 Corning Matrigel Membrane Matrix (Thermo Fisher Scientific) ve düşük serum ortamında (Opti-MEM, Gibco) hazırlandı. Tümörler haftalık olarak ölçüldü ve yan tümörler yaklaşık 5 mm uzunluk veya genişliğe (~200 mm) ulaştığında deneyler yapıldı.³) veya aşılamadan 3 hafta sonra. Tümör hacmi, yan kısmın uzunluk ve genişliğinin kaliper ölçümü ile hesaplandı; hacim hesaplaması denklemi takip etti f_x = (genişlik² × uzunluk)/2, burada uzunluk daha uzun segmenttir.

Otokton akciğer tümörlerini indüklemek için önce ürettik Kras^LSL−G12D/+;Trp53^{fl / fl} C57L/B6 (KP) fareler^42,43 bir onkojenik alelin aktivasyonunun olduğu KRAS tümörgenez sürecini başlatmak için yeterlidir ve ek silme veya nokta mutasyonu trp53 tümörün ilerlemesini önemli ölçüde artırır ve daha ileri bir hastalığın özelliklerine sahip olan adenokarsinomların daha hızlı gelişmesine yol açar. Akciğer tümörleri, 50 ul adenovirüs-SPC-Cre'nin (2.5 x 10) intratrakeal uygulamasıyla başlatıldı.⁸ izofluran anestezisi altında 10 ila 8 haftalık dişi veya erkek KP farelerinde 16 mM kalsiyum klorür içeren Opti-MEM'de plak oluşturan birimler. Kontrol kohortları, aynı zamanda intratrakeal AdenoCre uygulaması uygulanan yaş ve cinsiyet uyumlu farelerden oluşuyordu. KP fareleri, deneyler yapılana kadar tümör büyümesine izin vermek için daha fazla müdahale edilmeden tutuldu.

Üriner DNA barkodu ile aktive edilen Cas12a bölünme testinin analizi

ssDNA'lar (1 nmol), 5-pleks DNA barkodlu PEG sensörleri (her biri 0.2 nmol, toplamda DNA barkod konsantrasyonuna göre 1 nmol) veya DNA barkodlu nanobody sensörleri (DNA barkod konsantrasyonuna göre 1 nmol) deneysel farelere intravenöz olarak enjekte edildi. İdrar numuneleri (fare başına 100-200 ul), DNA veya sensör enjeksiyonundan 12 saat sonra her gün saat 00:1'de toplandı ve ilk reaksiyon hızını belirlemek için Cas12a aktivasyonu açısından test edildi (V₀). Ortalama normalizasyon gerçekleştirildi V₀ idrar konsantrasyonundaki hayvandan hayvana değişimi hesaba katan değerler. Bir flüoresan raportör kullanan Cas12a bölünme tahlilinde, y eksen normalleştirilmiş ortalamayı temsil eder V_{0_tümör taşıyan hayvanlar}/ortalama normalleştirilmiş V_{0_kontrol hayvanları}. Aynı idrar numunesi daha sonra LFA okuması ile Cas12a bölünme tahlilini gerçekleştirmek için kullanıldı. Ortaya çıkan kağıt şeritler aynı anda hizalandı ve tarandı. Bant yoğunluğu, ImageJ v.1.49v ile ölçüldü.

Biyodağılım ve farmakokinetik çalışmaları

İn vivo olarak otofloresan arka plandan kaynaklanan girişimi en aza indirmek için yakın kızılötesi boya etiketli maddeler kullanıldı. BALB/c farelerine intravenöz olarak Cy5-işaretli değiştirilmiş veya doğal DNA molekülleri (1 nmol) enjekte edildi ve enjeksiyondan 30 dakika ve 1, 2, 3, 4 saat sonra idrar numuneleri toplandı. Nanobody-DNA konjugatları, sülfo-Cyanine7 NHS ester (Lumiprobe, 2 boya eşdeğeri protein) ile birleştirildi, gece boyunca reaksiyona sokuldu, spin filtrasyonu ile saflaştırıldı ve PC-3 tümör taşıyan çıplak farelere intravenöz olarak enjekte edildi. 24 saat sonra farelere ötenazi uygulandı ve tümörleri, akciğerleri, kalbi, böbrekleri, karaciğeri ve dalağı çıkarmak için otopsi yapıldı. İdrar, kan ve organlar IVIS ve Odyssey CLx görüntüleme sistemleri (LI-COR) kullanılarak tarandı. Organ floresansı, Odyssey CLx'te ImageStudio ile ölçüldü. Kan dolaşım kinetiği, fare başına 10 nmol boyada Cy30-işaretli DNA veya PEG'nin intravenöz enjeksiyonundan 2 dakika, 3 dakika, 5 saat ve 1 saat sonra seri kan alımları ile BALB/c farelerinde izlendi. Farmakokinetik ölçümleri için kan, kuyruk boş kanamaları kullanılarak toplandı. Kan, pıhtılaşmayı önlemek için 5 mM EDTA ile PBS içinde seyreltildi, 5 dakika 5,000°C'de santrifüjlendi.gve floresan raportör konsantrasyonu, Odyssey CLx üzerindeki standartlara göre 384 oyuklu plakalarda ölçüldü.

Histoloji, immünohistokimya ve immünofloresan çalışmaları

Parafine gömülmüş dokular gece boyunca %4 paraformaldehit içinde muhafaza edildi ve parafine gömülmeden önce %70 etanol içinde saklandı. Ani donmuş dokular, %2 paraformaldehit içinde 2 saat süreyle muhafaza edildi, gece boyunca %30 sükroz içinde saklandı ve -80 °C'de optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğinde donduruldu. Ani donmuş akciğerler, hayvana aşırı doz izofluran ile ötenazi uygulandıktan hemen sonra PBS içinde 50:50 OCT'nin intratrakeal enjeksiyonu yoluyla işlendi. Akciğerler, bir izopentan/sıvı nitrojen banyosuna OCT gömülerek yavaşça donduruldu. Numuneler 6 um'lik dilimler halinde kesildi. İmmünohistokimya çalışmaları için slaytlar, üreticinin talimatlarına uygun olarak birincil antikorlarla boyandı, ardından alındığı gibi kullanılan bir Tavşan-on-Kemirgen HRP-Polimeri (Biocare Medical) geldi. İmmünofloresan çalışmaları için, PBS'de %5 keçi serumu, %2 BSA ve %0.1 Triton X-100 ile 1 saat süreyle bloke edildikten sonra, kesitler bir gece boyunca 1 °C'de PBS içinde %4 BSA içinde bir birincil antikorla boyandı. Alexa Fluor konjuge sekonder antikorlar, 1 μg ml-'de inkübe edildi^-1 oda sıcaklığında 1 dakika PBS içinde %30 BSA içinde. Slaytlar, ProLong Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific) ile kapatıldı ve bir 3D Histech P250 yüksek kapasiteli lam tarayıcı (PerkinElmer) kullanılarak sayısallaştırıldı ve analiz edildi. Histolojik toksisite, tedavi gruplarına kör olan bir veteriner patoloğu tarafından değerlendirildi. Kullanılan birincil antikorlar ve dilüsyonlar Ek Tabloda listelenmiştir. 5.

RNA ekstraksiyonu ve gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu

PC-3 ve RWPE1 hücreleri, tripsinizasyondan sonra kültürlendi ve toplandı. Doku örnekleri, farelere ötenazi uygulandıktan sonra otopsi ile toplandı ve hemen RNAlater RNA Stabilizasyon Reaktifinde (Qiagen) tutuldu. Hücre peletlerinden veya dondurularak öğütülmüş doku örneklerinden alınan RNA, bir RNeasy Mini Kit (Qiagen) kullanılarak özümlendi. RNA, bir Bio-Rad iCycler üzerinde Bio-Rad iScript Reverse Transkripsiyon Supermix kullanılarak cDNA'ya ters kopyalandı. cDNA'nın kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu amplifikasyonu, üreticinin talimatlarına göre Taqman gen ekspresyon probları ve Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) ile karıştırıldıktan sonra ölçüldü. Kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu, bir Bio-Rad CFX96 Real Time System C1000 Thermal Cycler üzerinde gerçekleştirildi.

Rekombinant proteaz substratı ve doku lizatı proteolitik bölünme deneyleri

Floresan (FAM) ve söndürücü (CPQ2) içeren florojenik proteaz substratları, CPC Scientific tarafından sentezlendi. Rekombinant proteazlar, Enzo Life Sciences ve R&D Systems'den satın alınmıştır. Doku örnekleri PBS içinde homojenleştirildi ve 4 °C'de 5 dakika 6,000'de santrifüjlendi.g. Süpernatan 14,000'de tekrar santrifüjlendig 25 °C'de 4 dakika. Protein konsantrasyonu, bir Thermo Fisher BCA Protein Tahlil Kiti kullanılarak ölçüldü ve 2 mg ml-'de hazırlandı.^-1. Testler, peptitler (384 uM) ve proteazlar (rekombinant proteaz tahlili için 1 nM)/hücre lizatları (40 mg ml-) ile enzime özgü tampon içinde üç kopya halinde 0.33 oyuklu plakalarda gerçekleştirildi.^-1 doku lizat deneyi için) 30 µl'de 37 °C'de. Floresans şu saatte ölçüldü: λ_ex = 485 nm, λ_em = Tecan Infinite 535pro mikroplaka okuyucuda 200 nm. Enzimler ve tampon koşulları Ek Tabloda listelenmiştir. 6.

PSA enzim bağlantılı immünosorbent deneyi

Deney hayvanlarının lateral safen damarından yaklaşık 200 µl kan toplandı ve kan hücreleri 14,000°C'de santrifüjleme ile hemen peletlendi.g 25 °C'de 4 dakika. Plazma, PSA ölçümünden önce -80 °C'de saklandı. PSA seviyeleri, üreticinin protokollerine (R&D Systems) göre PSA Quantikine ELISA kiti kullanılarak ölçüldü.

İstatistiksel analiz ve tekrar üretilebilirlik

İstatistiksel analizler GraphPad Prism 9'da gerçekleştirildi. Veriler sem ile ortalama olarak gösterildi. Gruplar arasındaki farklar, uygun olduğunda çoklu hipotez testi için düzeltme ile parametrik ve parametrik olmayan grup karşılaştırmaları kullanılarak değerlendirildi. Spesifik olarak, veri grupları ilk önce Kolmogorov-Smirnov normallik testi ile Dallal-Wilkinson-Lillie testi ile normallik açısından test edildi. P değer. Sonuçlar daha sonra eşleştirilmemiş iki kuyruklu ile istatistiksel anlamlılık açısından test edildi. t-iki grup karşılaştırmaları için test (parametrik) ve çoklu grup karşılaştırmaları için varyans analizi. Parametrik olmayan analizler, eşleştirilmemiş iki kuyruklu Mann-Whitney testi ile yapıldı. Örnek büyüklükleri ve istatistiksel testler şekil açıklamalarında belirtilmiştir. Tüm deneyler, benzer sonuçlarla bağımsız olarak en az iki kez tekrarlandı. Temsili deneylerin sonuçları (histolojik veya flüoresan mikrograflar gibi) gösterildiğinde deneylerin iki bağımsız araştırmacı tarafından tekrarlandığını ve görselleştirildiğini unutmayın.

Raporlama özeti

Araştırma tasarımı hakkında daha fazla bilgi Doğa Portföyü Raporlama Özeti bu makaleye bağlantılı.

• SEO Destekli İçerik ve Halkla İlişkiler Dağıtımı. Bugün Gücünüzü Artırın.
• Plato blok zinciri. Web3 Metaverse Zekası. Bilgi Güçlendirildi. Buradan Erişin.
• Adryenn Ashley ile Geleceği Basmak. Buradan Erişin.
• Kaynak: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01372-9