การสร้างและจำแนกลักษณะของ hiPSCs และ hiPSC-CMs เฉพาะผู้ป่วย

สาย hiPSC ถูกสร้างขึ้นจากผู้ป่วย TOF-DG สองราย ผู้ป่วย TOF-ND สองราย และการควบคุมสุขภาพสองรายการพร้อมเครื่องหมาย pluripotency และเครื่องหมายชั้นจมูกที่ตรวจสอบแล้ว (มะเดื่อเสริม 1 และ 2). การจัดลำดับจีโนมทั้งหมดได้รับการยืนยันตามลำดับการมีอยู่และไม่มีการลบ 22q11.2 ในสาย hiPSC จากผู้ป่วย TOF-DG และ TOF-ND (รูปที่ XNUMX เพิ่มเติม) 3). ไม่พบการกลายพันธุ์ที่ผิดพลาดหรือไร้สาระของยีนที่เกี่ยวข้องกับ CHD ที่รายงานก่อนหน้านี้จากสาย hiPSC ใด ๆ การแยกความแตกต่างของหัวใจทำได้สำเร็จโดย APLNR⁺ โปรโตคอลการคัดแยกที่พัฒนาโดยห้องปฏิบัติการของเรา³². สาย hiPSC ทั้งหมดแสดงประสิทธิภาพการแยกความแตกต่างที่น่าพอใจด้วยเซลล์ TNNT70+ มากกว่า 2% ในวันที่ 12 หลังการแยกความแตกต่าง hiPSC-CM ถูกสร้างขึ้นใน hCAS และปล่อยให้สุกต่อไปอีก 10 วันก่อนการประเมินการถอดเสียงและการทำงาน

TOF-DG เฉพาะผู้ป่วย hiPSC-CMs แสดงข้อกำหนดกระเป๋าหน้าท้องที่มีข้อบกพร่อง

ก่อนอื่นเราได้พิจารณาโปรไฟล์การถอดเสียงของ hiPSC-CM ที่แตกต่างจากผู้ป่วยและการควบคุมโดย scRNA-seq โดยใช้แพลตฟอร์ม 10X Genomics การรวมกลุ่มของเซลล์ 21,965 เซลล์โดยใช้การประมาณค่าท่อร่วมหลายเท่าและการฉายภาพ (UMP) ระบุกระจุกซูรัตที่แตกต่างกัน 7 กลุ่ม (รูปที่ 1A). กลุ่ม Seurat A0, A1, A2, A5 แสดงระดับยีนหัวใจที่ค่อนข้างสูงรวมทั้ง เอ็นเคเอ็กซ์2-5, ไมโอซินสายเบา/หนัก และโทรโปนิน (รูปที่. 1B) ซึ่งระบุกลุ่มเหล่านี้เป็นคาร์ดิโอไมโอไซต์ คลัสเตอร์ A5 ยังแสดงยีนไมโทติสในระดับที่สูงขึ้นด้วย ซึ่งบ่งบอกถึงลักษณะการเพิ่มจำนวนของเซลล์คาร์ดิโอไมโอไซต์ กลุ่ม A3 และ A4 แสดงระดับยีนหัวใจค่อนข้างต่ำ (เอ็นเคเอ็กซ์2-5, ทีเอ็นที2) แต่เสริมสมรรถนะในการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงเมทริกซ์นอกเซลล์ (ECM) (รูปที่. 1B) โปรไฟล์ที่เข้ากันได้กับไฟโบรบลาสต์หัวใจ คลัสเตอร์ A6 และ A7 ถูกกำหนดโดยเชื้อสายเอ็นโดเดอร์มัล (เอเอฟพี, APOA1, APOA2) และบุผนังหลอดเลือด (FLT1, ESAM, PLVAP) เครื่องหมาย ตามลำดับ (รูปที่. 1B). ดังนั้น ในบรรดาเซลล์ที่เรียงลำดับ ส่วนใหญ่เป็นคาร์ดิโอไมโอไซต์ (86%) บางส่วนเป็นไฟโบรบลาสต์ของหัวใจ (10%) และมีเพียงไม่กี่เซลล์ที่เป็นเอนโดเดอร์มอล (<1%) และอนุพันธ์ของเอนโดธีเลียม (<1%)

A การนำเสนอ UMAP ของเซลล์ทุกประเภทที่ระบุใน hCAS (TOF-DG, TOF-ND และส่วนควบคุม) การระบายสี: กลุ่ม Seurat; เส้นประ: cardiomyocytes; สีเทาอ่อน: ไม่ใช่ไมโอไซต์ B แผนไวโอลินของการแสดงออกของยีนของคาร์ดิโอไมโอไซต์ เซลล์ไมโทติค และเซลล์ที่ไม่ใช่มัยโอไซต์: ไฟโบรบลาสต์ของหัวใจ อนุพันธ์ของเอ็นโดเดอร์มอล และเซลล์บุผนังหลอดเลือด การระบายสี: กลุ่มเซลล์ Seurat ดังใน (A). C การนำเสนอ UMAP ของ hiPSC-CM ทั้งหมดที่ระบุใน hCAS (TOF-DG, TOF-ND และการควบคุม) ข้อมูลถูกระบายสีโดยกลุ่ม Seurat (แผงด้านซ้าย) และเส้นเซลล์ (แผงด้านขวา) ตามลำดับ D แผนโดนัทขององค์ประกอบในแต่ละคลัสเตอร์ Seurat (แผงด้านซ้าย) และเส้นเซลล์ (แผงด้านขวา) ตามลำดับ ข้อมูลคำนวณจาก hiPSC-CM เท่านั้น E การนำเสนอแผนที่ความร้อนของยีนที่ได้รับการควบคุม 10 อันดับแรกที่แสดงในแต่ละคลัสเตอร์ hiPSC-CMs-Seurat ข้อมูลถูกจัดกลุ่มตามคลัสเตอร์ Seurat (แผงด้านซ้าย) และเส้นเซลล์ (แผงด้านขวา) ตามลำดับ

ภาพขนาดเต็ม

ด้วยการมุ่งเน้นไปที่การตรวจสอบทรานสคริปต์โตมของหัวใจ เราได้แยก hiPSC-CMs (คลัสเตอร์ A0, A1, A2, A5) และดำเนินการจัดกลุ่มโดยใช้ UMAP (รูปที่. 1C). กระจุก Seurat ใหม่ (B0, B1, B2, B3) ถูกระบุ (รูปที่ 1C). hiPSC-CM ที่ได้มาจากผู้ป่วยและกลุ่มควบคุมมีการกระจายอย่างไม่สม่ำเสมอระหว่างกระจุก (รูปที่ 1D). คลัสเตอร์ B0 ประกอบด้วย hiPSC-CMs เกือบเฉพาะ (98%) ที่ได้มาจากผู้ป่วย TOF-DG คลัสเตอร์ B1 ประกอบด้วยเซลล์ส่วนใหญ่มาจากกลุ่มควบคุมและเซลล์ที่เหลือจากผู้ป่วย TOF-DG ในขณะที่คลัสเตอร์ B2 และ B3 ประกอบด้วย hiPSC-CM มาจากผู้ป่วย TOF-ND และกลุ่มควบคุม

พบว่าคลัสเตอร์ B0 มีการแสดงออกของยีนที่ไม่ใช่ไมโอไซต์ที่ถูกควบคุม โดยมียีนที่ได้รับการควบคุมสูงสุด 4 ใน 10 ยีนที่ไม่ค่อยพบ (<1%) ในกลุ่มอื่น (รูปที่. 1E). ยีนที่ไม่ใช่ไมโอไซต์เหล่านี้ไม่เกี่ยวข้องกับเอ็นโดเดอร์มอลหรือบุผนังหลอดเลือด การไม่มีการเพิ่มคุณค่าของยีนที่เกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงเมทริกซ์นอกเซลล์ยังทำให้เซลล์ B0 คลัสเตอร์แตกต่างจากไฟโบรบลาสต์ของหัวใจ คลัสเตอร์ B1 ได้รับการเสริมสมรรถนะใน ไออาร์เอ็กซ์ ตระกูลยีน (IRX1, IRX2, IRX3) ในขณะที่คลัสเตอร์ B2 ถูกทำเครื่องหมายโดย LBH การแสดงออก (รูปที่ 1E). ออโธโลจีของ ไออาร์เอ็กซ์ ยีนและ LBH มีรายงานว่ามีการแสดงออกในช่วงต้นของ cardiomyocytes ของ murine ที่มีความแตกต่างในร่างกาย^33,34. คลัสเตอร์ B2 เมื่อเปรียบเทียบกับคลัสเตอร์ B1 มีการควบคุมการแสดงออกของเครื่องหมายคาร์ดิโอไมโอไซต์ในกระเป๋าหน้าท้อง (MYH7, NPPB). กลุ่ม B3 แสดงการแสดงออกที่สูงที่สุดของตัวบ่งชี้คาร์ดิโอไมโอไซต์ที่มีกระเป๋าหน้าท้อง (มายแอล2) (รูปที่ 1E). การมีอยู่ของกลุ่ม B1, B2 และ B3 แนะนำข้อกำหนดแบบก้าวหน้าของ hiPSC-CMs ที่มีต่อโปรไฟล์การถอดเสียงของกระเป๋าหน้าท้อง

เพื่อตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงของการถอดเสียงเพิ่มเติมในระหว่างข้อมูลจำเพาะของกระเป๋าหน้าท้อง เราทำการวิเคราะห์ pseudotime บนคลัสเตอร์ B1, B2 และ B3 ขึ้นอยู่กับการเสริมแต่งใน ไออาร์เอ็กซ์ ตระกูลยีน คลัสเตอร์ B1 ถูกเลือกด้วยตนเองเป็นโหนดรูทสำหรับการวิเคราะห์เวลาเทียม (รูปที่. 2A). ตามวิถีโคจร TOF-DG-hiPSC-CMs ส่วนใหญ่จะกระจายในช่วงเริ่มต้น ในขณะที่ TOF-ND-hiPSC-CMs ส่วนใหญ่จะกระจายในช่วงกลางถึงปลาย Control-hiPSC-CMs สามารถพบได้ตลอดวิถี (รูปที่. 2A).

A การวิเคราะห์ Pseudotime ของ hCAS-hiPSC-CMs การประสานงาน UMAP และการแสดงออกของยีนของกลุ่ม B1, B2 และ B3 (รูปที่. 1C) ถูกประมาณไว้สำหรับการคำนวณ Monocle3 โหนดรูทแสดงด้วย ® วิถีถูกย้อมด้วยสีน้ำเงิน B โมดูลยีนทำหน้าที่เป็นฟังก์ชันของการวิเคราะห์เวลาเทียมและการอนุมานวิถีของ hCAS-hiPSC-CM C การเปลี่ยนแปลงของการแสดงออกของยีนตามวิถีโคจร morphogenesis ของกระเป๋าหน้าท้อง การหดตัวของกล้ามเนื้อ และการเปลี่ยนแปลง ECM เป็นคำศัพท์ GO ที่เสริมสมรรถนะในโมดูลยีน X-แกน: เวลาหลอก ; Y-axis: ระดับการแสดงออก เมทริกซ์นอกเซลล์ ECM D การวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่า GO ของคลัสเตอร์ B0 จาก hCAS-hiPSC-CMs มีการแสดงคำศัพท์ GO ที่ได้รับการเสริมสมรรถนะในยีนที่ควบคุม/ควบคุมจากคลัสเตอร์ B0 (เมื่อเปรียบเทียบกับคลัสเตอร์ B1/B2/B3) ค่า P ถูกปรับสำหรับการเปรียบเทียบหลายรายการของ Bonferroni E การวิเคราะห์ Regulon ของ hCAS-hiPSC-CMs หน่วยควบคุมสูงสุด (สูงสุด 10) ที่มีกิจกรรมสัมพัทธ์ที่สูงกว่าในแต่ละคลัสเตอร์ Seurat จะแสดงในแผนภาพดอทฮีทแมป F การแสดงออกของยีนของหน่วยงานควบคุมชั้นนำ (ระบุเป็น DEG) จากคลัสเตอร์ B0 การแสดงออกของยีนถูกแสดงไว้ในพล็อตเรื่องไวโอลิน

ภาพขนาดเต็ม

ยีนที่มีรูปแบบการแสดงออกคล้ายกันถูกจัดกลุ่มเป็นโมดูล (รูปที่. 2B) และอยู่ภายใต้การวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่าของ Gene Ontology (GO) พบคำศัพท์ GO ที่สำคัญในทั้งโมดูล 1 และ 2 (รูปที่ 2C). โมดูล 1 ซึ่งแสดงคะแนนการแสดงออกสูงตลอดวิถี ได้รับการเสริมด้วยยีนที่เกี่ยวข้องกับการสร้างรูปร่างของกระเป๋าหน้าท้อง (TNNI3, MYL2, MYH7) และการหดตัวของกล้ามเนื้อ (ACTC1, CSRP3, TCAP). โมดูล 2 ซึ่งแสดงคะแนนการแสดงออกที่ลดลงตามวิถีโคจร ได้รับการเสริมสมรรถนะด้วยยีนที่เกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงเมทริกซ์นอกเซลล์ (COL2A1, COL5A2, COL14A1) ไออาร์เอ็กซ์ ครอบครัวยีนและ LBH ยังได้รับมอบหมายให้อยู่ในโมดูลที่ 2 ซึ่งแสดงคะแนนการแสดงออกที่ลดลงตามวิถี

โดยสรุป การวิเคราะห์ pseudotime บน hiPSC-CM ที่ได้มาจากแพลตฟอร์ม hCAS ระบุข้อกำหนดกระเป๋าหน้าท้องแบบก้าวหน้าพร้อมการแสดงออกของยีนหัวใจที่เพิ่มขึ้น ส่วนควบคุมและ TOF-ND-hiPSC-CM สามารถเทียบเคียงได้ในข้อกำหนดขั้นสูงดังกล่าว อย่างไรก็ตาม TOF-DG-hiPSC-CM ส่วนใหญ่ยังคงรักษาโปรไฟล์การแสดงออกแบบดั้งเดิมไว้มากกว่า

ชุดย่อยของ hiPSC-CMs เฉพาะผู้ป่วย TOF-DG แสดงการลดลงของการแสดงออกของยีนหัวใจ แต่การควบคุมการแสดงออกของยีนประสาท

เพื่อวิเคราะห์การแสดงออกของยีนที่ไม่ใช่ไมโอไซต์เพิ่มเติมในคลัสเตอร์ B0 ยีนที่แสดงออกแตกต่างกัน (DEG) จะถูกระบุโดยการเปรียบเทียบคลัสเตอร์ B0 กับแต่ละคลัสเตอร์อื่น ๆ มีการระบุมากกว่า 200 DEGs ที่มีการควบคุมหรือลดระดับจากคลัสเตอร์ B0 (ข้อมูลเสริม 1). การวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่า GO ระบุคำศัพท์ GO ที่สำคัญที่เกี่ยวข้องกับการหดตัวของกล้ามเนื้อหัวใจในยีนที่ควบคุมต่ำ และที่เกี่ยวข้องกับการพัฒนาระบบประสาทของยีนที่ควบคุมในกลุ่ม B0 อย่างต่อเนื่อง (รูปที่. 2D). ดังนั้นคลัสเตอร์ B0 จึงแตกต่างจากคลัสเตอร์ที่เหลือด้วยการแสดงออกของยีนการเต้นของหัวใจที่ลดลง เช่นเดียวกับการแสดงออกของยีนประสาทที่ได้รับการควบคุม อย่างไรก็ตาม ไม่สามารถแมป DEG ข้างต้นใด ๆ ซึ่งรวมถึงยีนหัวใจที่ลดลงและยีนประสาทที่ได้รับการควบคุม สามารถแมปกับภูมิภาคที่ไม่เพียงพอในสาย hiPSC ของ TOF-DG ทั้งสอง

นอกจากนี้เรายังพยายามระบุปัจจัยการถอดรหัส (TFs) และเครือข่ายการควบคุมยีนที่เกี่ยวข้องจากแต่ละคลัสเตอร์ผ่านการใช้งาน Python ของการอนุมานและการจัดกลุ่มเครือข่ายการควบคุมเซลล์เดียว (pySCENIC) ในบรรดา TF 10 อันดับแรกที่มีกิจกรรมสูงกว่าในคลัสเตอร์ B0 มี 4 รายการที่เกี่ยวข้องกับการพัฒนาระบบประสาท (TCF3, SOX11, SOX4 และ ZEB1) และ 2 ในด้านการพัฒนาหัวใจและระบบประสาท (MEF2C และ มายอีฟ2) (รูปที่ 2E). ระดับการแสดงออกของ TF ประสาททั้งห้า (SOX11, SOX4, ZEB1, MEF2C และ มายอีฟ2) ถูกปรับเพิ่มในคลัสเตอร์ B0 เมื่อเปรียบเทียบกับสิ่งเหล่านั้นในกลุ่มอื่น (รูปที่ 2F). การค้นพบการแสดงออกที่ได้รับการควบคุมของ TF ของระบบประสาทเหล่านี้สอดคล้องกับการแสดงออกของยีนประสาทที่เพิ่มขึ้นในคลัสเตอร์ B0 เช่นเดียวกับ DEGs TF ของระบบประสาทข้างต้นไม่ได้ถูกแมปกับภูมิภาคที่ไม่เพียงพอในเซลล์ TOF-DG ทั้งสอง

ดังนั้นส่วนสำคัญของ hiPSC-CMs จาก TOF-DG (คลัสเตอร์ B0) แสดงให้เห็นการลดลงของยีนหัวใจ และการควบคุมของยีนประสาทนอกมดลูก ความล้มเหลวในการแมป DEG และ TF ในคลัสเตอร์ B0 กับภูมิภาค 22q11.2 ชี้ให้เห็นว่าลายเซ็นการถอดเสียงนี้อาจเป็นผลทางอ้อมของความไม่เพียงพอของ haploins ซึ่งแตกต่างจาก hiPSC-CMs จากส่วนควบคุมและกลุ่ม TOF-ND ซึ่งแสดงให้เห็นความต่อเนื่องในข้อกำหนดกระเป๋าหน้าท้อง คลัสเตอร์ B0 ได้สร้างคลัสเตอร์ที่แตกต่างจากส่วนที่เหลือของ hiPSC-CMs จาก TOF-DG (คลัสเตอร์ B1) ต้นกำเนิดของคลัสเตอร์ B0 ได้รับการสำรวจเพิ่มเติมตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง

การแยกความแตกต่างของหัวใจแบบแยกส่วนของต้นกำเนิดหัวใจ TOF-DG

เพื่อให้เข้าใจถึงการเกิดขึ้นของ TOF-DG-cluster B0 เราได้ตรวจสอบโปรไฟล์การถอดเสียงของต้นกำเนิดหัวใจ ในหลอดทดลอง จากการศึกษาครั้งก่อนของเรา³²การแสดงออกของยีนสนามหัวใจที่สอง (SHF) สูงสุดในวันที่หลังการสร้างความแตกต่าง (D) 7 และ 8 ดังนั้นเราจึงดำเนินการ scRNA-seq บนต้นกำเนิด hiPSC-cardiac (hiPSC-CPs) บน D7 และ D8 และ hiPSC-CMs ที่ยังไม่บรรลุนิติภาวะบน D11 จาก ตัวควบคุม 2 ตัว (ตัวควบคุม 1 และ 2) และผู้ป่วย TOF-DG (TOF-DG2 และ 1) 2 ตัว และผู้ป่วย TOF-ND (TOF-ND1) 1 ตัว (รูปที่. 3เอ, บี). โดยรวมแล้ว มีเซลล์ 87834 เซลล์ที่ถูกคงไว้หลังจากไม่รวมอนุพันธ์ของเอนโดเดอร์มอลและเซลล์บุผนังหลอดเลือดน้อยกว่า 1% การวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่า Pseudotime และ GO ระบุการควบคุมในการแสดงออกของยีนหัวใจ และการลดการควบคุมในการถอดรหัสและการแปล และกิจกรรมวัฏจักรของเซลล์ตามแนววิถี (รูปที่ XNUMX เพิ่มเติม) 4A–D). คล้ายกับการศึกษาครั้งก่อนของเรา³²,การแสดงออกของยีน SHF ได้แก่ ISL1, MEF2C, HAND2 และ FGF10พบได้ในจุดเวลาที่มีลำดับ (รูปที่. 3C). TBX1 ซึ่งเป็นหนึ่งในยีนภายในขอบเขตไมโครเดลิชั่น 22q11.2 ก็เป็นเครื่องหมายของ SHF เช่นกัน ท่ามกลางจุดเวลาตามลำดับ TBX1 พบการแสดงออกในวันที่ 7 โดยมีสัดส่วนแปรผันเท่ากับ TBX1⁺ hiPSC-CPs (10–30%) พบได้จากบรรทัดที่แตกต่างกัน (รูปที่. 3D). อย่างไรก็ตาม TBX1 ระดับการแสดงออกสามารถเทียบเคียงได้ระหว่าง D7-TBX1⁺ hiPSC-CP จากสายต่างๆ (รูปที่. 3D).

A การนำเสนอ UMAP ของ hiPSC-CP และ hiPSC-CM ทั้งหมด (TOF-DG, TOF-ND และการควบคุม) ข้อมูลถูกระบายสีตามจุดเวลาตามลำดับ B การนำเสนอ UMAP ของ hiPSC-CP และ hiPSC-CM ทั้งหมด (TOF-DG, TOF-ND และการควบคุม) ข้อมูลถูกระบายสีตามเส้นของเซลล์ C แปลงไวโอลินของการแสดงออกของยีน SHF ได้แก่ ISL1, MEF2C, แฮนด์2 และ เอฟจีเอฟ10. D TBX1 การแสดงออกใน hiPSC-CP TBX1 การแสดงออกในวันที่ 7/8/11 การสร้างความแตกต่างการเต้นของหัวใจภายนอกร่างกายถูกแสดงไว้ในพล็อต UMAP สูงสุด TBX1 พบการแสดงออกใน D7-hiPSC-CPs และสัดส่วนของ TBX1⁺ แสดงในแปลงโดนัทและมีป้ายกำกับสีแดง TBX1 แสดงออกมา TBX1⁺ D7-hiPSC-CPs ถูกแสดงในพล็อตไวโอลิน E แปลง UMAP ของ RGS13 การแสดงออกในวันที่ 7/8/11 ในหลอดทดลอง ความแตกต่างของหัวใจ RGS13 นิพจน์ถูกนำเสนอพร้อมกับบรรทัดของเซลล์ทั้งหมดพร้อมกัน (แผงด้านซ้าย) และแบ่งออกเป็นทุกบรรทัดของเซลล์ (แผงด้านขวา)

ภาพขนาดเต็ม

การเปรียบเทียบตามเวลากับส่วนควบคุมระบุเฉพาะ 20, 10 และ 22 DEG จาก D7-, D8- และ D11-TOF-DG-hiPSC-CP/CMs โดยไม่พบคำศัพท์ GO ที่มีนัยสำคัญ ไม่มีการแมป DEG เหล่านี้กับขอบเขตการลบไมโคร 22q11.2 ในสองบรรทัด TOF-DG-hiPSC จากนั้นตรวจสอบการแสดงออกของยีนนอกมดลูกจาก TOF-DG-cluster B0 ใน hiPSC-CPs และ hiPSC-CMs ที่ยังไม่บรรลุนิติภาวะ ต่างจาก TOF-DG-cluster B0 (hiPSC-CMs ที่แตกต่างกัน) ไม่พบยีนที่เกี่ยวข้องกับระบบประสาทใน TOF-DG-hiPSC- CPs (D7 และ D8) และ D11-immature hiPSC-CMs ในทางกลับกัน ชุดย่อยของเซลล์ที่ทำเครื่องหมายด้วย RGS13 การแสดงออก 1 ใน 10 ยีนที่ได้รับการควบคุมสูงสุดใน TOF-DG-คลัสเตอร์ B0 (รูปที่. 1E) ถูกพบอย่างสม่ำเสมอในเซลล์ที่ได้รับ TOF-DG ในช่วงเวลาที่มีลำดับทั้งหมด (D7, D8 และ D11) (รูปที่ 3E) แต่ไม่ใช่ใน TOF-ND1 และกลุ่มควบคุม

การแสดงออกของยีนนอกมดลูกได้รับการรายงานเมื่อเร็ว ๆ นี้ในต้นกำเนิดจาก Tbx1 เงื่อนไขเป็นโมฆะ (Tbx1-cKO) เมาส์³⁵. เพื่อเปรียบเทียบข้อมูล hiPSC-CP และข้อมูล hiPSC-CM ที่ยังไม่บรรลุนิติภาวะของเรากับ Tbx1-เมาส์ cKO เราทำการเปรียบเทียบข้ามสายพันธุ์กับแพ็คเกจ R SingleCellNet³⁶. มีการระบุกลุ่มสิบสี่กลุ่มจาก Tbx1ชุดข้อมูลเมาส์ -cKO (รูปที่ XNUMX เพิ่มเติม) 5A) ที่มีการแสดงออกของยีนที่รายงานในสิ่งพิมพ์³⁵ (รูปที่เสริม 5B) ซึ่งรวมถึงต้นกำเนิดของหัวใจที่แตกต่างกันสี่ชนิด (ต้นกำเนิดหลายสายพันธุ์, MLP; SHF ล่วงหน้า, aSHF; SHF หลัง, pSHF และโพรเอพิคาร์เดียม; PEO) และคาร์ดิโอไมโอไซต์ D7-hiPSC-CPs ของเราส่วนใหญ่คล้ายกับ aSHF ในขณะที่ D11-hiPSC-immature cardiomyocytes ส่วนใหญ่คล้ายกับ cardiomyocytes (รูปที่ XNUMX เพิ่มเติม) 5C) ใน Tbx1-ชุดข้อมูลเมาส์ cKO พักซ์8ซึ่งเป็นยีนนอกมดลูกที่สำคัญที่รายงานโดย Nomaru และคณะ³⁵พบเฉพาะใน MLP และต้นกำเนิดของปอด แต่ไม่พบใน aSHF และ cardiomyocytes (รูปที่ XNUMX เพิ่มเติม) 5D). เราไม่ได้ระบุ พักซ์ 8 การแสดงออกในชุดข้อมูล D7-D11 ของเรา อีกด้วย, RGS13ยีนนอกมดลูกที่พบในชุดข้อมูล D7-D11 ของเรา ไม่ได้ถูกระบุในชุดข้อมูล Tbx1-เมาส์ซีเคโอ กล่าวอีกนัยหนึ่งในขณะที่พบการแสดงออกของยีนนอกมดลูกในทั้งสองอย่าง Tbx1-เมาส์ cKO และ DG-hiPSC-CPs/CMs ของเรา ตัวตนและประชากรที่แสดงยีนนอกมดลูกนั้นแตกต่างกัน

เปลี่ยนแปลงพารามิเตอร์ทางไฟฟ้าสรีรวิทยาและเพิ่มภาวะหัวใจเต้นผิดจังหวะใน TOF-DG-hiPSC-CMs

นอกเหนือจากการทำโปรไฟล์การถอดเสียงแล้ว เรายังสำรวจสรีรวิทยาไฟฟ้าและภาวะผิดปกติของ hiPSC-CM ที่แตกต่างกันโดยใช้แพลตฟอร์ม hCAS ของเราเพื่อให้การประเมิน hiPSC-CM ที่ครอบคลุมมากขึ้น พารามิเตอร์ทางอิเล็กโทรสรีรวิทยา รวมถึงศักยะงาน (AP) การจัดการกับแคลเซียม และระยะเวลาการทนไฟที่มีประสิทธิผล (ERP) ถูกวัดภายใต้การกำหนดจังหวะทางไฟฟ้าที่ 1 เฮิร์ตซ์

เมื่อเปรียบเทียบกับสารควบคุมทั้งสอง TOF-DG2-hCAS แสดงระยะเวลา AP ที่สั้นลงอย่างมีนัยสำคัญ (50 และ 90% สู่การเกิดรีโพลาไรซ์, APD50 และ APD90) (รูปที่ 4A). ในทำนองเดียวกัน เมื่อเปรียบเทียบกับสารควบคุมทั้งสอง TOF-DG2-hCAS แสดงการสั้นลงที่มีนัยสำคัญของเวลาและเวลาในการสลาย AP ขึ้น (50 และ 90% จากพีค) (รูปที่ 4A). ดังนั้น คุณลักษณะ AP จึงแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญระหว่าง TOF-DG2 และส่วนควบคุม

A คุณลักษณะ Dotplot of Action Potential (AP) ระยะเวลาที่เป็นไปได้ของการดำเนินการ APD B Dotplots ของคุณลักษณะแคลเซียมชั่วคราว (CaT) C Dotplot ของระยะเวลาทนไฟที่มีประสิทธิภาพ ข้อมูลถูกนำเสนอในค่าเฉลี่ย ± SD สำหรับรูปที่ 1A-C. การทดสอบทางสถิติ: การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวแบบธรรมดาตามด้วยการทดสอบการเปรียบเทียบหลายรายการของ Tukey (APD50, AP90%Decay, CaT 50%Decay, CaT Up stroke และระยะเวลาทนไฟที่มีประสิทธิภาพ) การทดสอบ Kruskal–Wallis ตามด้วยการทดสอบเปรียบเทียบพหุคูณของ Dunn (APD90, AP up stroke, AP50%Decay และ CaT 90%Decay) การค้นพบที่สำคัญระหว่าง TOF(DG/ND) และกลุ่มควบคุมถูกทำเครื่องหมายด้วยเครื่องหมายดอกจัน * P <0.05; ** P <0.01; *** P < 0.001; **** P <0.0001. D เปอร์เซ็นต์ของเหตุการณ์การกลับเต้นผิดจังหวะของ TOF (DG/ND) และการควบคุม hCAS ระหว่างการกำหนดจังหวะในสภาวะคงตัว (SteadyState) และการกระตุ้นด้วยไฟฟ้าที่ตั้งโปรแกรมไว้ (PES) การทดสอบทางสถิติ: การทดสอบที่แน่นอนของฟิชเชอร์ *** P <0.001. E การติดตามศักยภาพในการดำเนินการของตัวแทน (AP) และแผนที่ไอโซโครนของเหตุการณ์การกลับเข้ามาใหม่ระหว่าง PES จาก TOF-DG2 แผงด้านบนแสดงการติดตาม AP ที่เป็นตัวแทนระหว่าง PES (S1S2) ตามด้วยอุบัติการณ์ของเหตุการณ์การกลับเข้าจังหวะอีกครั้ง แผงด้านล่างแสดงแผนที่ไอโซโครนสองแผนที่ซึ่งสอดคล้องกับ AP ปกติ (ซ้าย) และ AP จังหวะ (ขวา) F การลดลงของยีนหัวใจในคลัสเตอร์ B0-TOF-DG2 การวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่า GO ถูกดำเนินการบนการเปรียบเทียบระหว่างคลัสเตอร์ B0-TOF-DG2 และคลัสเตอร์ B0-TOF-DG1 คำศัพท์ GO ที่ได้รับการเสริมสมรรถนะในยีนที่ควบคุมต่ำจะแสดงในตาราง (ซ้าย) และยีนที่เกี่ยวข้องจะแสดงในพล็อตไวโอลิน (ขวา)

ภาพขนาดเต็ม

การจัดการแคลเซียมได้รับการประเมินด้วยเวลาและเวลาในการสลายแคลเซียมชั่วคราว (CaT) ขึ้นไป (50 และ 90% จากจุดสูงสุด) พบการลดระยะเวลาการเคลื่อนตัวของ CaT ลงอย่างมีนัยสำคัญใน TOF-DG2-hCAS ในขณะที่การลดระยะเวลาลงอย่างมีนัยสำคัญในการสลายตัว (50% จากจุดสูงสุด) พบในทั้ง TOF-DG2-hCAS และ TOF-ND1-hCAS เมื่อเปรียบเทียบกับทั้งสองตัวควบคุม ( รูปที่. 4B).

เราประเมิน ERP ของ hiPSC-CM เพิ่มเติม ซึ่งการทำให้สั้นลงซึ่งมีแนวโน้มที่จะเกิดภาวะหัวใจเต้นผิดจังหวะ พบการหดตัวของ EPR อย่างมีนัยสำคัญใน TOF-DG2-hCAS ในขณะที่พบการยืดตัวของ ERP ใน TOF-ND2-hCAS (รูปที่. 4C). ที่สำคัญ TOF-DG2-hCAS แสดงอุบัติการณ์ที่สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของภาวะหัวใจเต้นผิดจังหวะซ้ำในระหว่างการกำหนดจังหวะทางไฟฟ้าที่ตั้งโปรแกรมไว้ (PES) (รูปที่ 4D). การติดตาม AP ที่เป็นตัวแทนพร้อมแผนที่ไอโซโครนของภาวะหัวใจเต้นผิดจังหวะกลับเข้ามาใหม่จาก TOF-DG2-hCAS ถูกแสดงไว้ในรูปที่ 4E.

ในขณะที่ TOF-DG2-hCAS แสดงระยะเวลา AP ที่สั้นลงอย่างมีนัยสำคัญ, เวลาและเวลาในการสลายของ CaT ที่เพิ่มขึ้น และ ERP, TOF-DG1-hCAS มีความคล้ายคลึงกับการควบคุมในแง่ของพารามิเตอร์ทางอิเล็กโตรฟิสิกส์วิทยาที่ประเมิน (รูปที่. 4A–D). ดังนั้นเราจึงสำรวจเพิ่มเติมถึงความแตกต่างในการถอดเสียงระหว่าง TOF-DG1 และ TOF-DG2 ในคลัสเตอร์ B0 เมื่อเปรียบเทียบกับคลัสเตอร์ B0-TOF-DG1 คลัสเตอร์ B0-TOF-DG2 แสดงการลดลงของยีนหัวใจที่เกี่ยวข้องกับการหดตัวของกล้ามเนื้อ (รูปที่. 4F). ในขณะที่ยีนการเต้นของหัวใจเหล่านี้ถูกลดการควบคุมลงในทั้งคลัสเตอร์ B0-TOF-DG1 และคลัสเตอร์ B0-TOF- DG2 เมื่อเปรียบเทียบกับคลัสเตอร์อื่น (B1, B2 และ B3) (รูปที่. 4F) ขอบเขตการปรับลดของพวกมันโดดเด่นมากขึ้นในคลัสเตอร์ B0-TOF-DG2 (รูปที่ 4F) นอกจากนี้ พีเคพี2มีรายงานว่าการกลายพันธุ์มีความเกี่ยวข้องกับภาวะ RV dysplasia ที่เกิดจากภาวะหัวใจเต้นผิดจังหวะ³⁷พบว่าเป็นหนึ่งในยีนหัวใจที่มีการควบคุมลดลงในกลุ่ม B0-TOF-DG2 (รูปที่ 4F). ขอบเขตที่แตกต่างกันของการลดลงของยีนหัวใจอาจเป็นสาเหตุให้เกิดความคลาดเคลื่อนในการทำงานที่สังเกตได้ในกลุ่มเซลล์จากผู้ป่วยหลายรายในแพลตฟอร์ม hCAS

• เนื้อหาที่ขับเคลื่อนด้วย SEO และการเผยแพร่ประชาสัมพันธ์ รับการขยายวันนี้
• PlatoData.Network Vertical Generative Ai เพิ่มพลังให้กับตัวเอง เข้าถึงได้ที่นี่.
• เพลโตไอสตรีม. Web3 อัจฉริยะ ขยายความรู้ เข้าถึงได้ที่นี่.
• เพลโตESG. คาร์บอน, คลีนเทค, พลังงาน, สิ่งแวดล้อม แสงอาทิตย์, การจัดการของเสีย. เข้าถึงได้ที่นี่.
• เพลโตสุขภาพ เทคโนโลยีชีวภาพและข่าวกรองการทดลองทางคลินิก เข้าถึงได้ที่นี่.
• ที่มา: https://www.nature.com/articles/s42003-023-05344-6