Miniatyriserad CRISPR ger en mäktig genredigeringspunch

När genredigeringsverktyget CRISPR-Cas9 blev känt för mer än ett decennium sedan, förvandlades det bioteknik. Snabbare, billigare och säkrare än tidigare metoder hjälpte verktyget forskare att få insikt i genfunktioner – och när de går fel.

Crispr tog också med sig potential att förändra livet av människor som lever med ärftliga sjukdomar. Tack vare sin genredigeringsförmåga kan verktyget överladdar immuncellers förmåga att jaga cancer och andra oseriösa celler. I slutet av 2023, FDA-godkänd en CRISPR-terapi för sicklecellssjukdom och gav senare grönt ljus till personer med en blodsjukdom som kallas transfusionsberoende beta-talassemi. Många fler terapier är det i arbetena.

Men CRISPR har ett rejält problem: systemet är för stort, vilket gör det svårt att leverera genredigeraren till celler i muskler, hjärna, hjärta och andra vävnader.

Nu, ett team kl Mammoth Biosciences har en potentiell lösning. Medgrundat av CRISPR-pionjären Jennifer Doudna vid University of California, Berkeley, har företaget länge försökt minska det ursprungliga CRISPR-Cas9-systemet. Deras nya iteration, kallad NanoCas, minskade storleken på en nyckelkomponent, Cas9, till ungefär en tredjedel av originalet.

Den slanka inställningen gjorde att verktyget kunde förpackas i en enda "leveranslåda" - ett virus som vanligtvis används för genterapi inuti kroppen. Hos möss och apor använde teamet NanoCas för att redigera gener som är involverade i ärftligt högt kolesterol och Duchennes muskeldystrofi.

"CRISPR-genredigering är en transformativ teknologi för att hantera genetiska sjukdomar, men leveransbegränsningar har i hög grad begränsat dess terapeutiska tillämpningar till leverinriktade och ex vivo [utanför kroppen] terapier”, skrev teamet i ett förtryck som beskriver deras resultat. Den kompakta NanoCas "öppnar dörren" för redigering av vävnader inuti kroppen.

Leverans ve

CRISPR har två huvudkomponenter. Den ena är en RNA-molekyl som är som en blodhund, som letar upp och kopplar uppsättningen till en mål-DNA-sektion. När den är dockad skär eller klipper den andra komponenten, ett Cas-protein, det genetiska bandet.

Under årens lopp, forskare har upptäckt eller konstruerade andra versioner av Cas-proteiner. Vissa mål-RNA, "budbäraren" som översätter gener till proteiner. Andra byta ut enstaka genetiska bokstäver orsakar ärftliga sjukdomar. Vissa rekryterar till och med enzymer till modifiera epigenomet– systemet som styr vilka gener som slås på eller av.

Alla dessa verktyg har ett stort problem: De är svåra att leverera in i kroppen på grund av deras storlek. Nuvarande CRISPR-terapier bygger huvudsakligen på att extrahera celler och byta ut deras gener i petriskålar. De redigerade cellerna infunderas tillbaka i patienten. Dessa behandlingar kallas "ex vivo"-terapi och fokuserar huvudsakligen på blodbaserade sjukdomar.

Att korrigera genetiska problem inuti kroppen med CRISPR ökar komplexiteten. De flesta terapier fokuserar på ögonen eller Levern, som båda är relativt lätta att komma åt med ett skott. För alla andra vävnader är leverans huvudproblemet.

För att skicka redaktörerna till vävnader och celler måste de förpackas inuti ett virus eller en fettbubbla. Cas-proteiner kan nå över tusen aminosyror i längd, vilket redan understryker leveransbärarnas kapacitet. Lägg till guide-RNA-komponenter och systemet överskrider bagagegränserna.

För att komma runt viktbegränsningar har forskare kodat guide-RNA- och Cas-komponenterna separat i två virusbärare, så båda kan smyga in i celler. Alternativt har de använt fettbubblor som kallas liposomer som kapslar in båda genredigeringskomponenterna.

Varken är perfekt. En dubbel belastning av virus ökar risken för ett immunsvar. Liposomer hamnar vanligtvis i levern och släpper ut sin last där. Detta gör dem utmärkta på att redigera gener i levern, till exempel, PCSK9, för att behandla höga nivåer av kolesterol – men de kämpar för att nå andra vävnader. Viktiga mål som hjärnan och musklerna är utom räckhåll.

Liten men mäktig

Varför inte krympa lasten så att den får plats i samma virala bagage?

Här sökte Mammoth Biosciences i metagenomiska databaser efter mindre Cas-proteiner. Dessa databaser innehåller olika prover från hela planeten, inklusive från mikrober samlade i träsk, havsvatten, våra tarmar och andra källor. Teamet letade efter system som kunde redigera lika effektivt som Cas9, som bara krävde en liten guide-RNA-komponent och var under 600 aminosyror.

Från 22,000 176 metagenomer nollade laget XNUMX kandidater. Var och en undersöktes i mänskliga njurceller i en skål - snarare än att använda bakterier, vilket är normen. Detta screenar för Cas-varianter som fungerar bra inuti däggdjursceller, vilket är en vanlig flaskhals, skrev teamet.

Efter fler tester landade de på NanoCas. Det fungerade med ungefär 60 procent av RNA-guiderna som de provade, och efter lite mixtrande kunde de enkelt skiva upp riktat DNA.

Den lilla editorn och dess guide-RNA passar in i en enda viral vektor. Som bevis på konceptet skapade teamet ett NanoCas-system riktat mot PCSK9, en gen som är associerad med farligt höga nivåer av kolesterol, i levern på möss. Levereras i en enda injektion i venerna, det lilla verktyget skar ner genen till oupptäckbara nivåer i blodet.

Därefter vände sig teamet till en gen som kallas dystrofin i muskler, en vävnad som traditionella CRISPR-metoder kämpar för att nå. Vid Duchennes muskeldystrofi orsakar muterat dystrofin progressiv muskelförlust. NanoCas redigerade genen över en mängd olika muskeltyper - lår-, hjärt- och vadmuskel. Effekten varierade, från 10 till 40 procent av de redigerade cellerna.  

Teamet testade sedan NanoCas i apor. Efter ungefär två månader var ungefär 30 procent av deras skelettmuskelceller redigerade. Hjärtceller var mindre lyhörda, med bara hälften av effekten.

"Vad vi vet" är detta första gången någon har redigerat muskler i en icke-mänsklig primat med ett enda virus CRISPR-system, skrev teamet.

Genterapier som använder leveransvirus kan belasta levern, men under hela försöket förblev apans leverfunktioner och andra hälsofaktorer relativt normala. Men många frågor kvarstår. Även om systemet redigerade riktade gener hos friska apor, återstår att se om det kan behandla genetisk muskelförlust. Som med andra genredigeringssystem, finns det också risken att oavsiktligt redigera icke-målinriktade gener eller sporra till en immunattack.

Som sagt, miniatyren NanoCas – och potentiellt andra små Cas-proteiner ännu inte upptäckt – skulle kunna transportera CRISPR till en mängd olika vävnader i kroppen med ett stick. Teamet undersöker redan systemets potential för riktar sig mot hjärnsjukdomar. Tekniken kan också omarbetas för användning i epigenetisk eller basredigering.

Framför allt tyder studien på att små Cas-proteiner kan vara mäktiga.

"NanoCas visar att noggrant utvalda kompakta system kan uppnå robust redigering i olika sammanhang, vilket utmanar antagandet att små CRISPR-system i sig är mindre effektiva", skrev teamet.