Культура клеток

Линии ESC мыши (Rex1GFP-d2 и E14IVc¹³⁷) культивировали в условиях без кормушки [пластик, покрытый 0.2% желатином (Sigma, кат. G1890)] и пересаживали каждые 3–4 дня в соотношении 1:10 после диссоциации с помощью аккутазы (GE Healthcare, кат. L11-007). ) или 0.25% трипсина (Life Technologies). Клетки культивировали в бессывороточной среде на основе N2B27 [DMEM/F12 и Neurobasal в соотношении 1:1, 0.1 мМ β-меркаптоэтанол, 2 мМ L-глутамина, 1:200 N2 и 1:100 B27 (все реагенты Life Technologies )] или содержащую сыворотку среду KSR [GMEM (Sigma, кат. G5154) с добавлением 10% KSR (Life Technologies), 2% FBS (Sigma, кат. F7524), 100 мМ β-меркаптоэтанола (Sigma, кат. M7522) , 1× заменимые аминокислоты MEM (Invitrogen, кат. 1140-036), 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия (оба от Invitrogen)], дополненные двумя низкомолекулярными ингибиторами (2i) PD (PD0325901, 1 мкМ), CH (CHIR99021, 3 мкМ) от Axon (кат. 1386 и 1408) и LIF (100 единиц/мл, приобретенных у Qkine – Cambridge UK).

Человеческие ИПСК CS09iHD-109n5 (здесь обозначаемые как iPSC_Q109) и CS14iCTR-21n3 (здесь обозначаемые как iPSC_Q21), приобретенные у Cedars-Sinai Biomanufacturing Center (Лос-Анджелес, Калифорния), хранились на предварительно покрытом 0.5% матригеле (CORNING, кат. 356231). ) пластинки со средой E8 собственного изготовления (по данным Chen et al., 2011).¹³⁸) или в mTeSR (StemCell Technologies, кат. 05850) при 37 °C, 5% O.², 5% CO². ИПСК человека диссоциировали в сгустки с помощью 0.5 мМ ЭДТА (Gibco, кат. AM99260G) и заменяли в разведении 1:6 каждые 3-4 дня с 10 мкМ ингибитора ROCK (Y27632-дигидрохлорид Axon Medchem, кат. 1683) в течение 24 часов. Среду меняли каждый день. Все клеточные линии были микоплазмонегативными.

Генотипирование iPSC_Q21 и iPSC_Q109

Геномную ДНК из iPSC_Q21 и iPSC_Q109 выделяли с использованием набора DNeasy Blood and Tissue (Qiagen, кат. 69504) в соответствии с инструкциями производителя и количественно определяли с помощью Nanodrop ND-1000. ПЦР проводили с использованием праймеров, перечисленных в дополнительной таблице. 1 и описано Mangiarini et al.²⁹, предназначенный для амплификации тракта PolyQ в экзоне 1 HTT. Для реакции объемом 25 мкл мы использовали 200 нг геномной ДНК, 0.25 мкл Taq Phusion High Fidelity (ThermoFisher, кат. F-530L), 2.5 мкл буфера GC 5x + MgCl.² (7.5 мМ), 2 мкл dNTP (10 мМ) и 1.25 мкл диметилсульфоксида (ДМСО, 100%). Через 3 минуты при 94°С мы выполнили 35 циклов: 94°С в течение 1 минуты, 63°С в течение 45 секунд, 72°С в течение 1 минуты, с последующей финальной элонгацией при 70°С в течение 7 минут. Гель-электрофорез проводили на 2.5% агарозном геле, загружая 20 мкл продуктов ПЦР с Purple Loading Dye 6x (NEB, кат. B7024S). В качестве контроля нагрузки использовали β-актин. Результаты были получены в цифровом виде с помощью VWR Imager CHEMI Premium.

Генерация линий ESC, экспрессирующих HTT.

Клетки Q15 и Q128 были получены путем трансфекции ДНК векторов, содержащих N-концевой ген хантингтина человека со 128 или 15 CAG-повторами соответственно (любезно предоставлено профессором Еленой Каттанео). Линеаризацию плазмидной ДНК проводили в течение ночи с помощью фермента рестрикции PvuI. Для трансфекции ДНК мы использовали Lipofectamine 2000 (Life Technologies, кат. 11668-019) и выполнили обратную трансфекцию. На одну лунку 6-луночного планшета использовали 6 мкл реагента для трансфекции, 2 мкг плазмидной ДНК и 300,000 2 клеток в 1 мл среды. Среду меняли после инкубации в течение ночи. Подбор антибиотика (пуромицин 24 мкг/мл) начинали через XNUMX часа после трансфекции.

Создание мышиных ЭСК, стабильно экспрессирующих интересующие гены

Стабильные трансгенные мышиные ЭСК, экспрессирующие кандидатов, были получены путем трансфекции клеток, экспрессирующих HTT, плазмидами транспозонов PB (1 мкг CAG-Mtf1, CAG-Kdm2b, CAG-Kdm5b и CAG-Fbxo34), приобретенными у VectorBuilder (VectorBuilder Inc, Чикаго, Иллинойс, США) с вектором экспрессии транспозазы PB pBase (1 мкг). Мы использовали Липофектамин 2000 и выполнили обратную трансфекцию, как описано для создания линий HD. Подбор антибиотика (гигромицин В, 150 мкг/мл; Invitrogen, кат. 10687010) начинали через 24 часа после трансфекции.

Дифференциация NPC

iPSC_Q21 и iPSC_Q109 были дифференцированы в NPC согласно Li et al., 2011.⁹² протокол. ИПСК при 80% слиянии диссоциировали в отдельные клетки с помощью Accutase (Gibco, кат. A1110-501) и высевали на чашки 45,000 XNUMX клеток/см.² в среде Е8 с 10 мкМ ингибитора ROCK. Через 1 день среду E8 заменяли индукционной средой N2B27, состоящей из Advanced DMEM/F12 (Gibco, кат. 12634-010): Neurobasal (Gibco, кат. 21103-049) (соотношение 1:1), BSA 50 мг/мл. (Gibco, кат. 15260-037), Глутамакс 1% (Gibco, кат. 35050-038), пенициллин/стрептомицин 1% (Gibco, кат. 15140122), добавка N2 1:200 (Gibco, кат. 17502-048) , Добавка B27 1:100 (Gibco, кат. 17504-044), дополненная малыми молекулами человеческого LIF 10 нг/мл (Qkine, кат. Qk036), SB431542 2 мкМ (Axon Medchem, кат. 1661), CHIR99021 3 мкМ ( Axon Medchem, кат. 1386), Соединение Е 0.1 мкМ (Sigma-Aldrich, кат. 209986-17-4). Индукционную среду N2B27 меняли каждый день в течение 7 дней. На 7-й день NPC были разделены в разведении 1:6 в поддерживающей среде N2B27, состоящей из Advanced DMEM/F12 (Gibco, кат. 12634-010): Neurobasal (Gibco, кат. 21103-049) (соотношение 1:1). , BSA 50 мг/мл (Gibco, кат. 15260-037), глутамакс 1% (Gibco, кат. 35050-038), пенициллин/стрептомицин 1% (Gibco, кат. 15140122), добавка N2 1:200 (Gibco, кат. 17502-048), добавка B27 1:100 (Gibco, кат. 17504-044), дополненная малыми молекулами человеческого LIF 10 нг/мл (Qkine, кат. Qk036), SB431542 2 мкМ (Axon Medchem, кат. 1661) ), CHIR99021 3 мкМ (Axon Medchem, кат. 1386), дополненный EGF 20 нг/мл (R&D, кат. 236-EG) и FGF2 20 нг/мл (Qkine, кат. Qk002, рекомбинантный FGF2 рыбки данио). NPC сохранялись в течение 6 пассажей. Данные о морфологии h-iPSC и NPC собирали в цифровом виде с помощью микроскопа Zeiss Axio Vert A1 FL-LED.

Генерация NPC, временно экспрессирующих интересующие гены

Для трансфекции ДНК 250,000 1110 NPC диссоциировали в отдельные клетки с помощью Accutase (Gibco, кат. A501-1) и трансфицировали конструкциями PB (2311 мкг) с использованием трансфекции FuGENE HD (Promega, кат. E12), следуя протоколу обратной трансфекции. . Для одной лунки 3.9-луночного планшета мы использовали 1 мкл реагента для трансфекции, 250,000 мкг плазмидной ДНК и 1 2 клеток в 27 мл поддерживающей среды N10B27632 с 1683 мкМ Y48 [ROCKi, ингибитор Rho-ассоциированной киназы (ROCK), Аксон Медчем кот. 30]. Среду меняли после инкубации в течение ночи. Через 24 часов после трансфекции клетки обрабатывали ротеноном XNUMX мкМ в течение XNUMX часов, а затем анализировали, как показано на фиг. 8f.

Анализ пролиферации

Мышиные ЭСК кондиционировали на один пассаж в среде KSR + 2iL в присутствии пуромицина 6 мкг/мл. Пролиферацию ЭСК оценивали путем посева 15,000 24 клеток в 7,500-луночный планшет (XNUMX клеток/смXNUMX).²) в среде KSR + 2iL в присутствии пуромицина 6 мкг/мл. Клетки диссоциировали 0.25% трипсином (Life Technologies) и подсчитывали каждые 24 часа в течение 4 дней.

Пролиферацию ИПСК измеряли путем посева 40,000 0.5 одиночных клеток на предварительно покрытые 356231% Matrigel (CORNING, кат. 12) 11,428-луночные планшеты (XNUMX XNUMX клеток/смXNUMX).²) в среде E8 с 10 мкМ ингибитора ROCK (Y27632-дигидрохлорид, Axon Medchem, кат. 1683) в течение 24 часов. Среду меняли каждый день. Клетки диссоциировали с помощью Accutase (GE Healthcare, кат. L11-007) и подсчитывали каждые 24 часа в течение 4 дней.

Пролиферацию NPC измеряли путем посева 100,000 0.5 клеток на предварительно покрытые 356231% Matrigel (CORNING, кат. 12) 28,571-луночные планшеты (XNUMX XNUMX клеток/смXNUMX).²) в поддерживающей среде N2B27 с 10 мкМ ингибитора ROCK (Y27632-дигидрохлорид Axon Medchem, кат. 1683) в течение 24 часов. Клетки диссоциировали с помощью Accutase (GE Healthcare, кат. L11-007) и подсчитывали каждые 24 часа в течение 4 дней.

Лечение стрессоров и окрашивание кристаллическим фиолетовым (CV)

Для экспериментов на рис. 2b5,000 мышиных ЭСК помещали в 24-луночный планшет (2,500 клеток/смXNUMX).²) в среде KSR + 2iL в присутствии ингибиторов (и пуромицина 6 мкг/мл) в течение 48 часов и подсчитывали путем количественного определения количества выживших клеток с помощью окрашивания CV [раствор CV: 0.05% мас./об. Crystal Violet (Sigma) , 1% раствора формальдегида 37% (Sigma), 1% метанола, 10% PBS] и количественную оценку средней интенсивности проводили с помощью программного обеспечения Fiji (v2.0.0).

Для PB-мутагенеза с последующей обработкой стрессорами клетки высевали с плотностью 2,500 клеток/см.² в пуромицине 6 мкг/мл и отбирали в течение 5 дней в присутствии MG132 (Sigma-Aldrich, кат. C2211) или тамоксифена (Sigma-Aldrich, кат. T2859).

Для экспериментов на рис. 4g5,000 клеток высевали в 24-луночный планшет в среду KSR + 2iL с пуромицином 3 мкг/мл. Стрессоры (MG132 12.5 нМ или тамоксифен 13.4 мкМ) добавляли через 12 часов. Подсчет выживших клеток проводили, как описано выше.

Для экспериментов на дополнительном рис. 4d2,500 клеток высевали в 48-луночный планшет в среде KSR + 2iL. Стрессоры [ротенон (Sigma-Aldrich, кат. R8875), кумол (Sigma-Aldrich, кат. 247502), 5-азацитидин (Sigma-Aldrich, кат. A1287), MG132 (Sigma-Aldrich, кат. C2211), бафиломицин ( Sigma-Aldrich, кат. B1793), стауроспорин (Sigma-Aldrich, кат. S6942), тамоксифен (Sigma-Aldrich, кат. T2859)] добавляли через 12 часов в указанных концентрациях. Через 48 часов выжившие клетки окрашивали раствором CV, подсчет выживших клеток проводили, как описано выше.

Электропорация системы PB в ЭСК

Для полногеномного скрининга был проведен PB-опосредованный мутагенез путем электропорации. Векторы PB стабильно интегрируются в геном после случайной вставки в сайты TTAA. Используемый вектор PB pGG134 (показан на фиг. 2a) был оптимизирован для экранов с расширенными функциями.⁵⁴: он состоит из энхансера/промотора MSCV, за которым следует донорный сайт сплайсинга из экзона 1 Фоксф2 ген, который позволяет сверхактивировать близлежащие гены. PB 5'-ITR также обладает слабой направленной промоторной активностью, т.е. эта конструкция может активировать гены в любой ориентации. Вектор также содержит вторую кассету, включающую конститутивный промотор, за которым следуют гены устойчивости DsRed и гигромицину, которую использовали для идентификации клеток со стабильной интеграцией вектора.

Мы оптимизировали условия, чтобы добиться низкого количества событий интеграции, регулируя соотношение вектора PB и транспозазы pBase. Для процедуры скрининга мутагенез проводили с использованием оптимизированного количества 0.5 мкг pGG134 и 20 мкг pBase.

Для одной электропорации 10⁷ клетки и 20.5 мкг ДНК смешивали и помещали в кювету для электропорации (Biorad Gene Pulser Cuvette, кат. 165-2088). Клетки подвергали электропорации, помещая кювету в держатель для электропорации Biorad GenePulser (кат. 165-2076). Используемые настройки: 250 В, 500 мкФ, постоянная времени должна быть между 5.6 и 7.5. Электропорированные клетки осторожно извлекали из кювет и высевали на чашки. Подбор антибиотиков начинали через 24 часа после электропорации.

Экстракция геномной ДНК и Splinkerette-PCR

Клетки собирали и инкубировали в течение ночи при 56°C с лизирующим буфером [10 мМ Трис-HCl, pH 7.5; 10 мМ ЭДТА; 10 мМ NaCl; 0.5% мас./об. саркозила с добавлением протеиназы К (Sigma, кат. P2308) до конечной концентрации 1 мг/мл]. Для получения осадка ДНК на следующий день добавляли 2 мл смеси NaCl и этанола (30 мкл 5 М NaCl, смешанного с 20 мл холодного абсолютного этанола). Клеточные экстракты центрифугировали в течение 45 минут при 4°С для удаления растворимой фракции. Осажденную гДНК трижды промывали по каплям 2 мл 70% этанола и, наконец, ресуспендировали в воде milliQ при 70°C.

Процедура Splinkerette-PCR для картирования PB-интеграции была адаптирована у Поттера и Луо. ¹³⁹ и состоял из следующих этапов: а) 2 мкг геномной ДНК расщепляли 10 ед. BstYI (10,000 30 ед/мл, NEB) в объеме 60 мкл. Реакционную смесь инкубировали при 80°С в течение ночи, на следующий день фермент инактивировали при 20°С в течение 150 минут. Адаптеры для Splinkerette-PCR были созданы путем отжига XNUMX пмоль праймеров AdaptA и B (дополнительная таблица 1) в конечном объеме 100 мкл (10x NEB Buffer 2). Олигонуклеотиды денатурировали при 65°С в течение 5 мин, затем охлаждали; б) Лигирование проводили в общем объеме 6 мкл, включая смесь для 2х лигирования (Takara), 2.5 мкл расщепленной гДНК и 0.5 мкл отожженных адаптеров для Splinkerette-PCR. Реакцию лигирования инкубировали при 16°С в течение ночи, на следующий день при 65°С в течение 10 минут для инактивации фермента. Перед этапом C был включен этап очистки с использованием набора QIaquick PCR Purification Kit в соответствии с инструкциями производителя. Для ПЦР-амплификации мы использовали Phusion HF DNA Pol (NEB) в 5-кратном буфере Phusion GC, рекомендованном в случае матриц, богатых GC, или матриц с вторичными структурами. Смесь для ПЦР включала 5x буфера GC, 10 мМ dNTP, ДМСО и Phusion Pol; в) Первый раунд ПЦР амплифицировали с использованием 15 мкл лигированной ДНК (или 50% продукта лигирования для каждой реакции для соединений транспозон/хозяин PB5' и PB3'), 0.5 мкМ для каждого праймера (Adaptor-PCR1 и PB5' или PB3'). -ITR PCR1), 6.5 мкл ПЦР-смесь, конечный объем 25 мкл. Программа Splinkerette-PCR1: 95 °C в течение 2 минут; два цикла: 95°С по 20 секунд, 65°С по 30 секунд, 68°С по 2 минуты; затем 30 циклов: 95°С в течение 30 секунд, 60°С в течение 30 секунд, 68°С в течение 2 минут; затем 68°С в течение 10 минут; г) Для второго раунда ПЦР мы использовали 5 мкл продукта ПЦР1 в разведении 500:1, 0.5 мкМ для каждого праймера (Adapter-PCR2 и PB5' или PB3'-ITR PCR2), 6.5 мкл ПЦР-смесь, конечный объем 25 мкл. . Программа Splinkerette-PCR2: 95 °C в течение 2 минут; два цикла: 95°С по 20 секунд, 65°С по 30 секунд, 68°С по 2 минуты; затем 5 циклов 95°С по 30 секунд, 60°С по 30 секунд, 68°С по 2 минуты; затем 25 циклов 95°С в течение 30 секунд, 58°С в течение 30 секунд, 68°С в течение 2 минут; затем 68°С в течение 10 минут; д) Продукты ПЦР2 обрабатывали антарктической фосфатазой и экзонуклеазой I (обе от NEB) и секвенировали с использованием праймеров PB5'- или PB3'-ITR PCR2. Праймеры и последовательности адаптеров перечислены в дополнительной таблице. 1.

Анализ секвенирования следующего поколения сайтов геномной интеграции

Геномную ДНК из целых популяций мутантов экстрагировали с использованием набора Gentra Puregene Cell Kit. Подготовку библиотеки и секвенирование проводили, как описано ранее.¹⁴⁰. Специально разработанный конвейер биоинформатики позволил сопоставить каждое отдельное чтение с геномным локусом и связать каждый сайт интеграции с геном в пределах 20 КБ. Затем данные были организованы в сеть взаимодействующих генов БГ с помощью программного обеспечения Cytoscape (v3.8.2).¹⁴¹.

Окрашивание йодидом пропидия (PI)

Окрашивание PI проводили на живых одиночных мышиных ЭСК в соответствии с инструкциями производителя (Ebioscience, кат. 88-8007-72). После промывки в PBS, 10⁵ живые клетки ресуспендировали в 200 мкл 1x связывающего буфера и добавляли 5 мкл раствора для окрашивания PI (кат. 00-6990). Анализ проточной цитометрии проводился с использованием BD FACSCanto.^TM II цитометра в течение 1 часа, хранение проб при температуре 2-8°С в темноте. Данные были проанализированы с помощью BD FACSDiva.^TM (v. 9.0) и программное обеспечение FlowJo (10.8.1). Репрезентативная стратегия стробирования доступна на дополнительном рис. 10a.

Анализ измерения ROS

Выработку АФК выявляли путем окрашивания одиночных ЭСК живых мышей и клеток НПК человека диацетатом 2',7'-дихлордигидрофлуоресцеина (H₂DCFDA; Технологии жизни, кат. D399), выполняя следующие этапы: а) индикатор АФК был свежеразведен для получения концентрированного маточного раствора (10 мМ); б) 3-5×10⁵ клетки собирали, в) промывали один раз 500 мкл PBS и г) ресуспендировали в 300 мкл PBS, содержащем зонд, для обеспечения конечной рабочей концентрации 0.5 мкМ красителя; д) клетки инкубировали при 37°С в течение 10 минут в темноте; е) после удаления красящего раствора образцы ж) дважды промывали в PBS. Образцы собирали методом проточной цитометрии с использованием BD FACSCanto.^TM Цитометр II или сортировщик клеток BIO-RAD S3e, анализ проводился с помощью BD FACSDiva.^TM (версия 9.0), ПроСорт^TM (v. 1.6) и программное обеспечение FlowJo (10.8.1). Репрезентативная стратегия стробирования доступна на дополнительном рис. 10б-в.

Окрашивание аннексином V

Живые NPC, временно трансфицированные представляющим интерес геном и обработанные 30 мкМ ротенона в течение 24 часов, окрашивались аннексином V в соответствии с инструкциями производителя (Ebioscience, кат. 88-8007-72). Клетки промывали один раз в PBS, затем один раз в 1x связывающем буфере (кат. 00-0055). 5×10⁵ клетки ресуспендировали в 200 мкл 1x связывающего буфера и инкубировали с 5 мкл конъюгированного с флуорохромом аннексина V (кат. 17-8007) в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем клетки промывали 500 мкл 1x связывающего буфера. Наконец, клетки ресуспендировали в 200 мкл 1x связывающего буфера. Анализ проточной цитометрии проводился с использованием сортировщика клеток BIO-RAD S3e в течение 1 часа, образцы хранились при температуре 2–8 °C в темноте. Данные были проанализированы с помощью ProSort.^TM (v. 1.6) и программное обеспечение FlowJo (10.8.1). Репрезентативная стратегия стробирования доступна на дополнительном рис. 10c.

Вестерн-блоттинг

Клетки промывали холодным PBS и собирали в лизирующем буфере (50 мМ Hepes, pH 7.8, 200 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, 1% NP40, 5% глицерина), в который недавно добавляли 1 мМ DTT, ингибитор протеазы (Roche, кат. 39802300). ) и ингибитор фосфатазы (Sigma-Aldrich, кат. P5726). Образцы подвергали воздействию ультразвука в ультразвуковом аппарате (Diagenode Bioruptor) и центрифугировали при 15,871 ОЦФ в течение 10 минут для приготовления супернатанта. Концентрацию белка определяли количественным методом Брэдфорда. Для экспериментов на рис. 1b, 2g, 4d и дополнительный рис. 1dОбщий белок (10 мкг) фракционировали на 4-12% акриламидном геле Nupage MOPS (Life Technologies, кат. BG04125BOX/BG00105BOX) и электрофоретически переносили на мембрану из ПВДФ (Millipore, кат. IPFL00010) в растворе для переноса (50 мМ Трис). -HCl, 40 мМ глицин, 20% метанол, 0.04% ДСН). Затем мембраны насыщали 5%-ным обезжиренным сухим молоком (BioRad; 170-6405-MSDS) в TBST (8 г NaCl, 2.4 г трис-HCl, 0.1% Tween20/литр, pH 7.5) в течение 1 часа при комнатной температуре. и инкубировали в течение ночи при 4 °C с первичным антителом против HTT (клон 1HU-4C8) или против GAPDH (клон 6C5) (дополнительная таблица). 2). Затем мембраны инкубировали со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой, разведенными в 1% молоке в TBST. Хемилюминесцентный реагент Pico SuperSignal West (Thermo Scientific, кат. 34078) использовали для инкубации мембран, а изображения получали в цифровом виде с помощью ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare). Необрезанные гели и числовые значения представлены в файле исходных данных.

Мышей умерщвляли путем смещения шейных позвонков, а ткани гомогенизировали в буфере для лизиса, содержащем 20 мМ Трис-HCl, pH 7.4, 1% Нонидет P-40, 1 мМ ЭДТА, 20 мМ NaF, 2 мМ Na.₃VO₄ и смесь ингибиторов протеазы 1:1000 (Sigma-Aldrich) и обрабатывали ультразвуком. Для эксперимента на дополнительном рис. 1b50 мкг общего белкового лизата мышей дикого типа, мышей R6/2, клеток Q15 и клеток Q128 загружали в 5-11% акриламидный штабелирующий гель и инкубировали со следующими антителами: анти-HTT (клон EM48) и анти-HTT (клон EMXNUMX). -GAPDH (дополнительная таблица 2). Для экспериментов на дополнительном рис. 8а, г, д и ж40 мкг общего белкового лизата подвергали иммуноблоттингу со следующими антителами: анти-GFP, анти-ACTIN (клон 8H10D10), анти-HTT (клон EM48), анти-ТУБУЛИН (клон B-5-1-2) (дополнительная таблица 2). Мембраны обрабатывали, как описано выше. Изображения были получены в цифровом виде с помощью VWR Imager CHEMI Premium или ChemiDoc XRS+ (номер модели: Universal Hood II) с использованием программного обеспечения Image Lab, BioRad (версия 6.1). Количественную оценку проводили с использованием Fiji 2.9.0 с вычитанием фона и нормализацией по контролю нагрузки (GAPDH, ACTIN или TUBULIN). Необрезанные гели представлены в файлах исходных данных.

иммунофлюоресценция

Иммунофлуоресценцию для обнаружения MTF1 в ЭСК мыши проводили на клетках, высеянных на покровные стекла, покрытые фибронектином (Merck, кат. FC010). Клетки фиксировали в 4% формальдегиде (Sigma-Aldrich, кат. F8775) в PBS в течение 10 минут при комнатной температуре, промывали в PBS, пермеабилизировали в течение 10 минут в PBS + 0.1% Triton X-100 (PBST) при комнатной температуре и блокировали. в PBST + 3% лошадиной сыворотки (HS; Gibco, кат. 16050-122) в течение 45 минут при комнатной температуре. Клетки инкубировали в течение ночи при 4 °C с первичными антителами (подробную информацию о первичных и вторичных антителах см. в дополнительной таблице). 2) в ПБСТ + 3% ГС. После промывки PBST клетки инкубировали со вторичными антителами (Alexa, Life Technologies) в течение 45 минут при комнатной температуре. Ядра окрашивали DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол; Sigma-Aldrich, кат. F6057). Изображения были получены с помощью конфокальных микроскопов Leica SP5. Анализ изображений проводился с использованием Fiji 2.9.0. Количественную оценку ядерной и цитоплазматической интенсивности проводили с помощью программного обеспечения CellProfiler (v4.1.3). Вкратце, ядра обнаруживали с помощью окрашивания DAPI. Цитоплазма условно определялась радиально расширяющимися ядрами на 10 пикселей. Рассчитывали и строили график отношения интегральной ядерной интенсивности сигнала MTF1 к клеточной интегральной интенсивности сигнала MTF1 (ядро + цитоплазма).

Иммунофлуоресцентный анализ ИПСК и НПК человека проводили на покровных стеклах, покрытых 1% матригелем, в лунках. Клетки фиксировали в 4% формальдегиде (Sigma-Aldrich, кат. F8775) в PBS в течение 10 минут при комнатной температуре, промывали PBS, пермеабилизировали в течение 1 часа в PBST при комнатной температуре и блокировали в PBST + 5% HS (Gibco, кат. 16050-122) в течение 5 часов при комнатной температуре. Клетки инкубировали в течение ночи при 4 °C с первичными антителами (подробную информацию о первичных и вторичных антителах см. в дополнительной таблице). 2) в ПБСТ + 3% ГС. После промывки PBS клетки инкубировали со вторичными антителами (Alexa, Life Technologies) в течение 45 минут при комнатной температуре. Ядра окрашивали DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол; Sigma-Aldrich, кат. F6057). Изображения были получены с помощью конфокального микроскопа Zeiss LSM900 Airyscan 2. Анализ изображений проводился с использованием Fiji 2.9.0.

Выделение РНК, обратная транскрипция и количественная ПЦР

Для клеточного лизата РНК выделяли с использованием набора Total RNA Purification Kit (Norgen Biotek, кат. 37500), а комплементарную ДНК (кДНК) получали из 500 нг с использованием обратной транскриптазы M-MLV (Invitrogen, кат. 28025-013), RNaseOUT (40). ед./мкл), случайные праймеры (200 нМ), dNTP (10 мМ), буфер первой цепи 5x, DTT (0.1 М). Для личинок рыбок данио тотальную РНК выделяли с помощью фенол-хлороформной экстракции. Тотальную РНК выделяли из пулов из 10 животных с использованием реагента TRIzol (Life Technologies, кат. 15596026), следуя инструкциям производителя по стандартной процедуре экстракции тризол-хлороформ-этанол. Гликоген, не содержащий РНКазы, использовали, как предложено протоколом, для увеличения выхода на этапе осаждения РНК. 2 мкг тотальной РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК с использованием обратной транскриптазы Superscript III (Invitrogen, кат. 18080044) и смеси праймеров олиго(dT)18 (500 мкг/мл); смесь дНТФ (10 мМ); ДТТ (0.1 М); 5x буфер первой цепи; РНКазаOUT (40 ед./мкл).

Для ПЦР в реальном времени использовали смесь SYBR Green Master (Bioline, кат. BIO-94020). Праймеры подробно описаны в дополнительной таблице. 3. Технические повторы выполняли для всех количественных ПЦР. Для мышиных ЭСК, ИПСК и НПК человека в качестве эндогенного контроля для нормализации экспрессии использовали Gapdh и GAPDH. Среднее значение Ct рыбок данио пробел, eef1a1l1, туба1б и b2m использовался в качестве эндогенного контроля для нормализации из-за вариабельности, выявленной при изучении уровней экспрессии этих генов. Данные qPCR были получены с помощью QuantStudio™ 6&7 Flex Software версий 1.0 и 1.3.

Секвенирование РНК: подготовка библиотеки

Суммарную РНК определяли количественно с использованием флуориметрического анализа Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Библиотеки были приготовлены из 125 нг тотальной РНК с использованием службы секвенирования исследовательского уровня NEGEDIA Digital mRNA-seq (Negedia srl).¹⁴⁰ который включал подготовку библиотеки, оценку качества и секвенирование на системе секвенирования NovaSeq 6000 с использованием одноконцевой стратегии 100 циклов (Illumina Inc.).

Рабочий процесс биоинформатики

Необработанные данные были проанализированы с помощью запатентованного Next Generation Diagnostics srl конвейера NEGEDIA Digital mRNA-seq, который включает в себя этап очистки путем качественной фильтрации и обрезки, выравнивания по эталонному геному и подсчета по генам.^142,143. Гены были отсортированы, удалив те, общее количество которых было ниже 5, по крайней мере, в 3 образцах из 30. После применения этого фильтра мы идентифицировали 11,851 XNUMX экспрессируемый ген, которые были рассмотрены для дальнейшего анализа.

Анализ дифференциальной экспрессии проводили в среде R (версия 4.1.0) с помощью Bioconductor (версия 3.14) с использованием пакета DESeq2 R. (версия 1.34.0)¹⁴⁴ и EdgeR (версия 3.36.0)¹⁴⁵. DESeq2 выполняет оценку размерных факторов, оценку дисперсии для каждого гена и соответствует отрицательной биномиальной обобщенной линейной модели с двусторонней статистикой Вальда. Биологическое значение ДЭГ между Q128 и Q15 (рис. 1g), DEG между Q128_Mtf1 и Q128 (дополнительный рис. 5b) и генов, спасенных Мтф1 (Инжир. 5c) был исследован с помощью анализа обогащения терминов Gene Ontology (GO) с использованием программного обеспечения Enrichr (версия 3.0), включая категории биологических процессов (BP) (2021 г.) и молекулярных функций (MF) (2021 г.).

Для обогащения пролиферации клеточной популяции (GO:0008283 и¹⁴⁶) и сигнатуры генов апоптоза (R-HSA-109581 и WP1351) в клеточных линиях Q128 и Q15, сверхэкспрессирующих Мтф1мы использовали программное обеспечение Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) (версия 4.3.2).¹⁴⁷. Предварительно ранжированные списки наборов генов были созданы на основе журнала₂ значения кратного изменения (FC), полученные с помощью анализа дифференциальной экспрессии между Q128_Mtf1 по сравнению с Q128 и Q15_Mtf1 по сравнению с Q15.

Анализ обогащения мотивов проводился с использованием инструмента Motif Analysis из пакета Regulatory Genomics Toolbox (https://reg-gen.readthedocs.io). Mtf1 MRE получен из базы данных Jaspar (9-я версия, http://jaspar.genereg.net/)¹⁴⁸. Команда «сопоставление rgt-мотифанализа» использовалась для поиска сайтов связывания в промоторной области всех представляющих интерес генов; затем «обогащение rgt-мотифанализа» использовалось для проведения точного теста Фишера, чтобы оценить, является ли доля сайтов связывания в интересующем наборе генов выше, чем ожидалось случайно.

Один репрезентативный биологический повтор данных секвенирования РНК и Mtf1 MRE визуализировали в виде треков в интегрированной программе просмотра геномики (IGV v. 2.16.0) и показали на рис. 5h.

Графики вулканов и диаграммы рассеяния были построены с использованием каротажа.₂ FC и -log₁₀ p-value, использующее функцию ggscatter из пакета ggpubr R (версия 0.4.0.5). Тепловые карты были созданы с использованием значений CPM с помощью функции pheatmap из пакета pheatmap R (версия 1.0.12).

Выравнивание ортологов Mtf1

Ассоциация Мтф1 выравнивание последовательностей проводили с использованием программного обеспечения Clustal Omega (v1.2.4, https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)¹⁴⁹. Идентичность последовательностей рассчитывали с помощью программы Sequence Manipulation Suite (https://www.bioinformatics.org/sms2/ident_sim.html).

Анализ металлов

После 48-часовой кондиционирующей процедуры 10⁷ Клетки Q15 и Q128 собирали, центрифугировали в пробирках Эппендорфа, супернатант удаляли и клеточные осадки хранили при -80°С. Непосредственно перед анализом клетки размораживали и ресуспендировали в концентрированной HNO.₃ (68%), к каждому образцу добавляли по 1 мл. После полного растворения мы добавили 2 мл сверхчистой воды и полностью минерализовали образец с помощью микроволнового нагрева с использованием высокоэффективного микроволнового реактора высокого давления (Ultrawave, Milestone, Бергамо, Италия). Ту же самую процедуру применяли к культуральной среде до и после обработки кондиционированием. Калибровочные кривые для количественного определения металлов были получены путем приготовления шести стандартных растворов различной концентрации (0.005-0.010-0.025-0.050-0.100-0.200 ppm) с использованием сертифицированных многоэлементных и одноэлементных стандартов (Agilent). Затем все образцы фильтровали через шприцевой фильтр с размером пор 0.20 мкм. Анализ металлов с атомизацией и ионизацией образцов, полученных в аргоновой плазме, проводился методом индуктивно-связанной плазмы – оптико-эмиссионной спектрометрии (ICP-OES, mod 5110, Agilent).

Создание HD-модели Zebrafish

Рыбки данио HD были созданы путем микроинъекции в одноклеточные эмбрионы мРНК, кодирующей первый экзон человека. HTT включая 74Q или 16Q, слитые в кадре с кодирующей последовательностью eGFP. Q74eGFP и Q16eGFP клонировали в плазмиду pCS2+, чтобы обеспечить транскрипцию in vitro. Плазмиды pCS2_Mtf1 и pCS2_mCherry также были созданы для получения Мтф1 и мЧерри мРНК, используемые для инъекций эмбрионам рыбок данио HD.

Для транскрипции РНК in vitro 2.5 мкг pCS2_Q74eGFP, pCS2_Q16eGFP, pCS2_Mtf1 и pCS2_mCherry линеаризовали путем расщепления в течение ночи при 37 °C с помощью HF-Not I (New England Biolabs, кат. R3189S). Затем переваренный объем концентрировали с помощью набора DNA Clean & Concentrator (Zymo Research, кат. D4003) и использовали для реакции кэпированной транскрипции (mMESSAGE mMACHINETM SP6 Transcription Kit, Thermo Fisher Scientific, кат. AM1340) с помощью РНК-полимеразы SP6. После удаления матрицы ДНК путем обработки ДНКазой (Thermo Fisher Scientific, кат. AM2238) в течение 15 минут при 37°C РНК очищали экстракцией фенолом-хлороформом (как обсуждалось в разделе «Выделение РНК, обратная транскрипция и количественная ПЦР»). РНК определяли количественно с помощью Nanodrop ND-1000, а затем разбавляли по мере необходимости в смеси 10% буфера Даньо [8 мМ NaCl, 0.7 мМ KCl, 0.4 мМ MgSO₄, 0.6 мМ Ca(NO₃)₂, 2.5 мМ HEPES, pH 7.6], 10% фенолового красного (Merck, кат. 1072410025) и вода, не содержащая РНКазы.

Чтобы выбрать дозу инъекции, вызывающую наибольшую частоту пороков развития с наименьшим уровнем смертности, мы вводили возрастающие дозы мРНК Q74eGFP в диапазоне от 150 до 1000 пг/эмбрион и фенотипически оценивали 24 эмбриона после оплодотворения. После установления дозы 250 пг/эмбрион под световым микроскопом эмбрионам инъецировали транскрибируемые in vitro мРНК. Затем микроинъецированные эмбрионы переносили в рыбную воду и инкубировали при 28°C. Неоплодотворенные яйца распознавали и выбрасывали через 4 часа после микроинъекции. Головастиков в возрасте 24 часов после оплодотворения дехорионировали с помощью специальных игл под световым микроскопом.

Окрашивание по всей длине

Инъецированные эмбрионы анестезировали трикаином, иммобилизовали в 1.5% метилцеллюлозе или 2% легкоплавкой агарозе и анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Leica M165FC. Конфокальные изображения рыбок данио были получены с помощью конфокального микроскопа Nikon C2 H600L.

Для окрашивания гемисолью акридинового оранжевого (хлорид цинка) in vivo (Merck, кат. A6014) эмбрионы в течение 24 часов после оплодотворения дехорионировали, переносили в 6-луночный планшет и инкубировали примерно в 2 мл акридинового оранжевого (20 мкг/мл) на лунку. в воде для рыб в течение 15 минут при температуре 28 °C. Затем раствор акридина удаляли и эмбрионы трижды промывали 1 мл рыбной воды. Перед наблюдением на предметном стекле с помощью флуоресцентного микроскопа головастиков анестезировали трикаином.

Для анализа TUNEL использовали набор ApopTag Fluorescein In Situ для обнаружения апоптоза (Merck, кат. S7110) и коллагеназу (Merck, кат. C9891). 7 эмбрионов через 30 часов после микроинъекции на каждое состояние помещали в камеру Eppendorf, анестезировали трикаином и фиксировали в 4% параформальдегиде (PFA) при 4°C на ночь. Затем PFA удаляли и образцы промывали PBS (3 раза по 10 минут каждый) при встряхивании. Эмбрионы обезвоживали с помощью серии растворов метанола с концентрацией от 10% до 100% и замораживали при -20°C на ночь. Затем эмбрионы регидратировали серией 70-50-30%-ных растворов метанола и промывали PBS с Твин-20 в течение 10 минут при встряхивании. После этого коллагеназу наносили на 8 минут при встряхивании и избыток смывали PBS с этапами промывания Твин-20 (3 раза по 5 минут каждый). Образцы инкубировали в течение 1 часа в уравновешивающем буфере при встряхивании, затем в течение 2 часов при 37°С при рабочей силе TdT. Реакцию останавливали двукратной промывкой образцов в буфере Stop/Wash рабочей силы. Затем проводили этап блокирования в течение 1 часа с помощью PBS с Твин-20 при встряхивании, а затем эмбрионы инкубировали в течение ночи в растворе конъюгата анти-дигоксигенина рабочей силы при 4°C в темноте. На следующее утро раствор антител удаляли, образцы промывали PBS (4 раза по 10 минут) и анализировали с помощью конфокального микроскопа. Передние структуры личинок рыбок данио сканировались в 70 стопках по 3.475 мкм каждая, охватывающих всю их глубину. Мы количественно оценили доли флуоресцентной положительной области по всей площади (исключая область желтка). Для количественного анализа все изображения были получены с одинаковыми параметрами экспозиции и обработаны с использованием программного обеспечения Fiji (v2.9.0). Статистический анализ проводился с помощью Past (v.4.03) и Prism (v.9.5.0).

Инъекция вектора AAV-PHP.eB, фенотипирование мышей и сбор тканей

Вирусные частицы AAV-PHP.eB были получены и титрованы в лаборатории Брокколи, как описано ранее.⁷⁵. Этот вирусный вектор был модифицирован для экспрессии под контролем промотора Ef-1ɑ гена-кандидата. Мтф1 или либо eGFP в качестве контроля. Сосудистую инъекцию осуществляли в ограничителе, который помещал хвост в нагретую канавку. Хвост протерли спиртом, а затем ввели внутривенно. Мышей WT и R6/2 рандомизировали на группы и им вводили инъекцию в хвостовую вену в возрасте 4.2 недели. После инъекции всех мышей взвешивали дважды в неделю. Фенотипирование проводили без учета генотипа и лечения два раза в неделю. Баланс и координацию движений оценивали с помощью теста «Вращающийся стержень» и задания «Горизонтальная лестница». Тотальную ДНК выделяли из тканей животных (коры и полосатого тела) с использованием наборов Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kits (QIAGEN, кат. 9504).

Животноводство

Все эксперименты с рыбками данио проводились на рыбном комплексе факультета биологии Университета Падуи. Личинки рыбок данио выдерживались не более трех дней в чашках Петри с рыбной водой (60 мг Instant Ocean, кат. SS15-10, на литр дистиллированной воды) при нейтральном pH при 28 °C в соответствии со стандартными процедурами (http://ZFIN.org).

Мышиные колонии были созданы в IRCCS Neuromed. Разведение пар трансгенных самок мышей линии R6/2 [название линии: B6CBA-tgN (HDexon1) 62Gpb/1 J] с ~160 ± 10 расширений CAG-повторов были приобретены в лабораториях Джексона. Мышей содержали в стандартных условиях (22 ± 1 °C, относительная влажность 60%, 12-часовой режим света/темноты, 3–4 мыши на клетку, со свободным доступом к пище и воде). Самцов мышей R6/2 (возраст 5-6 недель) скрещивали с самками мышей B6CBA WT (возраст 5-6 недель) для поддержания колонии; Полученных мышей дикого типа и R6/2 использовали для всех экспериментов, проведенных в этом исследовании. Полный список мышей, использованных в этом исследовании, с указанием возраста, пола, лечения и измерений представлен в дополнительной таблице. 4. Все экспериментальные процедуры были одобрены этическим комитетом IRCCS Neuromed Animal Care Review Board и Istituto Superiore di Sanità (номер разрешения ISS: 548/2022-PR) и проводились в соответствии с директивой 2010/63/EU для экспериментов на животных.

Тесты на двигательное поведение

Все поведенческие тесты проводились во время световой фазы цикла свет/темнота. Мышей тестировали до и после лечения в указанные моменты времени. Перед обучением и тестированием мыши прошли период привыкания к испытательной комнате и оборудованию. Все мыши обучались в течение двух дней подряд с каждым инструментом и заданием, прежде чем проводить измерения двигательного поведения. Мышей тестировали при фиксированной скорости (0.1 ОЦФ) на вращающемся стержне в течение 1 минуты. Каждую мышь тестировали в трех последовательных испытаниях по 1 минуте каждое с 1-минутным отдыхом между испытаниями. Время, проведенное на вращающемся стержне в каждом из трех испытаний, усредняли, чтобы получить общее время для каждой мыши. В задании с горизонтальной лестницей мыши спонтанно шли по горизонтальной лестнице с переменным и нерегулярным расстоянием между ступенями. В каждом сеансе тестирования производительность мыши оценивалась с использованием установленной системы оценки количества шагов.¹⁵⁰, что позволяет качественно и количественно оценить расположение передних и задних конечностей на ступеньках лестницы. Все двигательные тесты проводились одним и тем же экспериментатором, который не знал генотипа мыши и экспериментальной группы на протяжении всего курса анализа.

Анализ зажима

Оценка фиксации определяется в течение 30 секунд. В частности, мышей подвешивали за хвосты на высоте 50 см, а реакцию сжимания конечностей определяли как притягивание любой конечности к туловищу более чем на 2 секунды. Использовались следующие баллы: 0 (отсутствие фиксации), 0.5 (отдергивание любой отдельной конечности), 1 (отдергивание любых двух конечностей), 1.5 (отдергивание любых трех конечностей), 2 (отдергивание всех четырех конечностей).

Дигидроэтидий (ДГЭ)

Мышей WT и R6/2 умерщвляли путем смещения шейных позвонков. Мозг удаляли и подвергали обрезке путем удаления обонятельных луковиц и спинного мозга. Оставшийся мозг обрабатывали и заливали в парафин, корональные срезы толщиной 10 мкм вырезали на микротоме RM 2245 (Leica Microsystems) и помещали в водяную баню с температурой 40 °C, содержащую дистиллированную воду. Срезы переносили на предметные стекла, подходящие для иммуногистохимии, и оставляли высыхать на ночь при комнатной температуре. Образцы депарафинировали в ксилоле в течение 30 минут, переносили в 100%-ный спирт на 10 минут, а затем один раз через 95%-ный, 70%-ный и 50%-ный спирты соответственно по 10 минут каждый, дважды промывали PBS. Образование супероксида in situ детектировали по флуоресценции с DHE (Sigma-Aldrich, кат. D7008). Образцы инкубировали с ДГЭ (2 мкМ) в светозащищенной увлажненной камере при 37 °С в течение 30 минут. Слайды дважды промывали PBS и наблюдали под микроскопом. Для каждого окрашивания использовали по четыре мыши на экспериментальную группу, и три корональных среза для каждого животного получали с помощью микроскопа Nikon ECLIPSE Ni и анализировали с помощью программного обеспечения NIS-Elements Image Software (v. 4.40, Nikon) и программного обеспечения Fiji 2.9.0.

mHTT агрегаты иммуноокрашивания

Мышей WT и R6/2 умерщвляли путем смещения шейных позвонков. Мозг удаляли и подвергали обрезке путем удаления обонятельных луковиц и спинного мозга. Оставшийся мозг обрабатывали и заливали в парафин, корональные срезы толщиной 10 мкм вырезали на микротоме RM 2245 (Leica Microsystems) и помещали в водяную баню с температурой 40 °C, содержащую дистиллированную воду. Срезы переносили на предметные стекла, подходящие для иммуногистохимии, и оставляли высыхать на ночь при комнатной температуре. Образцы депарафинировали в ксилоле в течение 30 минут, переносили в 100%-ный спирт на 10 минут, а затем один раз через 95%-ный, 70%-ный и 50%-ный спирты соответственно по 10 минут каждый, дважды промывали PBS. Чтобы демаскировать антигенный эпитоп, извлечение антигена проводили с использованием метода цитратного буфера (инкубировать с цитратным буфером 10 мМ, pH 6.0 при 95-100 ° C в течение 15 минут, затем дать предметным стеклам остыть в течение 15 минут). Слайды дважды промывали PBS, пермеабилизировали в TBS-Triton 0.1% в течение 10 минут, затем инкубировали во влажной камере при комнатной температуре с блокирующим буфером (лошадиная сыворотка 10% в PBS) в течение 1 часа. Блокирующий буфер удаляли и предметные стекла инкубировали во влажной камере при 4 °C в течение ночи с использованием мышиного антитела против HTT (клон EM48, подробности см. в дополнительной таблице). 2). После трехкратной промывки PBS клетки инкубировали со вторичными антителами в течение 1 ч во влажной камере при комнатной температуре, защищенной от света. Ядра окрашивали DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол; Sigma-Aldrich, кат. F6057). Использовали по четыре мыши на экспериментальную группу, и три корональных среза для каждого животного получали с помощью микроскопа Nikon ECLIPSE Ni и анализировали с помощью программного обеспечения NIS-Elements Image Software (v. 4.40, Nikon) и программного обеспечения Fiji 2.9.0.

Статистика и воспроизводимость

Никакой статистический метод не использовался для предварительного определения размера выборки, но размеры нашей выборки аналогичны тем, которые обычно используются в нашей области исследований. Никакие данные не были исключены из анализа. Распределение данных предполагалось нормальным, но формально это не проверялось. P-значения для экспериментов с повторными измерениями (рис. 1c, Инжир. 4f, Инжир. 7b (Слева) 7c (слева) и 7g, Инжир. 8д, еДополнительный рис. 1eДополнительный рис. 4а,вДополнительный рис. 8cДополнительный рис. 9c) были рассчитаны с помощью двустороннего дисперсионного анализа с повторными измерениями с поправкой Бонферрони. Для экспериментов с клеточными линиями мы случайным образом распределяли часть каждой популяции клеток по разным биологическим повторам. Для анализа данных иммуноокрашивания и проточной цитометрии мы анализировали случайные поля или случайные фракции клеток. Другие виды экспериментов не были рандомизированными. Сбор и анализ данных не проводились вслепую с учетом условий экспериментов, но анализ данных проводился с идентичными параметрами и программным обеспечением. Анализ двигательного поведения мышей проводили вслепую. Представление данных и статистический анализ выполнялись с использованием программного обеспечения R (версии 4.0.0 и 4.1.0) и PAST (версия 4.03), если не указано иное. Все столбцы, столбцы ошибок и коробчатые диаграммы определены в легендах к рисункам. В подписях к рисункам указано количество биологических повторов и независимых экспериментов, оба >2. Используемые статистические тесты указаны в подписях к рисункам. Все эксперименты по qPCR проводились с тремя техническими повторами. Ключевые экспериментальные результаты были получены двумя независимыми операторами.

Отчетная сводка

Дополнительная информация о дизайне исследований доступна в Резюме отчета по портфелю природы ссылка на эту статью

• SEO-контент и PR-распределение. Получите усиление сегодня.
• PlatoData.Network Вертикальный генеративный ИИ. Расширьте возможности себя. Доступ здесь.
• ПлатонАйСтрим. Интеллект Web3. Расширение знаний. Доступ здесь.
• ПлатонЭСГ. Автомобили / электромобили, Углерод, чистые технологии, Энергия, Окружающая среда, Солнечная, Управление отходами. Доступ здесь.
• Смещения блоков. Модернизация права собственности на экологические компенсации. Доступ здесь.
• Источник: https://www.nature.com/articles/s41467-023-39552-9