Заявление о этике

Все линии ИПСК ранее были получены из фибробластов биопсии кожи после подписания информированного согласия и собраны в соответствии с этическим одобрением, предоставленным Комитетом по этике исследований Южного Уэльса (WA/12/0186) и Комитетом по этике исследований Южного Центрального Беркшира (REC10/H0505/71). в Центре стволовых клеток Джеймса Мартина Оксфордского университета по стандартизированным протоколам. Все линии ИПСК были опубликованы ранее (см. ниже и дополнительную таблицу). 1).

культура иПСК

Три линии ИПСК, полученные от трех разных пациентов с БАС, несущих HRE в C9orf72 и в качестве контроля — изогенная линия, ранее полученная посредством редактирования генома CRISPR/Cas9 с использованием репарации, направленной на гомологию.¹⁸и четыре здоровые контрольные линии ИПСК, подобранные по полу и возрасту, были использованы в этом исследовании. Все линии ИПСК ранее были опубликованы и тщательно охарактеризованы (подробную информацию о демографии и характеристиках см. в дополнительной таблице). 1). ИПСК культивировали в mTeSR™1 (85850, StemCell Technologies) на Geltrex™ (A1413302, ThermoFisher) с ежедневной заменой среды. Клетки пассировали с использованием ЭДТА (0.5 мМ), размножали для получения стабильных замороженных запасов клеток для исследования (криоконсервированные в 50% mTeSR™1, 30% эмбриональной стволовой клетки фетальной бычьей сыворотки (16141002, Merck), 10% KnockOut™ DMEM ( 10829018, ThermoFisher), 10% ДМСО (D2650, Merck)) с максимум 3 последующими пассажами в ходе эксперимента и отрицательным результатом теста на микоплазму с использованием MycoAlert.^TM Набор для обнаружения микоплазмы (Lonza).

Дифференцировка мотонейронов, происходящих из ИПСК

ИПСК были дифференцированы в МН с использованием ранее опубликованного протокола.³⁹. Вкратце, нейронную индукцию проводили с использованием DMEM-F12/Neurobasal 50:50 с добавлением N2 (1X), B27 (1X), 2-меркаптоэтанола (1X), антибиотика-антимикотика (1X, все ThermoFisher), аскорбиновой кислоты (0.5 мкМ). , Соединение C (1 мкМ, обе компании Merck) и Chir99021 (3 мкМ, R&D Systems). После двух дней культивирования добавляли ретиноевую кислоту (1 мкМ, Merck) и сглаженный агонист (500 нМ, R&D Systems). Еще через 2 дня Соединение C и Chir99021 были удалены. В день in vitro (DIV)18 клетки повторно высевали на полиэтиленимин (PEI, 0.07%, Merck) и Geltrex™ (ThermoFisher) или PDL (Sigma-Aldrich)/ламинин (R&D Systems)/фибронектин (Corning) в среду, дополнительно дополненную BDNF (10 нг/мл), GDNF (10 нг/мл), ламинином (0.5 мкг/мл, все ThermoFisher) и DAPT (10 мкМ, R&D Systems). Через три дня среду заменяли на среду микроглии, как описано ниже, и МН либо культивировали совместно с микроглией, либо поддерживали в монокультуре. Половину замены среды проводили каждые 2–4 дня.

Дифференциация предшественников микроглии, полученных из ИПСК

ИПСК были дифференцированы в предшественники макрофагов/микроглии, как описано ранее.^15,40. Вкратце, образование эмбриоидных телец (ЭТ) индуцировали путем посева ИПСК в лунки Aggrewell 800 (STEMCELL Technologies) в mTeSR™1, дополненном BMP4 (50 нг/мл), VEGF (50 нг/мл, оба Peprotech) и SCF (20 нг/мл, MilteNY Biotec). Через четыре-семь дней с ежедневной заменой ¾ среды ЭТ переносили во флаконы T175 и дифференцировали в X-VIVO15 (Lonza), дополненном интерлейкином-3 (25 нг/мл, R&D Systems), MCS-F (100 нг/мл). ), GlutaMAX (1X, оба ThermoFisher) и 2-меркаптоэтанол (1X). Свежую среду добавляли еженедельно. Примерно через два месяца предшественники собирали путем сбора супернатанта, пропускали через клеточный фильтр (40 мкМ, Falcon/Greiner) и либо дифференцировали в микроглию в монокультуре, либо в совместной культуре, как описано ниже.

Дифференциация микроглии, полученной из ИПСК

Предшественники микроглии высевали на PEI (0.07%) и Geltrex™ или PDL/ламинин/фибронектин с использованием нашей ранее охарактеризованной среды микроглии.¹⁷ в состав входят Advanced DMEM-F12 (ThermoFisher), GlutaMAX (1X), N2 (1X), антибиотик-антимикотик (1X), 2-меркаптоэтанол (1X), интерлейкин-34 (100 нг/мл, Peprotech/BioLegend), BDNF ( 10 нг/мл), GDNF (10 нг/мл) и ламинин (0.5 мкг/мл). Микроглию дифференцировали в течение примерно 14 дней, с половиной замены среды каждые 2–4 дня, и собирали для экстракции РНК/белка или использовали для анализов.

Совместное культивирование мотонейронов, полученных из ИПСК, и микроглии

Совместные культуры создавали, как описано ранее, с использованием линии HC-2b (дополнительная таблица 1) для генерации MN¹⁷. Вкратце, через три дня после окончательного повторного высева дифференцирующихся MN (DIV21) собирали предшественники микроглии. МН промывали PBS, и в каждую лунку добавляли предшественники микроглии, ресуспендированные в среде микроглии, в соотношении 1:1 с МН. Совместные культуры поддерживали в течение как минимум 14 дней с половинной заменой среды каждые 2–4 дня. В отдельных экспериментах прямой контакт двух типов клеток предотвращался путем помещения микроглии во вставки для тканевых культур (размер пор 0.4 мкм, 83.3932.040, Sarstedt).

Праймирование микроглии лечением ЛПС и ингибиторами MMP9

Для монокультур микроглии всю среду аспирировали и добавляли ЛПС (100 нг/мл, L4391, Merck) в среду микроглии на 48 часов. В контрольные лунки вводили только свежую среду микроглии. В некоторых условиях повторные обработки LPS проводили в день 0, 2 и 4. Для совместных культур обработку LPS начинали на DIV25 и проводили в течение 10 дней. Половину среды аспирировали и заменяли ЛПС в среде микроглии (конечная концентрация: 100 нг/мл), с дополнительной заменой половины среды на среду микроглии, содержащую ЛПС, на DIV29 и 33. В дополнительных экспериментах обработку ЛПС начинали на DIV25 и 20. проводили в течение 9 дней с заменой половины среды через день. BDNF и GDNF удаляли из культуральной среды для этих экспериментов. Для ингибирования MMP100 культуры одновременно обрабатывали ЛПС (9 нг/мл) и ингибитором MMP9 I (MMP3i, 444278 мкМ, 0.3, Merck) или ДМСО в равных концентрациях (XNUMX%) в качестве контроля носителя.

Праймирование микроглии TNF/IL1B

Всю среду аспирировали из монокультур микроглии и добавляли TNF (50 нг/мл) и IL1B (20 нг/мл, оба Peprotech) в среду микроглии на 48 часов. В контрольные лунки вводили только свежую среду микроглии.

Лечение ЗНО с помощью ингибитора rhMMP9 и MMP9

МН обрабатывали рекомбинантной активной человеческой MMP9 (rhMMP9, 30 нг/мл, PF024-5UG, Merck) и MMP9i (3 мкМ, 444278, Merck) или ДМСО в равных концентрациях (0.3%) в качестве контроля носителя. Обработку проводили на DIV21 и DIV25, а жизнеспособность MN определяли с помощью анализа MTS на DIV29.

Живая визуализация фагоцитоза и количественная оценка

Нестимулированные и обработанные LPS (100 нг/мл в течение 48 часов) монокультуры микроглии окрашивали Hoechst в растворе для визуализации живых клеток (1:10,000 10, ThermoFisher) в течение 35364 минут. В каждую лунку добавляли биочастицы pHrodo™ Red Zymosan Bioparticles™ (P50, ThermoFisher) в растворе для визуализации живых клеток (150 мкг/мл), и изображения получали через 10 минут с использованием системы визуализации основных клеток EVOS™ XL (ThermoFisher), оснащенной 10-кратным увеличением. цель. В выбранных условиях клетки дополнительно обрабатывали ингибиторами фагоцитоза/деградации цитохалазином D (2618 мкМ, C1, Merck), бафиломицином А1 (1334 мкМ, 1, R&D Systems) или ДМСО (носитель) с предварительной обработкой в ​​течение XNUMX часа. Количественную оценку проводили автоматически с использованием макроса анализа на Фиджи, а площадь частиц фагоцитоза на клетку получали путем деления площади интернализованных частиц фагоцитоза на количество Hoechst-положительных микроглий.

Патч-кламп электрофизиология

Электрофизиологию цельноклеточной патч-кламп проводили, как описано ранее.¹⁷. Здоровые контрольные MN на DIV 42–46 в совместной культуре со здоровым контролем или микроглией, полученной от пациента C9orf72-ALS, поддерживали во внеклеточном растворе, содержащем 167 мМ NaCl, 2.4 мМ KCl, 1 мМ MgCl.₂, 10 мМ глюкозы, 10 мМ HEPES и 2 мМ CaCl₂ доводили до pH 7.4 и 300 мОсм. Электроды с сопротивлением кончика от 7 до 12 МОм изготавливались из боросиликатного стекла (внутренний диаметр 0.86 мм, внешний диаметр 1.5 мм). К электроду добавляли внутриклеточный раствор, содержащий 140 мМ K-глюконата, 6 мМ NaCl, 1 мМ EGTA, 10 мМ HEPES, 4 мМ MgATP, 0.5 мМ Na.₃GTP, доведенный до pH 7.3 и 290 мОсм. Сбор данных проводился с использованием усилителя Multiclamp 700B, digidata 1550 A и программного обеспечения ClampEx 6. Последовательное сопротивление (R_s) поддерживалось на уровне <30 МОм. Токи каналов, управляемых напряжением, измерялись с помощью зажима напряжения, где нейроны подвергались предварительной импульсации в течение 250 мс с импульсом -140 мВ, а напряжение с шагом 10 мВ подавалось от -70 мВ до +70 мВ. Индуцированные потенциалы действия (ПД) регистрировались при токовом зажиме, нейроны удерживались при -70 мВ и применялось 15 ступеней тока по 10 пА от -10 пА до 130 пА. Токи потенциалзависимых каналов и свойства индуцированных потенциалов действия (реобаза, максимальные AP, AP над реобазой) определяли количественно с использованием Clampfit 10.3 (пакет программного обеспечения pCLAMP, Molecular Devices). Максимальное количество точек доступа определялось количественно путем определения количества точек доступа в развертке с самой длинной последовательностью. Продолжительность и амплитуду ПД определяли количественно в Matlab R2022a (MathWorks) с использованием первого потенциала действия, записанного от каждого нейрона.

записи МЭА

В целом, для совместных культур в 2-луночных планшетах с многоэлектродной матрицей (MEA) (M15-tMEA-48B, Axion BioSystems) с использованием системы Maestro (Axion Biosystems) были получены записи активности нейронов в течение 768–48 минут. Анализ проводился с использованием программного обеспечения AXIS v2.5.2 (Axion BioSystems) со стандартным отклонением > 5.5 в качестве порога обнаружения. Среднюю скорость срабатывания на лунку рассчитывали путем усреднения всех активных (>1 импульс/мин) электродов на лунку.

Выделение РНК и RT-qPCR

РНК экстрагировали с использованием набора RNAeasy Mini Plus (Qiagen) и равные количества РНК (100 нг) подвергали обратной транскрипции в кДНК с использованием набора для обратной транскрипции кДНК High-Capacity (ThermoFisher). Количественную ПЦР в реальном времени проводили с использованием Fast SYBR™ Green Master Mix (ThermoFisher) с использованием системы ПЦР LightCycler® 480 (Roche) и праймеров (ThermoFisher), перечисленных в дополнительной таблице. 3. Все наборы использовались согласно инструкциям производителя. Количественную оценку относительной кратности экспрессии генов проводили с использованием 2^–∆∆Ct метод с нормировкой на ТБФ эталонный ген (ТБФ Диапазон Ct 0.5) и среднюю экспрессию генов контрольной микроглии для каждого эксперимента.

секвенирование РНК

Три здоровые контрольные линии и три линии ИПСК, полученные от пациента, C9orf72-ALS, были дифференцированы в микроглию, с тремя независимыми дифференцировками на линию. РНК экстрагировали, как описано выше. Все образцы РНК имели значения RIN не менее 8.5. Затем проводили подготовку образцов и биоинформатический анализ, как описано ранее.¹⁷. Вкратце, перед приготовлением библиотеки образцы нормализовали до 100 нг. Обогащение полиаденилированных транскриптов и подготовку специфичной для цепи библиотеки проводили с использованием набора мРНК NEBNext Ultra II (NEB) в соответствии с инструкциями производителя. Секвенирование парных концов (длина считывания: 150 пар оснований) проводили с использованием платформы NovaSeq6000 (Illumina, набор реагентов NovaSeq 6000 S2/S4, версия 1.5, 300 циклов), генерируя необработанное количество считываний минимум 30 млн чтений на образец. . Считывания парных концов были сопоставлены с эталонным геномом человека GRCh38.p13 (https://www.gencodegenes.org) с использованием HISAT2 v2.2.1⁴¹. Таблица счетчиков была получена с помощью FeatureCounts v2.0.1.⁴². Нормализацию счетчиков и анализ дифференциальной экспрессии проводили с использованием DESeq2 v1.28.1.⁴³ в RStudio 1.4.1103, включая биологический пол в модели и метод Бенджамини-Хохберга для коррекции множественного тестирования. Три различных дифференциации для каждого состояния были объединены в одну точку данных, если не указано иное, когда в модель были включены биологический пол и репликация дифференцировки. Исследовательский анализ данных проводился после стабилизирующего дисперсию преобразования таблицы подсчетов с использованием анализа главных компонент. Бревно₂ кратное изменение (журнал₂ е) усадку проводили с использованием «нормального» подхода. Гены с | бревно₂ ФК | > 0.5 и скорректировано p-значение <0.05 определялось как дифференциально экспрессируемые гены (DEG). Данные интерпретировались с помощью аннотаций из базы данных Gene Ontology с использованием ClusterProfiler v3.16.1.⁴⁴. Мы проанализировали обогащение путей, выполнив анализ избыточной репрезентации (ORA) для всех DEG и анализы обогащения набора генов (GSEA) для всего транскриптома, ранжированного по логарифму.₂fc, используя стандартные настройки в ClusterProfiler для ORA и GSEA (скорректированные p-значение <0.05 с использованием метода Бенджамини-Хохберга).

иммунофлюоресценция

Клетки, культивированные на покровных стеклах, предварительно фиксировали 2% параформальдегидом (PFA) в PBS в течение 2 минут при комнатной температуре (RT), а затем фиксировали 4% PFA в PBS еще в течение 15 минут при комнатной температуре. После пермеабилизации и блокирования 5% ослиной сыворотки и 0.2% тритона X-100 в PBS в течение 1 часа при комнатной температуре покровные стекла инкубировали с первичными антителами, перечисленными в дополнительной таблице. 2, разведенный в 1% ослиной сыворотке и 0.1% тритоне X-100 в PBS, при температуре 4 °C. После трех промывок PBS-0.1% Triton X-100 по 5 минут каждое покровные стекла инкубировали с соответствующими флуоресцентными вторичными антителами Alexa Fluor® 488/568/647 осла против мыши/кролика/козы/морской свинки (все 1:1000, ThermoFisher или Абкам). Затем покровные стекла дважды промывали PBS-0.1% Triton X-100 по 5 минут каждый и инкубировали с DAPI (1 мкг/мл, Sigma-Aldrich) в PBS в течение 10 минут. После дополнительного 5-минутного этапа промывания 0.1% PBS Triton X-100 покровные стекла монтировали на предметные стекла с использованием ProLong™ Diamond, Gold или Glass Antifade Mountant (ThermoFisher). Конфокальную микроскопию проводили с использованием микроскопа LSM 710, LSM 880 (оба Zeiss) или Fluoview FV1000 (Olympus).

Анализ микроглиальных разветвлений

Четыре-пять изображений z-stack (z-интервал: 1 мкм) случайно выбранных полей зрения были получены при 60-кратном увеличении для каждого покровного стекла, а на Фиджи были созданы проекции максимальной интенсивности. Для анализа ветвления IBA1-положительной микроглии в монокультуре и совместной культуре автоматически определяли объем клеток, индекс ветвления, среднюю длину ветвей и количество точек ветвления с использованием 3DMorph, как описано в другом месте.¹⁹.

Количественная оценка неправильной локализации TDP-43 в микроглии

Для каждого покровного стекла были получены четыре-пять изображений z-stack случайно выбранных полей зрения при 60-кратном увеличении, а на Фиджи были созданы проекции максимальной интенсивности. Средние значения интенсивности TDP-43 в ядре и цитоплазме определяли слепым способом, используя сигналы DAPI и IBA1 для идентификации ядерных и цитоплазматических границ соответственно. Затем рассчитывали соотношение цитоплазматического и ядерного TDP-43.

Количественная оценка экспрессии маркеров микроглии в монокультурах микроглии

Три изображения z-stack случайно выбранных полей зрения были получены при 40-кратном увеличении для каждого покровного стекла, а проекции максимальной интенсивности были созданы на Фиджи. Количество DAPI-положительных ядер и IBA1⁺/ДАПИ⁺ и ТМЕМ119⁺/ДАПИ⁺ ячейки автоматически определялись количественно для каждого поля просмотра для каждой строки с помощью макроса.

Количественная оценка количества и соотношения микроглии и мотонейронов в совместной культуре

От трех до пяти изображений случайно выбранных полей зрения были сделаны с 10-кратным или 40-кратным увеличением для каждого покровного стекла, а на Фиджи были созданы проекции максимальной интенсивности. Для микроглии с помощью макроса на канале IBA1 применялся автоматический порог для создания маски, а количество клеток микроглии определялось для каждого поля обзора путем подсчета количества DAPI-положительных ядер в маске IBA1 с помощью функции 'analyze функция частиц. Для MN к каналу TUJ1 применялся автоматический порог для создания маски, а количество нейронов определялось для каждого поля обзора путем подсчета количества DAPI-положительных ядер в маске TUJ1 с использованием функции «анализ частиц». Для расчета соотношения микроглия:MN количество клеток микроглии делили на число MN. Для оценки выживаемости МН после длительного воздействия ЛПС абсолютное число МН нормализовали к среднему значению контрольных линий для определения относительной выживаемости МН путем учета групповых эффектов между дифференцировками после длительного культивирования.

Количественная оценка экспрессии апоптотического маркера в совместной культуре

Для каждого покровного стекла были получены пять изображений случайно выбранных полей зрения с помощью z-стеков при 40-кратном увеличении. Были составлены прогнозы максимальной интенсивности. С помощью макроса к каналу TUJ1 применялся автоматический порог для создания маски, а экспрессия маркера апоптоза CC3 внутри нейронов определялась для каждого поля обзора путем количественного определения площади сигнала CC3 в маске TUJ1 с использованием функции «Анализ». функция частиц. Чтобы учесть групповые эффекты между дифференцировками, кратное изменение экспрессии было получено путем нормализации абсолютных измерений к среднему значению контрольных линий.

Количественная оценка роста нейритов в совместной культуре

Четыре-пять z-стеков случайно выбранных полей обзора, показывающих нейриты, но избегающих сом нейронов, были получены при 60-кратном увеличении для каждого покровного стекла. Прогнозы максимальной интенсивности были получены на Фиджи. С помощью макроса к окрашиванию TUJ1 применялся автоматический порог, а рост нейритов для каждого поля обзора определялся путем измерения площади TUJ1-положительных нейритов на поле просмотра с использованием функции «анализ частиц» на Фиджи.

Анализ экспрессии нейронального синаптофизина

Для каждого покровного стекла получали четыре-пять изображений случайно выбранных полей зрения с помощью z-стеков при 60-кратном увеличении. Прогнозы максимальной интенсивности были получены на Фиджи. С помощью макроса к окрашиванию синаптофизина применялся автоматический порог для анализа точечных структур, а количество и площадь частиц синаптофизина определялось для каждого поля обзора с использованием функции «анализ частиц» на Фиджи.

РНКскоп

Очаги РНК выявляли с помощью мультиплексного флуоресцентного анализа RNAscope v2 (323100, ACD) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, микроглию иПСК, фиксированную 4% PFA, последовательно дегидратировали 50%, 70% и 100% этанолом в течение 1 минуты каждый и хранили при -20 °C. После регидратации 100%, 70% и 50% этанолом клетки инкубировали с 0.1% Tween-20 в PBS, перекисью водорода и протеазой III (коэффициент разбавления 1:15) в течение 10 минут каждый с промывкой PBS между ними. Зонды, нацеленные на (G₄C₂)_n и (С₄G₂)_n расширения (ACD, 884351-C2 и 884361-C2) добавляли к отдельным покровным стеклам и инкубировали в течение 2 часов с последующими этапами амплификации и развития в соответствии со стандартным протоколом. Последовательную ICC проводили путем инкубации с первичным антителом против IBA1 (1:200, 019-19741, Wako Fujifilm) в течение 2 часов при комнатной температуре, а затем в соответствии с протоколом иммунофлуоресценции, подробно описанным выше.

Количественная оценка образования очагов РНК в микроглии

Пять изображений z-stack случайно выбранных полей зрения были получены при 40-кратном или 63-кратном увеличении для каждого покровного стекла, а проекции максимальной интенсивности были созданы на Фиджи. Количество очаго-позитивных клеток и количество очагов на очаго-позитивное ядро ​​определяли путем ручного подсчета.

Анализ жизнеспособности МТС

В отдельных экспериментах жизнеспособность MN определяли с использованием анализа пролиферации клеток CellTiter 96® AQueous One Solution (MTS, G3580, Promega) в соответствии с инструкциями производителя. Показания планшета выполняли после 90–120-минутной инкубации с реагентами для анализа.

Измерение высвобождения цитокинов/хемокинов и нейрофиламентов

Культуральные супернатанты собирали и центрифугировали при 1200 g и 4°C в течение 10 минут. Объединенные образцы анализировали с использованием цитокинового массива Proteome Profiler Human XL Cytokine Array (ARY022B) или массива ингибиторов протеазы/протеазы (ARY025, обе системы исследований и разработок) в соответствии с инструкциями производителя. Сигнал визуализировали на ChemiDoc.^TM Система визуализации MP (Bio-Rad) и анализировались с использованием ImageStudioLite v5.2.5 (LI-COR). Кроме того, в соответствии с инструкциями производителя использовались тесты Human DPP4 (DC260B), MMP9 (DMP900), CXCL10 Quantikine ELISA (DIP100) и набор Active MMP9 Fluorokine E (F9M00, все системы исследований и разработок). Высвобождение легкой цепи нейрофиламентов человека (NfL) измеряли с использованием анализа Meso Scale Discovery (MSD) (K1517XR-2) в соответствии с инструкциями производителя.

Экстракция белка

Клетки промывали PBS и добавляли 100–200 мкл холодного буфера RIPA (ThermoFisher), дополненного полным раствором.^TM коктейль ингибиторов протеаз и PhosSTOP^TM Ингибитор фосфатазы (оба Merck) добавляли в каждую лунку. Для гомогенизации лизатов на пробу применяли 10 1s-импульсов моторизованными пестиками. После инкубации на льду в течение 30 мин образцы центрифугировали при 12,000 4 об/мин и XNUMX^oС в течение 15 мин, супернатанты хранили при -80°С. Количественное определение концентрации белка проводили с использованием прибора Пирса.^TM Набор для анализа белка на бицинхониновую кислоту (ThermoFisher) в соответствии с инструкциями производителя. Затем готовили образцы белка в определенных концентрациях (0.3–1.0 мкг/мкл) путем разведения в дистиллированной воде, NuPAGE.^TM буфер загрузки и NuPAGE^TM восстановитель проб (как ThermoFisher). За этим следовала инкубация при 95°C в течение 5 минут для денатурации и восстановления образцов.

Вестерн-блот

5–20 мкг каждого образца и белковую лестницу Spectra Multicolour Wide Range или предварительно окрашенную белковую лестницу PageRuler™ (оба ThermoFisher) загружали на предварительно отлитый NuPAGE.^TM Бис-Трис 4–12% градиентные гели (ThermoFisher). Образцы разделяли электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) с использованием NuPAGE.^TM Рабочий буфер MES (ThermoFisher) при 50–130 В. Затем белки переносили на нитроцеллюлозные мембраны при 20–25 В в течение 7 минут с использованием системы сухого блоттинга iBlot 2 (оба ThermoFisher). После блокирования 5% молоком или BSA в TBS/0.1% Tween-20 (TBS-T, ThermoFisher) при комнатной температуре в течение одного часа мембраны инкубировали с первичными антителами, перечисленными в дополнительной таблице. 4 разбавляют в 3% молоке или БСА в TBS-T при температуре 4°C в течение ночи. Мембраны трижды промывали TBS-T в течение 7 минут, а затем инкубировали с соответствующими вторичными антителами, связанными с пероксидазой хрена (HRP), при комнатной температуре в течение 1 часа. Использовали следующие вторичные антитела, связанные с HRP (все 1:5000): овечьи анти-мышиные HRP (NA931V), ослиные анти-кроличьи HRP (NA934V, оба GE Healthcare), ослиные анти-козьи HRP (PA1-28664, ThermoFisher). . Мембраны снова трижды промывали TBS-T в течение 7 минут, а затем инкубировали в течение одной минуты с раствором усиленной хемилюминесценции (Millipore). ХимиДок^TM Для визуализации сигнала использовалась система визуализации MP. Интенсивность полос определяли количественно с использованием Fiji v1.53q.⁴⁵ и нормализованы по генам «домашнего хозяйства» β-актину или GAPDH и средней экспрессии контролей для каждого эксперимента. После проявления мембраны промывали TBS-T два раза по 5 минут с последующей 10-минутной инкубацией с Restore.^TM ПЛЮС десорбционный буфер (ThermoFisher). После двух дополнительных 5-минутных промывок TBS-T мембраны блокировали и инкубировали с новыми первичными антителами, как описано выше.

Анализ экспрессии Poly(GA)/(GP)

Клетки лизировали в буфере RIPA (Sigma-Aldrich), дополненном 2× полным коктейлем ингибиторов протеаз Mini, свободных от ЭДТА (Merck) и 2% SDS (ThermoFisher), и гомогенизировали ультразвуком. После центрифугирования при 17,000 XNUMX × g при 16°C в течение 20 минут определяли содержание белка в супернатантах, как описано в дополнительных методах. Образцы доводили до одной и той же концентрации (0.6–1.0 мг/мл), и иммуноанализ MSD проводили в одиночном комплексе с использованием 96-луночных планшетов SECTOR (MSD) для количественной оценки экспрессии Poly(GA)/(GP), как описано ранее.²⁰. Короче говоря, планшеты покрывали немечеными антителами против поли(GP) или против поли(GA). После блокирования образцы загружали по 45 мкг белка на лунку для иммуноанализа поли(GP) и по 27 мкг белка для поли(GA). В качестве детекторов использовали биотинилированные антитела против поли(GP) и против поли(GA), а затем сульфотеченный стрептавидин (Meso Scale Discovery, R32AD). Планшеты считывали с помощью буфера для чтения MSD (Meso Scale Discovery, R92TC) с использованием MSD Sector Imager 2400. Сигналы соответствуют интенсивности излучаемого света при электрохимической стимуляции аналитического планшета. Перед анализом из каждого показания вычитали среднее значение калибратора, не содержащего пептид. Отрицательные сигналы были установлены на «0».

Статистика и воспроизводимость

Никакой статистический метод не использовался для предварительного определения размера выборки. Исследователи не знали о распределении во время анализа, если это допускалось планом эксперимента. Статистический анализ проводился с использованием GraphPad Prism 9. Никакие данные из анализа не были исключены. Данные нескольких линий и дифференциаций были объединены для сравнения общего эффекта C9orf72 ОПЧ против контроля. Сравнения двух групп проводились с помощью двусторонних непарных t-критерий, а сравнения нескольких групп - с помощью одностороннего или двустороннего дисперсионного анализа с соответствующими апостериорными тестами, как указано в подписях к рисункам. Количество независимых экспериментов и линий указано в подписи к каждому рисунку. Данные представлены в виде отдельных точек и средних значений ± SEM. Различия считались значимыми, когда P < 0.05 (*P <0.05; **P <0.01; ***P <0.001; ****P <0.0001; нс: не существенно). На коробчатых диаграммах показаны медиана (центральная линия), верхний и нижний квартиль (границы прямоугольника), 1.5-кратный межквартильный размах (усы) и выбросы (точки). Для построения данных использовались GraphPad Prism 9 или RStudio 1.4.1103. Окончательная сборка фигурок производилась с помощью Adobe Illustrator 25.4.1.

Отчетная сводка

Дополнительная информация о дизайне исследований доступна в Резюме отчета по портфелю природы ссылка на эту статью

• SEO-контент и PR-распределение. Получите усиление сегодня.
• PlatoData.Network Вертикальный генеративный ИИ. Расширьте возможности себя. Доступ здесь.
• ПлатонАйСтрим. Интеллект Web3. Расширение знаний. Доступ здесь.
• ПлатонЭСГ. Углерод, чистые технологии, Энергия, Окружающая среда, Солнечная, Управление отходами. Доступ здесь.
• ПлатонЗдоровье. Биотехнологии и клинические исследования. Доступ здесь.
• Источник: https://www.nature.com/articles/s41467-023-41603-0